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Algumas perguntas sobre materiais para PCR

Algumas perguntas sobre materiais para PCR


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Estou planejando pedir oligo, polimerase, nucleotídeo, tampão para meu primeiro experimento de PCR diy (agora não tenho nada), então tenho algumas perguntas.

  1. Por quanto tempo posso armazená-los? Eu tenho apenas uma geladeira que pode congelar a -10 -> -20C.

  2. Vejo que o tamanho / concentração da polimerase é de 400 unidades e 25 nmole de oligo. Então, o que posso fazer com 25 nmol de oligo e 400 unidades de polimerase? Quantos experimentos de PCR posso fazer com 400 unidades de polimerase e quantos experimentos de PCR posso fazer com 25 nmoles de oligo?

  3. Se eu tiver uma máquina de HPLC, posso reutilizar a polimerase purificando-a após a reação?


Os fabricantes de cada componente devem ter informações disponíveis em seus sites sobre as temperaturas de armazenamento, juntamente com protocolos recomendados sobre quanto de cada componente deve ser adicionado à reação de PCR. Eu não tentaria reutilizar a polimerase, pois dependendo do tipo que você comprar, ela pode ser um complexo de proteínas e pode não funcionar após a purificação. No entanto, você pode experimentar tudo o que quiser, as coisas são suas!


  • 1: -20 é a condição normal de armazenamento para reagentes de PCR no laboratório, portanto, você deve estar bem. Um aviso: você deve se certificar de que o freezer NÃO está descongelando automaticamente. A maioria dos freezers de consumo fará um ciclo de temperatura para evitar o acúmulo de gelo. Isso é muito ruim para as enzimas e reduzirá muito sua vida útil. Se você não conseguir encontrar um freezer que não descongele, pode não ter problemas se tamponar a temperatura mantendo sua enzima em um refrigerador no freezer ou dentro de um bloco de metal com um porão perfurado nele.

  • 2: Você pode esticar seus reagentes diminuindo o volume de cada reação de PCR. 25uL é viável no laboratório, mas tenha em mente que quanto menor o volume, maior o erro relativo em suas medições se torna.

  • 3: Parece-me estranho que você tenha acesso a uma máquina de HPLC, mas não possa comprar uma nova enzima quando ela acabar. Eu realmente não tentaria reutilizar nada. Pode ser poderia funcionar, mas você realmente confiaria nos resultados? Se você fizer compras, poderá encontrar marcas mais baratas de polimerase.

Boa sorte!


Aprenda sobre Engenharia Genética por meio de algumas perguntas e respostas

A biotecnologia é a aplicação do conhecimento biológico para a obtenção de novas técnicas, materiais e compostos para uso farmacêutico, médico, agrícola, industrial e científico, ou seja, para uso prático.

Os primeiros campos da biotecnologia foram a agricultura e a indústria de alimentos. Hoje em dia, muitos outros campos práticos usam suas técnicas.

Definição de Engenharia Genética

Mais perguntas e respostas de tamanho reduzido abaixo

2. O que é engenharia genética?

A engenharia genética é o uso do conhecimento genético para manipular genes artificialmente. É um dos campos da biotecnologia.

3. No atual nível de avanço da biotecnologia, quais são as principais técnicas de engenharia genética?

As principais técnicas de engenharia genética utilizadas hoje são: tecnologia de DNA recombinante (também chamada de engenharia genética), na qual pedaços de genes de um organismo são inseridos no material genético de outro organismo para produzir organismos recombinantes tecnologia de transplante de núcleos, popularmente conhecida como “clonagem” , em que o núcleo de uma célula é enxertado em um óvulo enucleado da mesma espécie para criar uma cópia genética do indivíduo doador (do núcleo) e tecnologia de amplificação de DNA, ou PCR (reação em cadeia da polimerase), que permite produzir milhões de replicações dos fragmentos escolhidos de uma molécula de DNA.

A tecnologia de DNA recombinante é usada para criar organismos transgênicos, como bactérias mutantes produtoras de insulina. A tecnologia de transplante de núcleos está em seu desenvolvimento inicial, mas é a base, por exemplo, da criação da ovelha “Dolly”. O PCR tem inúmeras utilizações práticas, como em testes médicos para detectar microrganismos presentes no sangue e tecidos, impressões digitais de DNA e a obtenção de amostras de DNA para pesquisa.

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Enzimas de restrição e tecnologia recombinante e # xa0DNA

4. O que são enzimas de restrição? Como essas enzimas participam da tecnologia do DNA recombinante?

As enzimas de restrição, ou endonucleases de restrição, são enzimas especializadas no corte de fragmentos de DNA, cada qual com efeito em locais específicos da molécula de DNA. Enzimas de restrição são utilizadas na tecnologia do DNA recombinante para obter com precisão pedaços de moléculas de DNA, que posteriormente serão inseridos em outras moléculas de DNA cortadas pelas mesmas enzimas.

5. O que são DNA ligases? Como essas enzimas participam da tecnologia do DNA recombinante?

As DNA ligases são enzimas especializadas em ligar as cadeias complementares de DNA que formam a dupla hélice do DNA. Essas enzimas são usadas na tecnologia de DNA recombinante para inserir pedaços de DNA cortados por enzimas de restrição em outras moléculas de DNA que sofrem o efeito das mesmas endonucleases.

6. O que são plasmídeos?

Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA presentes no material genético de algumas bactérias. Eles podem conter os genes responsáveis ​​pela resistência bacteriana a alguns antibióticos, bem como os genes para a produção de proteínas que causam virulência (hostilidade patogênica). & # Xa0

7. Como a engenharia genética é usada para criar bactérias capazes de produzir insulina humana?

Na produção de insulina humana por bactérias, o gene da insulina humana é incorporado ao material genético desses microrganismos. As bactérias mutantes se multiplicam, formando linhagens de bactérias produtoras de insulina.

As bactérias contêm fitas circulares de DNA chamadas plasmídeos, que são minicromossomos que atuam como acessórios do DNA primário. Para criar bactérias mutantes capazes de produzir insulina, um plasmídeo é submetido ao efeito de enzimas de restrição (endonucleases de restrição) especializadas em cortar fragmentos de DNA. O plasmídeo uma vez circular é aberto pela enzima de restrição. A mesma enzima é usada para cortar uma molécula de DNA humano contendo o gene da insulina. O pedaço de DNA humano contendo o gene da insulina é então ligado ao plasmídeo em suas extremidades com a ajuda de DNA ligases. O plasmídeo recombinante contendo o gene da insulina humana é então inserido na bactéria.

Outro hormônio humano já produzido por bactérias recombinantes é o GH (somatotropina ou hormônio do crescimento).

A inserção de moléculas de DNA nas células de um indivíduo também é utilizada na terapia gênica, um tratamento promissor para doenças genéticas. Na terapia gênica, células de um organismo deficiente na produção de uma determinada proteína recebem (por meio de vetores, como vírus) pedaços de DNA contendo o gene da proteína e, a seguir, começam a sintetizar a proteína.

Clonagem Genética

8. O que é clonagem?

A clonagem é a produção de um organismo geneticamente idêntico a outro por meio da engenharia genética.

A base da clonagem é a tecnologia de transplante de núcleo. Um núcleo de uma célula é extraído, geralmente de uma célula embrionária (indiferenciada) e este núcleo é inserido em uma célula reprodutiva previamente enucleada (em geral uma célula-ovo), o ovo é então implantado no órgão onde ocorrerá o desenvolvimento embrionário. Se ocorrer o desenvolvimento embrionário, o novo organismo terá um conteúdo genético idêntico ao organismo do organismo & # xa0 cujo núcleo celular foi usado no transplante.

Reação em cadeia da polimerase

9. O que é PCR? Como funciona o PCR?

PCR, reação em cadeia da polimerase, é um método para sintetizar muitas cópias de regiões específicas de uma molécula de DNA conhecidas como regiões-alvo. Sua inventora, Kary Mullis, ganhou o Prêmio Nobel de Química em 1993.

Primeiro, o DNA a ser testado é aquecido para causar a ruptura da dupla hélice e a exposição das cadeias polinucleotídicas. Em seguida, são adicionadas pequenas sequências sintéticas de DNA conhecidas como primers e contendo sequências de nucleotídeos semelhantes às sequências das extremidades da região a ser estudada (por exemplo, uma região contendo um gene conhecido exclusivo de um determinado organismo). Os primers são emparelhados com o DNA original nas extremidades do gene a ser amplificado. Enzimas conhecidas como polimerases, que catalisam a replicação do DNA e o suprimento de nucleotídeos são adicionadas. Os primers são então concluídos e a região escolhida é replicada. Na presença de mais primers e mais nucleotídeos, milhões de cópias daquela região específica são geradas. (PCR é muito sensível, mesmo quando usa uma quantidade mínima de DNA).

Impressão digital de DNA

10. Qual princípio de biologia molecular é a base para a impressão digital de DNA?

A impressão digital do DNA, método de identificação de indivíduos por DNA, baseia-se no fato de que o DNA de cada indivíduo (exceto gêmeos idênticos e clones individuais) contém sequências de nucleotídeos exclusivas de cada indivíduo.

Embora indivíduos normais da mesma espécie tenham os mesmos genes em seus cromossomos, cada indivíduo possui alelos diferentes e mesmo nas porções inativas dos cromossomos (heterocromatina), existem diferenças nas sequências de nucleotídeos entre os indivíduos.

Perigos e ética da engenharia genética

11. Por que a tecnologia de DNA recombinante e a tecnologia de transplante de núcleo ainda são perigosas?

A tecnologia do DNA recombinante e a tecnologia de transplante de núcleos (clonagem) são extremamente perigosas, pois são capazes de modificar, em muito pouco tempo, o equilíbrio ecológico que a evolução levou milhões de anos para criar no planeta. Durante o processo evolutivo, sob o efeito lento e gradual de mutações, recombinações genéticas e seleção natural, espécies surgiram, foram modificadas e heranças genéticas foram formadas. Com a engenharia genética, no entanto, os humanos podem misturar e modificar genes, fazendo mudanças com consequências imprevisíveis a longo prazo, arriscando a criação de novas doenças em plantas ou animais, novos tipos de câncer e novos surtos de doenças. É um campo tão potencialmente perigoso quanto a manipulação da energia nuclear.

12. Qual é o principal problema moral com relação à clonagem de indivíduos humanos?

Além dos perigos biológicos, um problema moral muito sério envolve a tecnologia de transplante de núcleos em humanos: os direitos individuais de um ser humano são violados quando um homem ou mulher é feito como cópia de outro.

Já que é impossível perguntar primeiro se a pessoa a ser clonada quer ser uma cópia genética de outra pessoa ou não, é claro que o mais importante direito humano está sendo violado ao fazer um ser humano cópia de outro: o direito de liberdade individual. Este é um perigo para a democracia, cujo princípio mais básico é o respeito pela liberdade individual.

Agora que você terminou de estudar Engenharia Genética, estas são suas opções:


Proposta de pesquisa em biologia: diretrizes e exemplos


Este artigo lhe dará as diretrizes sobre como escrever uma boa proposta de pesquisa. Além disso, se você não tem ideias para escrever uma proposta de pesquisa na área de Biologia / Ciências da Vida, você encontrará muitas ideias neste artigo que você pode usar para escrever uma proposta de projeto de sua preferência.

Escrever uma boa proposta de pesquisa é parte integrante da vida de um acadêmico, estudante, cientista. Você pode precisar escrever propostas de pesquisa para aplicações de doutorado, para bolsas de estudo, para bolsas de pós-doutorado, bem como para obter bolsas e financiamento.

Diretrizes

Você pode ser muito inteligente e ter uma ideia excelente, mas para convencer outras pessoas sobre sua ideia, você precisa apresentá-la de maneira excelente. Em primeiro lugar, você precisa planejar todos os detalhes de sua ideia, para que possa prever o cronograma, os requisitos e, o mais importante, tudo o que você pode inferir de seus dados. Em segundo lugar, você precisa escrevê-lo de uma maneira que convença os pioneiros do seu campo de que sua ideia é excelente e deve definitivamente ser traduzida em pesquisa real.

Enquanto em alguns casos o formato e o limite de palavras das propostas são mencionados, em outros casos você deve escrever de acordo com seu próprio julgamento. O formato de uma proposta de pesquisa deve incluir os seguintes princípios básicos.

1. Título: o título deve ser preciso e despretensioso. Não escreva - 'Para desenvolver a cura do câncer' se realmente quiser verificar as propriedades metastáticas do composto X. Uma proposta é o lugar onde você não quer fazer um título interessante que não fala o suficiente sobre o projeto. Não escreva - 'Como os lisossomos comem?' se o seu projeto é sobre caminhos envolvidos na degradação dentro dos lisossomos. Seja científico. Não deixe o título muito longo de forma que seja difícil de entender.

2. Resumo / Resumo: Na maioria dos casos, a pessoa que está revisando sua proposta decidirá ler a proposta inteira apenas com base em seu resumo. Portanto, seu resumo deve ser sucinto e cativante ao mesmo tempo. O ideal é não exceder 250 palavras. Evite excesso de detalhes técnicos no resumo e enfatize mais a ideia e seu significado.

3. Significado: Escreva exatamente por que sua ideia é tão importante. Quais são as razões pelas quais essa pesquisa deve ser definitivamente realizada. Qual será o benefício da pesquisa?

4. Objetivos / Metas: Escreva os diferentes objetivos e metas que estão incluídos em seu projeto. É preferível dividir seu projeto em seções e dar a cada uma delas um título - eles podem atuar como seus objetivos / metas.

5. Antecedentes / Revisão da literatura: Coloque aqui todos os dados que levaram à ideia. Dê referências adequadas para todas as informações. Certifique-se de que tudo flui em ordem lógica e de que é possível conectar as instruções entre si. Se possível, divida o plano de fundo em subtítulos, todos os quais refletem os objetivos individuais. As subposições também podem ser feitas de acordo com quaisquer outros fatores adequados. O histórico deve incluir apenas o que é relevante para o seu projeto e não detalhes excessivos - por exemplo, você deseja caracterizar o nível de expressão usando RT-PCR. Portanto, não comece com a história de RT-PCR etc., apenas dê alguns exemplos (junto com referências) em que o RT-PCR foi usado para o mesmo propósito.

6. Metodologia: aqui é onde você finalmente explica como pretende realizar o seu trabalho. O nível de detalhe depende dos requisitos do revisor. Normalmente, para concessões, é necessário um alto nível de detalhes nesta etapa. Explique a metodologia de cada objetivo em detalhes explícitos. Quaisquer referências usadas na seção devem ser devidamente mencionadas. Também é aconselhável incluir um cronograma nesta seção. O cronograma deve mostrar quanto tempo será necessário para cada etapa (por exemplo, 1º objetivo - 6 meses, 2º objetivo - 2 anos etc.). É ideal incluir um fluxograma que ilustra sua metodologia e também o cronograma.
Aqui você também deve incluir os resultados esperados, bem como as interpretações que podem ser feitas a partir desses resultados. Além disso, você precisa adicionar o que faria a seguir se obtivesse esses resultados - sejam eles quais forem.

7. Referências: Faça uma lista de todas as referências usadas na proposta. Eles devem estar em qualquer um dos formatos padrão, como APA ou referências do estilo Harvard. Eles podem ser organizados em ordem alfabética ou de acordo com a ordem em que aparecem na proposta. Não deve haver diferença de fonte ou formato em toda a lista de referências. As referências não devem incluir sites gerais, como Wikipedia ou blogs, podem incluir livros e artigos de periódicos.
Sua proposta deve ser de fácil leitura. Destaque todos os pontos importantes para que uma pessoa que folheá-los também possa obter a essência completa. Sempre mantenha o fluxo de pensamento ao escrever. Verifique novamente se há erros gramaticais e de digitação em seu trabalho, pois eles deixam uma impressão muito ruim no revisor. Certifique-se de que quaisquer figuras, tabelas ou fluxogramas incluídos na proposta estejam devidamente identificados.


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Definição de PCR (reação em cadeia da polimerase)

PCR (reação em cadeia da polimerase): PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma técnica em genética molecular que permite a análise de qualquer sequência curta de DNA (ou RNA), mesmo em amostras contendo apenas pequenas quantidades de DNA ou RNA. O PCR é usado para reproduzir (amplificar) seções selecionadas de DNA ou RNA para análise. Anteriormente, a amplificação do DNA envolvia a clonagem dos segmentos de interesse em vetores para expressão em bactérias e levava semanas. Mas agora, com o PCR feito em tubos de ensaio, leva apenas algumas horas. O PCR é altamente eficiente, de modo que um número incontável de cópias pode ser feito do DNA. Além disso, o PCR usa as mesmas moléculas que a natureza usa para copiar o DNA:

  • Dois "primers", sequências curtas de DNA de fita simples que são sintetizadas para corresponder ao início e ao final do trecho de DNA a ser copiado
  • Uma enzima chamada polimerase que se move ao longo do segmento de DNA, lendo seu código e montando uma cópia e
  • Uma pilha de blocos de construção de DNA de que a polimerase precisa para fazer essa cópia.

FONTE:
MedTerms.com. PCR (reação em cadeia da polimerase).

CDC.gov. Mycobacterium cosmeticum, Ohio e Venezuela.

MedicineNet.com. PCR (reação em cadeia da polimerase)

Mullis, K. A origem incomum da reação em cadeia da polimerase. Americano científico. 262 (4): 56–61,1990.


Filtros para reação em cadeia da polimerase (PCR)

PCR é uma técnica para fazer várias cópias de uma curta sequência de DNA alvo, amplificando-a exponencialmente. O DNA deve ser amplificado para que haja material suficiente para detectá-lo com segurança e identificá-lo com um alto grau de confiança. O PCR é usado em uma infinidade de aplicações, incluindo diagnóstico de doenças infecciosas.

Se a sequência de DNA alvo de um patógeno de interesse for detectada em uma amostra de um paciente e posteriormente amplificada, sua presença será confirmada por um sinal de fluorescência. Se o alvo for uma sequência de RNA, o DNA complementar ao RNA é amplificado, como é o caso dos vírus RNA, como o coronavírus responsável pelo COVID-19.

O objetivo da PCR é fazer o suficiente da região alvo do DNA para que sua presença possa ser medida ou confirmada para fins diagnósticos, clínicos ou experimentais. O valor dessa abordagem é que apenas as sequências alvo específicas devem ser amplificadas, sem amplificar desnecessariamente todo o DNA em um gene ou cromossomo inteiro.

A Chroma Technology fornece filtros PCR de alta qualidade para os principais fabricantes de equipamentos de teste há muitos anos. Isso proporcionou à Chroma uma valiosa experiência e especialização em aplicações. Nossa equipe técnica não só tem um profundo conhecimento de fluorescência, gerenciamento de luz e biofotônica, mas também tem uma vasta experiência de trabalho com pesquisadores e engenheiros de PCR.

Os filtros ET da Chroma para aplicações de fluorescência, como PCR, fornecem níveis incomparáveis ​​de precisão espectral. Isso permite minimizar a sobreposição espectral - que está sempre presente entre as sondas fluorescentes - e otimizar as bandas de passagem do filtro. O alto grau de precisão espectral garante resultados reproduzíveis e confiáveis, permitindo seis ou mais canais de fluorescência distintos. Juntamente com o alto bloqueio fora de banda (≥ OD6) e transições extremamente íngremes de alta transmissão para bloqueio profundo, esses filtros oferecem as mais altas taxas de sinal-ruído disponíveis.

Diferentes abordagens têm sido usadas pelos fabricantes de instrumentos de PCR para detectar os sinais de fluorescência associados às sequências genéticas amplificadas. Uma variável é a fonte de luz. A maioria dos instrumentos usa LEDs como fontes de luz para “excitar” os fluoróforos, gerando o sinal de fluorescência. No entanto, alguns instrumentos de PCR digital de gotículas (ddPCR) e PCR digital com base em chip (cdPCR) empregam lasers como fonte de luz de excitação por fluorescência.

Outra variável é o modo de detecção. Um instrumento de PCR pode usar vários conjuntos de filtros individuais, que são otimizados para cada combinação de fonte de luz e fluoróforo. Conjuntos multibanda podem simplificar muito o caminho óptico, reduzindo o número de filtros e, portanto, os requisitos de espaço físico, mas eles necessariamente comprometem a detecção e separação de sinal ideal. Existem trade-offs entre custo, eficiência, confiabilidade, precisão e sensibilidade.

Abaixo está um exemplo de dois esquemas de detecção diferentes usados ​​para detectar os mesmos quatro fluoróforos de PCR comumente usados: FAM, HEX, ROX e Cy5. O primeiro esquema usa quatro conjuntos de filtros de banda única, cada um otimizado para uma combinação específica de LED / fluoróforo. O segundo usa um conjunto de filtros multibanda com filtros e requisitos de espaço mínimos, mas com eficiência espectral comprometida. Outros esquemas de detecção podem exigir apenas dois fluoróforos, enquanto alguns podem exigir seis ou mais canais de fluorescência.

A: Quatro conjuntos de filtros de banda estreita individuais para detectar nucleotídeos conjugados a FAM, HEX, ROX ou Cy5. Otimizado para uso com LEDs com saída nas regiões espectrais de 465–475 nm, 525–535 nm, 560–580 nm e 625–635 nm.

B: Um único filtro de quatro bandas definido para detectar nucleotídeos conjugados a FAM, HEX, ROX ou Cy5. Otimizado para uso com LEDs com saída nas regiões espectrais de 465–475 nm, 520–535 nm, 580–595 nm e 635–645 nm.

Em ambos os gráficos, gráficos sombreados em cinza claro = espectro de filtro de excitação, gráficos sombreados em cinza escuro = espectro de filtro de emissão, traços pretos grossos = espectro de divisor de feixe dicróico.

Na prática, qPCR fornece quantificação relativa do DNA, que é então calibrado para uma curva padrão para um resultado quantitativo, enquanto a PCR digital fornece quantificação absoluta do DNA sem a necessidade de uma curva de referência ou calibração. Além do diagnóstico de doenças infecciosas, a PCR também é usada em muitas outras áreas da biologia e da medicina, tanto em ambientes clínicos quanto de pesquisa. Isso inclui testes pré-natais e identificação de sequências de DNA de pacientes associadas a doenças como o câncer.

O PCR também é usado em alguns tipos de sequenciamento de última geração (NGS), identificando as causas genéticas da doença, análise funcional de genes e expressão gênica, amplificação de DNA antigo, rastreamento de hereditariedade e perícia forense. Muito desse trabalho é feito em pesquisa biológica básica, bem como em pesquisa aplicada em disciplinas tão diversas quanto biologia molecular, imunologia, ecologia e agricultura.


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PCR - Impressão digital de DNA

Patrick leciona Biologia AP há 14 anos e é o vencedor de vários prêmios de ensino.

Como o DNA é único para um indivíduo, podemos usar Impressão digital de DNA para combinar a informação genética com a pessoa de onde veio. Primeiro, usamos a reação em cadeia da polimerase (PCR) técnica para copiar um minúsculo fragmento de DNA de modo que haja o suficiente para ser usado na eletroforese em gel. A eletroforese em gel usa gel e eletricidade para separar fragmentos de DNA com base no tamanho, criando um padrão distinto que representa a informação genética de um indivíduo.

Em programas como CSI, Miami, Nova York ou qualquer outro lugar, eles costumam usar o termo impressão digital de DNA. Um dos métodos mais comuns de impressão digital de DNA é algo chamado PCR e o que tem a ver com isso é o uso de PCR e eletroforese em gel para examinar o DNA. Agora, PCR significa Reação em Cadeia da Polimerase, que é um processo para copiar DNA e o que ela faz é usar uma polimerase de DNA estável ao calor especial para copiar um gene específico no qual você está interessado.

Agora, a eletroforese em gel é a ideia de usar o fato de que o DNA é carregado negativamente para pegar sua cópia de DNA, colocá-la no gel de agarose ou em algum outro material e, em seguida, usar a eletricidade para conduzir esse DNA carregado através do gel e porque esse gel atua como um obstáculo força que separa os fragmentos de DNA com base em seu tamanho. Vamos dar uma olhada neste vídeo do YouTube que mostra o processo conhecido como PCR e nós estamos dentro de um tubo de ensaio cheio de DNA de suspeito, se estamos em CSI, mas tudo o que estamos interessados ​​é neste seção particular de DNA chamada de sequência alvo destacada em verde. Agora, isso vai tirar vantagem de algumas das etapas envolvidas na replicação do DNA, o processo de cópia do DNA.

Normalmente, com a replicação do DNA, temos que abrir a hélice, bem, para abri-la em suas células, você usa uma enzima. Neste tubo de ensaio vamos aquecê-lo até 95 graus Celsius, o que separará os dois lados, porque essa é a temperatura quase de ebulição. Agora vamos resfriá-lo um pouco e permitir que uma coisa pré-fabricada chamada primer que diz em qual gene estamos interessados ​​em copiar entre e, assim, resfriando a cerca de 60 graus ímpares ou assim que permite que o primer se ligue à nossa sequência alvo . Agora, as coisinhas laranja são aquela enzima que pode sobreviver a essas altas temperaturas. E esses caras verdes com gravetos, esses são os nucleotídeos, a matéria-prima para construir nossa cópia de DNA. Então a enzima faz o que deveria fazer, ela encontra o primer e diz que está tudo bem e começa a copiar e continua.

E se você der tempo suficiente, ele terminará de copiar a molécula inteira dessa forma e aquela irá copiar dessa maneira. Lembre-se de que as duas fitas de DNA são antiparalelas e seguem direções opostas. Mas damos apenas 2 minutos no máximo e, nesse ponto, deixamos parar e estamos no final do primeiro ciclo. E agora que terminamos com o ciclo um, podemos começar o ciclo dois e ele é exatamente a mesma coisa, aquecemos até 95 graus Celsius, o que é suficiente para separar nossos antigos fios do modelo original e nossas cópias recém-feitas. Nós o resfriamos a 60 graus Celsius, o que significa que resfriamos o suficiente para que os primers que ainda estão flutuando no tubo de ensaio se liguem às porções inicial e final de nosso gene de interesse. Então vamos para a temperatura certa para a enzima, a DNA polimerase, ela encontra o primer e vai bem e começa a copiar e isso é o final do ciclo dois.

Neste ponto, temos 4 cópias, agora cada uma de nossas cópias contém informações que não fazem parte do nosso DNA, mas no início do ciclo 3, quando o aquecemos, observe que há alguns pequenos segmentos curtos que têm apenas o comprimento de nosso gene de interesse. Resfriamos, primer stick, os tag-primers vêm e se ligam, são chamados de tag-primers, abreviação de termocineses, que é apenas o nome da criatura de onde veio, mas agora temos algumas de nossas moléculas-alvo feito. Então, estamos prontos para começar, acredito que este é o ciclo 4, então, novamente, vamos aquecê-lo, isso é o final do ciclo 3, então o aquecemos para o ciclo 4, separamos nossos fios, resfriamos o suficiente para que os primers entrem, eles se ligam às porções inicial e final de nossa DNA gene tag polimerase faz o trabalho de cópia e, novamente, fizemos várias cópias exatamente do tamanho que desejamos. Originalmente, tínhamos mais desses mais longos, mas agora estamos começando a ter mais e mais dos mais curtos.

À medida que iniciamos o ciclo 5, fazemos exatamente a mesma coisa repetidamente. Por que isso é chamado de reação em cadeia, cada vez que estamos dobrando o número de nossas cópias. E nós apenas examinamos, e este é um processo tão simples, esta é uma das razões pelas quais quando foi inventado, as pessoas ficaram maravilhadas, como eles pensaram nisso e há um monte de histórias sobre como o cara realmente pensou nisso, mas ele agora é um homem muito rico porque todo mundo faz esse processo. Agora você pode ver que temos 22 moléculas e isso depois de apenas 5 ciclos. Cada ciclo leva talvez 90 segundos a alguns minutos, então você esta 30 vezes e aquilo leva talvez 90 minutos e no final você tem um grande número, bilhões de cópias de seu destino.

Agora você não pode ver uma molécula individual, mas pode ver bilhões de moléculas. Agora, como vamos visualizar isso? Como vamos ver o quão grande isso é? É aí que entra a eletroforese em gel. Então, vamos parar o YouTube e vamos para um slide do PowerPoint e vamos imaginar que fizemos uma impressão digital de DNA de 3 pessoas e estamos olhando para ver, nós ... # 39Não estamos usando isso para identificar quem eles são, como você veria um lado, mas estamos fazendo isso tentando descobrir quais genes eles têm? Suponhamos que encontramos um gene que, se você tiver uma versão mais longa dele, terá maior probabilidade de ter um câncer específico. Se você tiver uma versão resumida dele, você terá menos probabilidade de ter um câncer específico.

Bem, temos o paciente 1, o paciente 2 e o paciente 3, agora nesta quarta linha o que temos é DNA pré-fabricado para que possamos usá-lo como uma régua e o que fazemos é carregar nossas amostras de DNA nesses orifícios aqui chamados de poços. Ligamos a corrente, esta extremidade está carregada negativamente, esta extremidade está carregada positivamente O DNA tem uma carga negativa, então é repelido pelo lado negativo e vai zoom em direção à extremidade positiva. E os pequeninos com mil pares de bases se movem muito mais rápido do que os grandes 10.000 pares de bases de longos pedaços de DNA. Agora essa pessoa aqui, nós só vemos uma banda, essa pessoa aqui vemos uma banda, essa pessoa vemos duas. Por que é que? Oh sim, todo mundo tem duas cópias de cada gene, essa pessoa tem duas cópias da versão longa. Seus homozigotos para esta condição particular.


Tipos de PCR

  1. PCR em tempo real
  2. PCR quantitativo em tempo real (Q-RT PCR)
  3. PCR de transcriptase reversa (RT-PCR)
  4. PCR multiplex
  5. PCR aninhado
  6. PCR de longo alcance
  7. PCR de célula única
  8. PCR de ciclo rápido
  9. PCR específico de metilação (MSP)
  10. PCR de inicialização a quente
  11. PCR de alta fidelidade
  12. PCR in situ
  13. Número variável de repetições em tandem (VNTR) PCR
  14. PCR assimétrico
  15. PCR baseado em sequência repetitiva
  16. PCR de extensão de sobreposição
  17. Montar PCR
  18. PCR específico de interseqüência (ISSR)
  19. PCR mediada por ligação
  20. Metilação –especifina PCR
  21. PCR de miniprimer
  22. PCR de fase sólida
  23. Toque no PCR, etc.

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Laboratórios de Biocontenção
Biodetectores
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COBB, BRYAN R. "Polymerase Chain Reaction (PCR) ." Encyclopedia of Espionage, Intelligence, and Security. . Encyclopedia.com. 17 Jun. 2021 < https://www.encyclopedia.com > .

COBB, BRYAN R. "Polymerase Chain Reaction (PCR) ." Encyclopedia of Espionage, Intelligence, and Security. . Encyclopedia.com. (June 17, 2021). https://www.encyclopedia.com/politics/encyclopedias-almanacs-transcripts-and-maps/polymerase-chain-reaction-pcr

COBB, BRYAN R. "Polymerase Chain Reaction (PCR) ." Encyclopedia of Espionage, Intelligence, and Security. . Retrieved June 17, 2021 from Encyclopedia.com: https://www.encyclopedia.com/politics/encyclopedias-almanacs-transcripts-and-maps/polymerase-chain-reaction-pcr

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Polymerase Chain Reaction (Interactive)

Polymerase chain reaction (PCR) enables researchers to produce millions of copies of a specific DNA sequence in approximately two hours. This automated process bypasses the need to use bacteria for amplifying DNA.

This animation is featured in our "Spotlight Collection" on Polymerase Chain Reaction, along with video interviews with Kary Mullis, a 3D molecular animation of PCR, and several laboratory protocols.

This animation is also available as VIDEO .

Polymerase chain reaction (PCR) enables researchers to produce millions of copies of a specific DNA sequence in approximately two hours. This automated process bypasses the need to use bacteria for amplifying DNA. This animation is featured in our "Spotlight Collection" on Polymerase Chain Reaction, along with video interviews with Kary Mullis, a 3D molecular animation of PCR, and several laboratory protocols.

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Assista o vídeo: test animation Eamon PCR (Julho 2022).


Comentários:

  1. Arif

    Na minha opinião, você está errado. Tenho certeza. Eu posso provar. Envie -me um email para PM, vamos conversar.

  2. Joran

    Para a minha vida, eu não sei.

  3. Malagor

    Quanto tempo você pode falar sobre um mesmo assunto, toda a blogosfera está fodida?

  4. Nixen

    Entre nós, na minha opinião, isso é óbvio. Vou abster -me de comentar.



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