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Por que nem todas as células T fortemente reconhecidas são transformadas em células T reguladoras?

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A seleção negativa no desenvolvimento de células T é frequentemente descrita simplesmente como impedindo as células T efetoras de reconhecerem autoantígenos. Isso é complicado pelo desenvolvimento de células T regulatórias a partir de células T com afinidade moderada para autoantígenos. Se o reconhecimento de si mesmo é útil para a tolerância imunológica, por que as células T com forte afinidade por antígenos próprios também não se tornam células T reguladoras?


A seleção é baseada na força da ligação. Uma ligação forte faz com que um sinal na célula T se autodestrua (apoptose).

A Wikipedia tem um post sobre células T. Talvez as ligações moderadas se tornem células regulatórias, porque essas células precisam reconhecer as células T que sobrevivem à seleção negativa, que têm maior probabilidade de causar respostas auto-imunes por um longo período de tempo.

Uma forte afinidade consigo mesmo significa que a resposta imunológica se tornará um perigo para o hospedeiro.


Nem todas as plantas OGM são criadas iguais

Muitas pessoas têm opiniões firmes sobre as plantas geneticamente modificadas, também conhecidas como organismos geneticamente modificados ou OGM. Mas às vezes há confusão sobre o que significa ser um OGM. Também pode ser muito mais sensato julgar uma planta por suas características específicas do que pela forma como foi produzida - OGM ou não.

Este artigo não é para julgar se os OGMs são bons ou ruins, mas sim uma explicação de como as plantas com genomas modificados são feitas. (Existem OGMs não vegetais, mas neste artigo vamos nos referir apenas aos OGM vegetais.) Em primeiro lugar, é necessário definir o que queremos dizer com OGM. Para os fins desta discussão, estou definindo OGM como plantas cujas informações genéticas (encontradas em seus genomas) foram modificadas pela atividade humana.

Os humanos mudaram os genomas de praticamente todas as plantas do supermercado

Se pensarmos nos OGMs como plantas cujos genomas são modificados por humanos, muitas das plantas vendidas em qualquer supermercado se enquadram nessa descrição. Mas muitas dessas modificações não ocorreram no laboratório. Os agricultores selecionam plantas com características superiores desejáveis ​​para cultivar em um processo conhecido como evolução agrícola. Milhares de anos de criação agrícola tradicional mudaram os genomas das plantas daqueles de seus ancestrais selvagens originais.

Brócolis, por exemplo, não é uma planta que ocorre naturalmente. Foi criado a partir de animais não domesticados Brassica oleracea ou & # 8220 repolho selvagem, & # 8221 variedades domesticadas de B. oleracea incluem brócolis e couve-flor. O brócolis, junto com qualquer variedade de fruta sem sementes (incluindo o que você chama de banana) e a maioria das safras cultivadas nas fazendas hoje não existiriam sem a intervenção humana.

No entanto, essas não são as plantas em que as pessoas normalmente pensam quando pensam em OGM. É fácil entender como os agricultores podem criar melhores plantas em fazendas (escolhendo plantar sementes das plantas maiores ou de melhor rendimento, por exemplo, impondo seleção artificial nas espécies de cultivo), mesmo que essa atividade mude os genomas das plantas de maneiras que a natureza não faria não, a maioria das pessoas não considera essas plantas OGM.

Criação de & # 8216lab & # 8217 OGM

Depois que os genes das plantas foram estudados o suficiente, os pesquisadores poderiam recorrer ao retrocruzamento. Essa técnica envolve procriar a prole com os pais para tentar obter uma combinação estável e desejada de características parentais. Genes previamente ligados a características desejáveis ​​da planta, como maior rendimento ou resistência a pragas, podem ser identificados e rastreados por meio de técnicas de biologia molecular e mapas de ligação. Esses mapas mostram a posição relativa dos genes ao longo de um cromossomo, com base na frequência com que são transmitidos juntos aos descendentes. Genes mais próximos tendem a viajar juntos.

Os pesquisadores usaram marcadores moleculares - sequências genéticas específicas e conhecidas, presentes nos mapas de ligação - para selecionar plantas individuais que continham o novo gene marcador e a maior proporção de outros genes favoráveis ​​dos pais. As combinações de genes passados ​​para a prole são sempre devido à recombinação aleatória dos genes dos pais. Os pesquisadores não foram capazes de conduzir combinações específicas por si próprios, eles tiveram que trabalhar com o que surgiu naturalmente, então, nesta abordagem de seleção assistida por marcador, há muito esforço e tempo gasto tentando encontrar plantas com as melhores combinações de genes.

Nesse sistema, um laboratório precisa examinar os genomas, usando métodos de biologia molecular para procurar sequências de genes particulares para traços desejáveis ​​na prole reproduzida. Às vezes, um laboratório até cria as plantas em casos usando cultura de tecidos - uma maneira de propagar muitas plantas simultaneamente, minimizando os recursos necessários para cultivá-las.

Inserindo genes não vegetais em OGM

No início dos anos 1980, a era da biotecnologia vegetal começou com Agrobacterium tumifaciens. Essa bactéria infecta naturalmente as plantas e, na natureza, cria tumores ao transferir DNA entre ela e a planta que infectou. Os cientistas usam essa propriedade natural para transferir genes para células vegetais de um A. tumifaciensbactéria modificada para conter um gene de interesse.

Pela primeira vez, foi possível inserir genes específicos no genoma de uma planta, até mesmo genes que não vêm dessa espécie - ou mesmo de uma planta. A. tumifaciens não afeta todas as plantas, entretanto, os pesquisadores desenvolveram métodos de transferência de DNA inspirados nesse sistema que funcionariam sem ele. Eles incluem microinjeção e “armas genéticas”, em que o DNA desejado foi fisicamente injetado na planta, ou minúsculas partículas cobertas que foram literalmente atiradas nos núcleos das células vegetais.

Uma revisão recente resume oito novos métodos para alterar genes em plantas. Estas são técnicas de biologia molecular que usam diferentes enzimas ou moléculas de ácido nucleico (DNA e RNA) para fazer alterações nos genes de uma planta. Uma rota é alterar a sequência do DNA de uma planta. Outra é deixar a sequência em paz, mas fazer outras modificações epigenéticas na estrutura do DNA de uma planta. Por exemplo, os cientistas poderiam adicionar arranjos de átomos chamados grupos metil a alguns dos blocos de construção de nucleotídeos do DNA. Essas modificações epigenéticas, embora não alterem a ordem do DNA ou dos genes, mudam como os genes podem ser expressos e, portanto, os traços observáveis ​​de uma planta.

OGM não significa resistente ao glifosato

Chamar uma planta de organismo geneticamente modificado significa apenas que - seu genoma foi modificado pela atividade dos humanos. Mas muitas pessoas confundem a ideia de uma planta OGM com uma que foi criada para ser resistente ao herbicida glifosato, também conhecido pela marca Roundup. É verdade que as safras OGM mais conhecidas atualmente cultivadas contêm um gene que as torna resistentes ao glifosato, o que permite que os agricultores pulverizem o produto químico para matar as ervas daninhas enquanto permitem que sua safra cresça. Mas esse é apenas um exemplo de um gene inserido em uma planta.

É sensato avaliar os OGMs não sobre como eles são feitos, mas sim sobre quais novas características as plantas modificadas têm. Por exemplo, embora possa ser argumentado que a resistência ao glifosato em plantas não é boa para o meio ambiente devido ao aumento do uso do pesticida, é improvável que outros OGM causem esse problema.

Por exemplo, é difícil ver como o controverso arroz dourado, que foi projetado para produzir vitamina A nos grãos de arroz para ser mais nutritivo, é pior para o meio ambiente do que o arroz comum. Os OGMs foram desenvolvidos para expressar um pesticida permitido na agricultura orgânica: a toxina Bt, um inseticida produzido naturalmente pela bactéria Bacillus thuringiensis. Embora isso possa reduzir o uso de pesticidas, também pode levar à evolução de insetos resistentes ao Bt. E há OGMs que melhoraram as características de armazenamento ou conteúdo nutricional, como tomates “Flavr Savr”, ou abacaxis que contêm licopeno, e tomates que contêm antocianinas. Esses compostos são normalmente encontrados em outras frutas e acredita-se que tenham benefícios para a saúde.

O chamado "tomate peixe" contém uma proteína anticongelante (nome do gene afa3), encontrada naturalmente na solha de inverno, que aumenta a tolerância à geada no tomateiro. O tomate não contém realmente tecido de peixe, ou mesmo necessariamente DNA retirado de tecido de peixe - apenas DNA da mesma sequência presente no genoma do peixe. A proteína Afa3 é produzida a partir do afa3 gene nas células do tomate usando a mesma maquinaria de outras proteínas do tomate.

Existe algum peixe no tomate? Se o DNA retirado de um organismo e colocado em outro pode mudar a espécie do organismo receptor é um debate filosófico interessante. Se um único gene de um peixe pode transformar um “tomate peixe” em uma não-planta, seremos nós, seres humanos, que naturalmente contêm mais de uma centena de genes não humanos, realmente humanos?

Elizabeth Bent é pesquisadora associada da Universidade de Guelph. Este artigo apareceu originalmente em The Conversation.


Artigo ORIGINAL RESEARCH

Blagoje Soskic 1, Louisa E. Jeffery 2, Alan Kennedy 1, David H. Gardner 3, Tie Zheng Hou 1, Neil Halliday 1, Cayman Williams 1, Daniel Janman 1, Behzad Rowshanravan 1, Gideon M. Hirschfield 4 e David M. Sansom 1 *
  • 1 Instituto de Imunidade e Transplante, Divisão de Infecção e Imunidade, University College London, Royal Free Hospital, Londres, Reino Unido
  • 2 Instituto de Pesquisa de Metabolismo e Sistemas, Faculdade de Ciências Médicas e Odontológicas, Universidade de Birmingham, Edgbaston, Birmingham, Reino Unido
  • 3 Escola de Imunidade e Infecção, Faculdade de Ciências Médicas e Odontológicas, Universidade de Birmingham, Edgbaston, Birmingham, Reino Unido
  • 4 Toronto Centre for Liver Disease, Toronto General Hospital, Toronto, ON, Canadá

CD80 e CD86 são expressos em células apresentadoras de antígeno (APCs) e seu papel no fornecimento de coestimulação para células T está bem estabelecido. No entanto, foi demonstrado que essas moléculas também podem ser expressas por células T, mas o significado desta observação permanece desconhecido. Investigamos estímulos que controlam a expressão de CD80 e CD86 em células T e mostram que, em condições livres de APC, cerca de 40% das células T CD4 + ativadas em proliferação expressam CD80, CD86 ou ambos. A expressão de CD80 e CD86 foi fortemente dependente do fornecimento de coestimulação de CD28, pois os ligantes não foram expressos após estimulação de TCR sozinha. Além disso, observamos que as células T CD80 + possuíam as marcas registradas das células T regulatórias induzidas (iTreg), expressando Foxp3 e altos níveis de CTLA-4, embora proliferando menos extensivamente. Em contraste, o CD86 foi expresso preferencialmente em células produtoras de INF - & # x3b3, que proliferaram mais extensivamente e tinham características de células T efetoras. Finalmente, demonstramos que o CD80 expresso em células T inibe a função de CTLA-4 e facilita o crescimento de iTreg. Juntos, esses dados estabelecem a expressão endógena de CD80 e CD86 por células T ativadas não devido à captura de ligante por transendocitose e destacam diferenças claras em seus padrões de expressão e funções associadas.


Resultados

Diferentes protocolos compreendendo TGF-β para induzir iTregs humanos resultam em alta expressão de Foxp3

Para analisar e comparar a eficácia de diferentes protocolos publicados e novos para induzir iTregs humanos, isolamos células T CD4 + virgens de sangue periférico humano e as cultivamos em vitro na presença de TCR e coestimulação mais IL-2 em meio sem soro por 6 dias (Fig. 1A e Fig. S1). As células estimuladas foram usadas como controle negativo (“simulação”). Para induzir iTregs, TGF-β1 foi adicionado às culturas, sozinho ou junto com ATRA, ATRA mais Rapa ou butirato. Ex vivo Tregs CD25 ++ isolados, aqui chamados nTregs, foram usados ​​como controle positivo e presumivelmente compreendem a maioria dos tTregs, mas também pTregs [31]. Ao comparar de forma abrangente esses diferentes protocolos para indução de iTreg humano, descobrimos que todos os protocolos testados induziram uma alta fração de células que expressam Foxp3, que foi significativamente maior do que a expressão de Foxp3 induzida por ativação fraca observada em células T de controle simulado humano (Fig. 1 S2 Fig S1 Tabela). Os níveis de expressão de Foxp3 por célula em Foxp3 + iTregs foram semelhantes aos de nTregs (Fig. 1B). A expressão de Foxp3 foi enriquecida na população de CD25 ++ para todos os iTregs induzidos por TGF-β, o que era menos óbvio para expressão de Foxp3 baixa induzida por ativação em células de controle simulado estimuladas (Fig. 1B e 1C). Descobrimos que a adição de ATRA juntamente com a indução de Foxp3 aumentada por TGF-β em comparação com TGF-β sozinho. Por outro lado, quando Rapa foi adicionado além de TGF-β e ATRA (denominado "combinação tripla de Rapa"), a expressão de Foxp3 nas células T CD4 + totais caiu em comparação com o tratamento com TGF-β ou TGF-β + ATRA sozinho. Esta expressão de Foxp3 aparentemente reduzida nas culturas contendo Rapa foi menos pronunciada quando gating em células CD25 ++ (Fig. 1B e 1C). Os SCFAs foram descritos recentemente para aumentar a indução de Treg em células murinas [47,48], mas o efeito em células T humanas ainda não foi estudado. Aqui, descobrimos que a adição de butirato junto com a indução Foxp3 aumentada por TGF-β em células T humanas naive em comparação com TGF-β sozinho. Descobrimos que o propionato, outro SCFA que foi sugerido para aumentar marginalmente a indução de Treg em células de camundongo [47,48], não aumentou significativamente a expressão de Foxp3 em comparação com TGF-β sozinho (dados não mostrados). Uma tendência semelhante de expressão Foxp3 entre as diferentes condições de iTreg, conforme mostrado na Fig. 1 compilado para todos os doadores também foi visto em doadores individuais (Fig S3A), bem como no nível de FOXP3 mRNA (Fig S3B). A cinética, bem como a titulação de TGF-β e anti-CD28 mostraram uma tendência semelhante de expressão de Foxp3 em condições indutoras de Treg, independentemente das concentrações testadas de TGF-β ou anti-CD28, com nossas condições padrão (5 ng / ml de TGF-β e 1 μg / ml de anti-CD28) produzindo a maior expressão de Foxp3 (Fig S3C). Embora concentrações elevadas de TGF-β sejam descritas como favorecendo Treg em relação à indução Th17 [65-67], aumentar a concentração de TGF-β para 10 ng / ml não aumentou ainda mais a indução de Foxp3 em nosso sistema, mas 5 ng / ml foram suficientes ( S3C Fig). Visto que uma forte co-estimulação foi sugerida para inibir a indução de Treg [10,15-17], e o ATRA foi proposto para aumentar a diferenciação de Treg principalmente em condições de alta co-estimulação [16], testamos a redução de nossa concentração de anti-CD28. Ao fazer isso, não observamos indução Foxp3 aumentada em comparação com nossas condições padrão, e o efeito da indução Foxp3 de aumento de ATRA foi visto em ambas as concentrações de CD28 testadas (Fig S3C). Juntos, esses resultados mostram um padrão distinto e reprodutível de indução de Foxp3 em células T humanas por protocolos publicados (TGF-β TGF-β + ATRA) e novos (TGF-β + ATRA + Rapa TGF-β + butirato) para induzir humanos iTregs por meio da comparação direta desses protocolos dentro dos mesmos doadores e sistema experimental.

(A) Configuração experimental: células T CD4 humanas virgens foram cultivadas durante 6 dias em meio sem soro nas condições indicadas. As células T foram estimuladas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 mais 100 U / ml IL-2 (“Stim.”). Quando indicado, foram adicionados TGF-β1, rapamicina (Rapa), ácido retinóico totalmente trans (ATRA) ou butirato. nTreg (ex vivo células isoladas de sangue periférico CD25 high) foram deixadas sem estimulação e usadas como controle positivo. (B) O histograma mostra colorações Foxp3 representativas para um doador, delimitado em células CD4 + no painel superior ou em células CD25 ++ CD4 + no painel inferior. A linha listrada representa uma coloração de controle de isotipo (exemplarmente mostrado para a condição "stim. + IL-2 + TGF- β + ATRA + Rapa"). Unstim. = células T virgens não estimuladas. (C) O boxplot mostra porcentagens de células Foxp3 positivas medidas por FACS como em (B) para n = 13 a 23 doadores diferentes em 8 a 13 experimentos independentes (números n são indicados abaixo do gráfico). O painel superior mostra a porcentagem de células Foxp3 + de células CD4 +, o painel inferior de células Foxp3 + de células CD4 + CD25 ++. NA = não aplicável. A significância foi calculada pelo teste t pareado. n.s .: não significativo, *: p & lt0,05 **: p & lt0,01 ***: p & lt0,001 ****: p & lt0,0001.

Os iTregs humanos expressam outras moléculas de assinatura Treg além do Foxp3

Uma vez que a expressão de Foxp3 por si só não é suficiente para designar Tregs humanas, procuramos analisar a expressão de outras moléculas de assinatura do tipo Treg e compará-las entre os diferentes protocolos de indução de Treg. A cadeia alfa do receptor de IL-2 CD25 e a molécula co-inibitória CTLA-4 são constitutivamente expressas por Tregs, mas também por células T ativadas. Descobrimos que os iTregs gerados por nossos protocolos expressaram altos níveis de CD25 e CTLA-4 em uma grande fração da população (Fig 2A e 2B S4A Fig). No entanto, a expressão foi apenas marginalmente mais alta do que nas células T de controle ativadas, exceto para a combinação tripla Rapa na qual a fração de células que expressam CD25 e CTLA-4 foi ligeiramente diminuída. O último efeito foi consistente com a taxa de crescimento diminuída na combinação tripla Rapa de iTregs (observação não publicada), bem como a fração reduzida de células Foxp3 + dentro do CD4, mas não dentro do portão CD25 (Fig. 1). A expressão de CTLA-4 em iTregs não atingiu os níveis de expressão observados em nTregs (Fig. 2B e Fig. S4A). Uma vez que foi recentemente descrito para células T murinas que a expressão de Foxp3 juntamente com qualquer um dos chamados fatores de transcrição "quinteto" foi suficiente para estabelecer a assinatura de expressão do gene Treg-específico completo [6], procuramos analisar a expressão de esses fatores de quinteto em nossas populações de iTreg. Os fatores de quinteto IRF4, GATA-1 e EOS foram descritos como sendo regulados positivamente em Tregs, enquanto SATB1 e LEF1 deveriam ser regulados negativamente em Tregs, mas a superexpressão de cada um desses fatores junto com Foxp3 em células T de camundongo eliciou a assinatura Treg [6]. Nós achamos isso IKZF4 (codificação para EOS) foi altamente expresso em todos os nossos iTregs em níveis significativamente mais elevados do que em células T de controle naïve ou ativadas, atingindo níveis na faixa de nTregs (Fig 2C). Notavelmente, EOS é conhecido por ser um TF crucial para garantir o fenótipo, função e estabilidade de Treg [68,69]. Nós achamos isso SATB1, que é descrito como sendo regulado para baixo em Tregs [6] com relevância funcional [70], foi significativamente regulado para baixo em iTregs induzido pela combinação tripla Rapa, que mostrou níveis de expressão comparativamente baixos para nTregs (Fig. 2D). Para outros protocolos de iTreg, SATB1 a regulação negativa foi menos pronunciada. Em relação aos outros fatores do “quinteto”, não encontramos IRF4 expressos especificamente em iTregs nem nTregs, e também, LEF1 não foi regulado para baixo em iTregs (S4B e S4C Fig). Expressão de GATA-1 foi geralmente muito baixo e próximo do limite de detecção (valores de Ct na faixa de 32 a 37 ou indeterminado, n = 4 doadores Tabela S1) e, portanto, não foi analisado posteriormente.

(A) A expressão de superfície de CD25 foi medida por coloração de superfície e citometria de fluxo no dia 6 de cultura nas condições indicadas, delimitadas em células CD4 + vivas. São mostrados valores médios +/- SEM para n = 9 a 15 doadores (número n indicado abaixo do gráfico). A significância foi calculada com teste t pareado. O painel direito mostra o código de cores das sobreposições do histograma CD25 representativo, como no painel esquerdo. (B) A expressão de CTLA-4 (superficial e intracelular) foi quantificada por coloração de células permeabilizadas e citometria de fluxo no dia 6 de cultura nas condições indicadas, delimitadas em células CD4 + vivas. São mostrados valores médios +/- SEM para n = 7 a 10 doadores. A significância foi calculada com teste t pareado. O painel direito mostra o código de cores das sobreposições do histograma CTLA-4 representativo, como no painel esquerdo. A linha tracejada representa o controle de isotipo CTLA-4 (exemplo de isotipo mostrado para stim. + IL-2 + TGF-β + amostra ATRA). (C) IKZF4 (EOS) expressão de mRNA em células T naive cultivadas 6 dias sob o iTreg indicado ou condições de controle. nTregs e células T ingênuas não estimuladas foram amostradas no dia 0. O mRNA foi quantificado pelo ensaio Taqman, normalizado para RPL13A expressão. IKZF4 A expressão de mRNA em células T ingênuas não estimuladas do doador correspondente foi definida como 1, e mudança de vezes de IKZF4 mRNA foi calculado. São mostrados valores médios +/- SEM para n = 9 a 10 doadores. A significância foi calculada com teste t pareado. (D) SATB1 Expressão de mRNA em células T naive cultivadas 6 dias sob o iTreg indicado ou condições de controle. NTregs e células T naive não estimuladas foram amostradas no dia 0. O mRNA foi quantificado pelo ensaio Taqman conforme descrito em (C). São mostrados valores médios +/- SEM para n = 4 a 6 doadores. A significância foi calculada com teste t pareado. n.s .: não significativo. *: p & lt0,05 **: p & lt0,01 ***: p & lt0,001 ****: p & lt0,0001.

ITregs humanos exibem baixa expressão de citocinas IFN-γ, IL-17 e IL-10

Uma preocupação sobre os iTregs em oposição aos nTregs é que eles podem expressar altos níveis de citocinas inflamatórias patogênicas, como IFN-γ ou IL-17, que podem ser prejudiciais para o uso terapêutico na transferência adotiva. Descobrimos que os iTregs gerados pelos diferentes protocolos descritos acima expressaram apenas níveis baixos de IFN-γ quando medidos no nível de proteína intracelularmente após a reestimulação de PMA / ionomicina (Fig 3A) ou sem reestimulação no nível de mRNA (Fig 3B). A expressão de IFN-γ foi notavelmente menor em iTregs em comparação com células de controle simuladas estimuladas, com expressão mais baixa em iTregs gerados com a combinação tripla Rapa. A adição de butirato pareceu dificultar ligeiramente a repressão de IFN-γ (Fig. 3A e 3B). As células iTregs e Th17 estão intimamente relacionadas e compartilham vias comuns durante a diferenciação, embora tenham funções opostas com IL-17 tendo principalmente funções pró-inflamatórias [71]. Assim, analisamos se os iTregs induzidos por nossos protocolos também levaram à produção aumentada de IL-17, mas não pudemos detectar quantidades substanciais de IL-17A nas populações de iTreg testadas (valores de qRT-PCR Ct na faixa de 32-37 ou faixa de coloração intracelular indeterminada 0,01 a 0,7% de células IL-17A +, n = 4-7 doadores S1 Tabela). A citocina imunossupressora IL-10 é um mecanismo potencial pelo qual iTregs ou outras populações de células regulatórias podem suprimir a imunidade [72], razão pela qual investigamos a expressão de IL-10 nas diferentes condições indutoras de iTreg. A expressão de IL-10 foi menor em iTregs em comparação com células T de controle estimuladas ou nTregs (Fig. 3C), argumentando contra um papel importante para IL-10 nas populações de iTreg em estudo.

(A) A expressão de IFN-γ foi medida por coloração intracelular após 4 horas de pulso de PMA / ionomicina no dia 6 de cultura nas condições indicadas, fechado em células CD4 + vivas. São mostrados valores médios +/- SEM para n = 7 a 15 doadores (n números indicados abaixo do gráfico de barras). A significância foi calculada com teste t pareado. (B) IFNG Expressão de mRNA em células T naive cultivadas 6 dias sob o iTreg indicado ou condições de controle. nTregs e células T ingênuas não estimuladas foram amostradas no dia 0. O mRNA foi quantificado pelo ensaio Taqman, normalizado para RPL13A expressão. IFNG A expressão de mRNA em células T ingênuas não estimuladas do doador correspondente foi definida como 1, e a mudança de vezes de IFNG mRNA foi calculado. São mostrados valores médios +/- SEM para n = 7 a 11 doadores (n números indicados abaixo do gráfico de barras). A significância foi calculada com teste t pareado. (C) IL10 Expressão de mRNA em células T naive cultivadas 6 dias sob o iTreg indicado ou condições de controle. NTregs e células T naive não estimuladas foram amostradas no dia 0. O mRNA foi quantificado pelo ensaio Taqman conforme descrito em (B). São mostrados valores médios +/- SEM para n = 4 a 7 doadores (n números indicados abaixo do gráfico de barras). A significância foi calculada com teste t pareado. n.s .: não significativo. *: p & lt0,05 **: p & lt0,01 ***: p & lt0,001 ****: p & lt0,0001.

A expressão de Foxp3 é bastante estável após repouso de curto prazo em meio contendo IL-2

A estabilidade de Foxp3 em iTregs é controversa e não foi investigada nas condições exatas usadas aqui, portanto, questionamos se a expressão de Foxp3 em iTregs era estável após o repouso das células sem aditivos indutores de Treg. Além disso, Tregs devem ser descansados ​​sem estimulação e compostos indutores de Tregs antes de analisar sua função supressora (veja abaixo), então procuramos estabelecer e caracterizar as condições de repouso para iTregs. Após 6 dias de indução de Treg, os iTregs foram posteriormente cultivados por 2 dias, ou lavados e repousados ​​por 2 dias em meio contendo apenas baixas concentrações de IL-2 (S5A Fig). Descobrimos que para a maioria dos protocolos, a expressão de Foxp3 diminuiu ligeiramente do dia 6 ao dia 8, quando os iTregs foram posteriormente cultivados sob condições indutoras de iTreg (Fig. 4A). Quando os iTregs foram lavados no dia 6 e descansaram 2 dias, 50 U / ml IL-2 levou a uma manutenção marginalmente melhor da expressão de Foxp3 em comparação com 25 U / ml IL-2 (Fig 4A). Mesmo quando a expressão inicial de Foxp3 foi aumentada pela adição de concentrações mais altas de IL-2 durante a fase de indução de 6 dias, esse aumento da expressão de Foxp3 não era mais óbvio após a fase de repouso (Fig. 4A, painel superior esquerdo). Também no nível do mRNA, FOXP3 a expressão foi reduzida após o período de repouso (S5B Fig). Juntos, os resultados demonstram que a expressão de Foxp3 foi ligeiramente perdida após repouso de curto prazo de iTregs em baixas concentrações de IL-2, mas a tendência da expressão de Foxp3 nas diferentes condições indutoras de Treg foi mantida após repouso no dia 8. TGF-β a adição durante a fase de repouso não resgatou a pequena perda de expressão de Foxp3 (S5C Fig), mas diminuiu ligeiramente a viabilidade (dados não mostrados). Portanto, escolhemos repouso com 50 U / ml IL-2 e sem TGF-β como condição padrão para experimentos posteriores.

(A) Os iTregs foram induzidos durante 6 dias nas condições indicadas, com 100 U / ml de IL-2, salvo indicação em contrário. A expressão da proteína Foxp3 no dia 6 é mostrada como uma linha sólida e fina. Após 6 dias, os iTregs foram posteriormente cultivados 2 dias (linha espessa) ou lavados e colocados em repouso em meio contendo apenas IL-2, 25 U / ml (linhas tracejadas) ou 50 U / ml (linhas tracejadas). Os painéis da esquerda mostram a porcentagem de células Foxp3 +, os painéis da direita mostram as sobreposições do histograma FACS para as colorações Foxp3 correspondentes. As condições "padrão" (100 U / ml IL-2 para indução, 50 U / ml IL-2 para repouso) são marcadas por setas cinza. Gate: células CD4 + ativas. É mostrado um doador representativo (de 4 a 6 para condições padrão de 2 para titulações de IL-2 durante a indução). (B) A desmetilação do DNA de TSDR foi analisada no dia 6 de indução de Treg nas condições indicadas (painel esquerdo), ou no dia 8 após o repouso (duas pistas à direita). O DNA de Tnaive e nTreg foi isolado no dia 0 como controle. As células T foram isoladas de um doador masculino, e um doador representativo de 2 a 4 é mostrado. A escala de cores indica 0 a 100% de metilação nos nucleotídeos CpG dados no locus Foxp3. (C) iTregs ou células de controle foram cultivadas por 6 dias nas condições indicadas, em seguida, descansaram 2 dias e posteriormente cultivadas por 5 dias com reestimulação, ou sem reestimulação e sem ou com IL-2 (painel superior, médio e inferior, respectivamente ) Os nTregs foram criopreservados após o isolamento, descongelados no dia 6 e descansaram 2 dias, e então tratados em paralelo com os iTregs como controle. A expressão intracelular de Foxp3 foi medida por citometria de fluxo, delimitada em células CD4 + vivas. É mostrado um doador representativo em 4.

Um marcador importante para a expressão estável de Foxp3 é a desmetilação do TSDR no locus Foxp3, cuja existência e necessidade é controversa para iTregs e não foi testada para a maioria dos protocolos de diferenciação de iTreg usados ​​aqui. Portanto, perguntamos se os iTregs neste estudo exibiam desmetilação TSDR. Como resultado, não foi possível detectar a desmetilação de TSDR em nenhuma das populações de iTreg no dia 6 (Fig. 4B), o que também foi o caso de iTregs gerados na presença de TGF-β mais um inibidor de STAT3 recentemente proposto para aumentar a desmetilação de TSDR [ 73]. O estabelecimento da desmetilação de TSDR pode levar potencialmente mais de 6 dias em nosso sistema, mas os iTregs analisados ​​no dia 8 após o repouso ainda não exibiram desmetilação de TSDR (Fig. 4B). Juntos, descobrimos que, apesar da alta expressão de Foxp3, nenhum dos iTregs gerados por diferentes protocolos exibia desmetilação Foxp3 TSDR, mas a expressão de Foxp3 era relativamente estável, pelo menos durante o repouso de curto prazo.

Foxp3 é mantido sem reestimulação na presença de IL-2, mas não após reestimulação

Até agora, testamos apenas a estabilidade do Foxp3 em repouso de curto prazo, o que resultou em uma expressão de Foxp3 relativamente estável. No entanto, particularmente à luz da ausência de desmetilação de TSDR, testamos se iTregs poderia manter a expressão de Foxp3 quando reestimulado, ou mantido sem reestimulação por um período mais longo em cultura (S6A Fig). Descobrimos que após a reestimulação por mais 5 dias, os iTregs gerados por qualquer um dos protocolos perderam a expressão de Foxp3 para níveis quase indetectáveis ​​(Fig. 4C, painel superior), embora a viabilidade celular permanecesse alta (Fig. S6B). Também sem a reestimulação, o iTregs perdeu em grande parte o Foxp3 (Fig. 4C, painel do meio). Além disso, sob tais condições sem reestimulação, uma grande fração dos iTregs morreu (Figura S6B). No entanto, quando os iTregs foram em vez disso cultivados por 5 dias sem reestimulação e suplementados com IL-2, a morte celular foi evitada (Fig S6B) e as células retiveram amplamente sua expressão de Foxp3 (Fig 4C, painel inferior). No entanto, mesmo neste momento posterior sob essas últimas condições com expressão Foxp3 estável, ainda não pudemos detectar a desmetilação de TSDR (Fig S6C).

A re-indução do Foxp3 melhora a estabilidade do Foxp3, mas não induz a desmetilação TSDR

Em seguida, perguntamos se a expressão de Foxp3 poderia ser mantida de forma mais estável se durante uma fase de repouso mais longa por cerca de outra semana, o meio fosse suplementado novamente com moléculas indutoras de Treg, como TGF-β (S7A Fig). Na verdade, descobrimos que, em comparação com o repouso em meio contendo IL-2 sozinho, a re-indução de iTregs com o TGF-β + ATRA ou TGF-β + ATRA + Rapa inicialmente adicionado levou a uma melhor manutenção da expressão de Foxp3 (S7B Fig). No entanto, esta re-indução por um período mais longo ainda não foi acompanhada por desmetilação TSDR (S7C Fig).

ITregs induzidos com TGF-β mais ATRA mais Rapa exibem função supressiva robusta em vitro mas não na Vivo

Embora muito progresso tenha sido feito na última década para delinear as moléculas de assinatura Treg, ainda não há um marcador definitivo que defina inequivocamente as Tregs. Assim, é crucial determinar sua função supressora. Em relação à atividade supressora de iTregs, os relatórios são contraditórios, não deixando claro se a expressão de Foxp3 induzida por TGF-β é suficiente para induzir a atividade supressora. Além disso, embora alguns estudos tenham comparado diferentes protocolos para induzir Tregs humanos, não há nenhum estudo comparativo analisando a função supressiva dos iTregs gerados por todos os diferentes protocolos que aplicamos aqui. Uma vez que é difícil comparar a atividade de iTregs gerados por diversos protocolos em diferentes laboratórios e tipos de ensaios de supressão, procuramos comparar todos os protocolos de indução de Treg descritos aqui lado a lado no mesmo sistema experimental em relação à sua capacidade de induzir supressores iTregs, em comparação com células supressoras simuladas estimuladas do mesmo doador. Em contraste com os ensaios com nTregs que são anérgicos em vitro, para ensaios de supressão com iTregs, deve-se considerar que os iTregs são pré-ativados, proliferativos em vitro e pode secretar uma variedade de citocinas. Portanto, para analisar sua função supressora, repousamos os iTregs e os co-cultivamos em diferentes proporções com células T respondedoras marcadas com CFSE (Tresp S8 Fig). Células supressoras simuladas tratadas da mesma forma foram utilizadas como controle, bem como nTregs previamente congelados do mesmo doador. Posteriormente, a supressão da proliferação e produção intracelular de IFN-γ em Tresp foi analisada por gating rigorosamente em Tresp e, mais importante, em células vivas (Fig S9). Em nosso sistema experimental, descobrimos que apenas iTregs induzidos pela combinação tripla TGF-β + ATRA + Rapa suprimiu de forma específica e consistente a proliferação de células T CD4 e CD8 respondedoras em uma faixa de diferentes razões Tresp: iTreg e melhor do que todas as outras condições de iTreg testadas (Fig 5 e Fig S10A). Para as outras populações de iTreg, embora alguma supressão tenha sido observada em altas razões de iTreg: Tresp, isso não parecia ser específico para Foxp3 + iTregs, uma vez que células supressoras simuladas ativadas em proporções mais altas inibiram a proliferação de Tresp em uma extensão semelhante em alguns doadores (Fig. 5 e S10A Fig). Também em ensaios de supressão contendo células apresentadoras de antígeno, os iTregs induzidos por combinação tripla de Rapa foram os melhores iTregs supressores (Fig S10B). Ao longo dessas linhas, os iTregs induzidos por combinação tripla TGF-β + ATRA + Rapa também foram superiores na inibição da produção de IFN-γ de Tresp em comparação com outras populações de iTreg ou células supressoras simuladas, embora a variabilidade do doador fosse relativamente alta aqui (Fig S10C).

Os iTregs foram induzidos 6 dias nas condições indicadas, lavados, repousados ​​2 dias, lavados novamente e então usados ​​para analisar sua capacidade supressora em relação ao Tresp. Os ensaios de supressão com iTregs ou células de controle foram realizados com CD3 + CD25- Tresp marcado com CFSE. Tresp e iTregs (ou células supressoras simuladas estimuladas por controle, linha cinza) foram co-cultivados nas proporções indicadas, ou Tresp cultivado sozinho (preto) em diferentes densidades. nTregs (amarelo) foram usados ​​como controle. As culturas foram estimuladas por 4 a 5 dias e então analisadas por FACS. (A) mostra um doador representativo. Foi fechado em CFSE + CD4 + Tresp (painel esquerdo) ou CFSE + CD8 + Tresp (painel direito). Os gráficos superiores mostram média +/- SD de poços semeados em replicado. O painel inferior mostra sobreposições de histogramas CFSE para a proporção 1: 0,5. Unstim. = outros não estimulados são estimulados por 5 dias com pb anti-CD3 e anticorpos anti-CD28 solúveis. Linhas pretas pontilhadas = 2: 0 Tresp, linhas pretas sólidas = 1: 0 Tresp, histograma preenchido = Tresp não estimulado. As linhas da mesma cor representam células plaqueadas em poços replicados. A porta para determinar a porcentagem de células proliferadas é indicada pela linha horizontal. (B) Mostra a supressão percentual calculada a partir da proliferação de CFSE como em (A), com Tresp 2: 0 definido para 100% de proliferação (0% de supressão). São mostrados os dados compilados (média +/- SEM) para n = 2 a 6 doadores (n = 2 para proporção 1: 2 n = 4 para “butirato” iTreg, todos os outros iTregs: n = 6 doadores). A significância foi calculada por teste t emparelhado, comparando a supressão por populações de iTreg com células supressoras simuladas (estimuladas com anti-CD3 / -CD28 e IL-2 somente linha cinza) dentro de cada doador em proporções celulares de 1: 1 1: 0,5 ou 1: 0,25 . Os asteriscos indicam diferenças significativas e são representados na cor da respectiva condição de iTreg. *: p & lt0,05 **: p & lt0,01.

Juntos, nosso em vitro os resultados mostram que apenas os iTregs induzidos por combinação tripla TGF-β + ATRA + Rapa suprimiram células T respondedoras de forma significativa, identificando assim esta combinação como um novo protocolo robusto para induzir iTregs com atividade supressiva específica e superior em vitro em comparação com todos os outros protocolos de diferenciação de iTreg testados.

Desde a em vitro ensaios de supressão não refletem necessariamente a situação na Vivo, e descobrimos que os iTregs perderam Foxp3 após a reestimulação (Fig. 4C), perguntamos se os iTregs gerados pela combinação tripla TGF-β + ATRA + Rapa também eram supressores na Vivo. Para este fim, usamos um modelo de GvHD xenogênico, no qual PBMCs humanos induzem GvHD após injeção em camundongos NOG imunodeficientes [74]. Além da demonstração dos efeitos protetores dos nTregs no desenvolvimento do GvHD neste modelo, também foi usado para mostrar na Vivo função supressora de certas populações de iTreg [46,56,57]. Descobrimos que o GvHD foi rapidamente induzido por injeção intravenosa de PBMCs em camundongos NOG irradiados, monitorado por perda de peso e sobrevivência. No entanto, os iTregs gerados por qualquer um dos protocolos testados não foram capazes de prevenir ou atrasar o GvHD (Fig. 6). Assim, enquanto os iTregs gerados pela combinação de TGF-β + ATRA + Rapa tiveram atividade supressiva superior em vitro, isso não foi acompanhado por na Vivo função supressiva em um modelo de GvHD xenogênico.

Os iTregs foram induzidos 6 dias nas condições indicadas, depois lavados e repousados ​​por 2 dias. PBMCs alogênicos foram isolados e depletados em CD25 no dia anterior à injeção. Os camundongos NOG foram irradiados e injetados por via intravenosa no mesmo dia com 20x10 6 PBMCs sozinhos ou em conjunto com 5x10 6 iTregs ou células T de controle simulado ou nTregs expandidos em PBS. Como controle, os camundongos irradiados receberam apenas PBS.Os camundongos foram pesados ​​a cada 1 a 3 dias. (A) Mostra a porcentagem do peso do camundongo como média +/- SEM para n = 4 a 8 camundongos por grupo de iTreg combinados a partir de 2 experiências independentes, os números de camundongos (n) são indicados na figura (B). (B) Mostra as curvas de sobrevivência correspondentes para os dados de (A). Não houve diferenças significativas ao comparar cada grupo de iTreg a apenas PBMC ou grupos de células T simuladas.


Então, por que o CRISPR não está pronto para o horário nobre?

O CRISPR ainda tem um longo caminho a percorrer antes que possa ser usado com segurança e eficácia para reparar - não apenas interromper - genes nas pessoas. Isso é particularmente verdadeiro para a maioria das doenças, como distrofia muscular e fibrose cística, que exigem a correção de genes em uma pessoa viva, porque se as células fossem primeiro removidas e reparadas e depois colocadas de volta, muito poucas sobreviveriam. E a necessidade de tratar células dentro do corpo significa que a edição de genes enfrenta muitos dos mesmos desafios de entrega que a transferência de genes - os pesquisadores devem desenvolver maneiras eficientes de obter um CRISPR funcional em tecidos específicos de uma pessoa, por exemplo.

O CRISPR também apresenta seus próprios riscos de segurança. Mencionado com mais frequência é que a enzima Cas9 que o CRISPR usa para clivar o DNA em um local específico também pode fazer cortes onde não deveria, potencialmente causando câncer.


Informação sobre o autor

Arun K Kannan e Jason D Fontenot

Endereço atual: Endereços atuais: Biotechnology, AbbVie, North Chicago, Illinois, EUA (A.K.K.) e Biologia Exploratória, Juno Therapeutics, Seattle, Washington, EUA (J.D.F.).,

Takatoshi Chinen e Arun K Kannan: Esses autores contribuíram igualmente para este trabalho.

Afiliações

Howard Hughes Medical Institute, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nova York, Nova York, EUA

Takatoshi Chinen, Andrew G Levine, Xiying Fan, Georg Gasteiger, Yongqiang Feng e Alexander Y Rudensky

Programa de Imunologia, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nova York, Nova York, EUA

Takatoshi Chinen, Andrew G Levine, Xiying Fan, Georg Gasteiger, Yongqiang Feng e Alexander Y Rudensky

Immunology Discovery, Biogen, Cambridge, Massachusetts, EUA.

Arun K Kannan e Jason D Fontenot

Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, Nova York, Nova York, EUA

Departamento de Patologia e Biologia Celular, Universidade de Columbia, Nova York, Nova York, EUA

Departamento de Microbiologia e Imunologia, Universidade de Columbia, Nova York, Nova York, EUA

Nomis Foundation Laboratories for Immunobiology and Microbial Pathogenesis, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, Califórnia, EUA

Instituto de Microbiologia Médica e Higiene, Centro Médico da Universidade de Mainz, Mainz, Alemanha

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Contribuições

T.C., J.D.F. e A.Y.R. concebeu o projeto, elaborou os experimentos e escreveu e editou o manuscrito. T.C., A.K.K., A.G.L., X.F., Y.Z., G.G. e Y.F. experimentos conduzidos no Reino Unido geraram o Il2rb alelo fl e J.D.F. gerou o Il2ra alelo fl.

Autores correspondentes


Parte 2: Forma e função raiz

00: 00: 13.01 Meu nome é Philip Benfey.
00: 00: 14,16 Sou professor na Duke University
00: 00: 16.10 e um investigador
00: 00: 18.16 com o Howard Hughes Medical Institute.
00: 00: 20,26 Esta é a segunda parte de uma série de duas partes.
00: 00: 22,24 Na primeira parte,
00: 00: 25.09 Descrevi o uso da genética para observar a forma da raiz, isso.
00: 00: 29.18 para identificar genes que estão envolvidos
00: 00: 32,25 em como você sai de uma célula-tronco
00: 00: 35.17 para uma célula diferenciada na raiz.
00: 00: 38,07 Neste, vou aprofundar mais
00: 00: 40,27 nesse caminho de sair da célula-tronco
00: 00: 43,29 para uma célula diferenciada,
00: 00: 45.24 e também falar sobre como funcionam as raízes,
00: 00: 48.04 como eles se espalham pelo solo.
00: 00: 50.27 Existem aspectos do desenvolvimento da raiz
00: 00: 52,26 que simplificam muito a análise.
00: 00: 56.18 Por exemplo, se você olhar para o topo da raiz,
00: 01: 00.10 aqui em cima,
00: 01: 02.05 e você faz esta fatia através dele,
00: 01: 04.08 existe. o que estamos vendo lá.
00: 01: 06.11 você percebe que a organização é um conjunto de cilindros.
00: 01: 09.08 Há um cilindro externo do que é chamado de epiderme.
00: 01: 13.10 Dentro dele está o cilindro do córtex,
00: 01: 15,10 depois a endoderme.
00: 01: 16,26 E dentro dele está o tecido vascular.
00: 01: 19,27 Se você girar a raiz, é quase o mesmo.
00: 01: 22,21 Então, há simetria radial ao longo deste eixo, aqui.
00: 01: 26.14 No eixo longitudinal,
00: 01: 28.19 novas células são todas feitas na ponta da raiz
00: 01: 31.05 na população de células-tronco bem aqui.
00: 01: 33.16 E porque as células não se movem em relação umas às outras,
00: 01: 37.07 após a divisão da célula-tronco,
00: 01: 39,22 que vai fazer outra célula,
00: 01: 42.14 outra célula, outra célula dessas divisões.
00: 01: 44.23 E as células então, no lugar,
00: 01: 47,15 vão se diferenciar como você.
00: 01: 50.03 conforme a raiz se alonga,
00: 01: 52,23 você tem as células se diferenciando.
00: 01: 55.25 E o que isso significa é que este eixo longitudinal
00: 01: 59.04 é um curso de desenvolvimento -
00: 02: 02.08 as células mais jovens na ponta da raiz,
00: 02: 05.05 células cada vez mais antigas conforme você sobe na raiz.
00: 02: 07.21 O que isso faz é reduzir
00: 02: 09.18 o problema quadridimensional normal de desenvolvimento.
00: 02: 12.20 pense em um embrião animal crescendo no útero,
00: 02: 15.08 onde se tem que se preocupar
00: 02: 17,10 sobre as três dimensões espaciais mais o tempo.
00: 02: 20.18 onde, aqui, as três dimensões espaciais
00: 02: 23,10 são essencialmente reduzidas para
00: 02: 26.03 uma dimensão por causa da simetria radial,
00: 02: 28.19 e o tempo está no eixo longitudinal.
00: 02: 32,29 Pode-se pensar no que está acontecendo.
00: 02: 34,22 ativada em qualquer arquivo de célula
00: 02: 37.01 como o que está acontecendo na linha de montagem
00: 02: 39,26 em uma fábrica.
00: 02: 41.13 E uso um mural do artista mexicano Diego Rivera
00: 02: 45,26 para ilustrar a linha de montagem.
00: 02: 49,24 Então, pense nisso como um conjunto de partes
00: 02: 52.12 que estão acontecendo nas células-tronco.
00: 02: 53,26 Esses vão para diferentes linhas de montagem
00: 02: 56,04 para as diferentes camadas de células.
00: 02: 58.06 E no final, você obtém uma raiz totalmente formada,
00: 03: 00,23 pela combinação de todos aqueles
00: 03: 03.18 diferentes linhas de montagem se unindo.
00: 03: 06.20 Como você realmente consegue as células certas
00: 03: 09.14 nos lugares certos
00: 03: 11.03 vem da divisão das células-tronco
00: 03: 13,01 na ponta da raiz.
00: 03: 14.25 Existem quatro tipos diferentes de células-tronco.
00: 03: 17.19 E quero focar sua atenção neste aqui,
00: 03: 20,26 este verde aqui.
00: 03: 23.02 E divide-se primeiro ao longo do eixo transversal
00: 03: 26.08 para se regenerar.
00: 03: 29,09 Essa é a célula inferior.
00: 03: 30,23 Isso é o que todas as células-tronco devem fazer.
00: 03: 32.13 Eles têm que se regenerar
00: 03: 34,23 para manter sua capacidade de gerar
00: 03: 37,12 muitas células diferentes.
00: 03: 39.25 E então a célula superior se divide ao longo do eixo longitudinal
00: 03: 43.21 para dar as duas primeiras células da endoderme
00: 03: 47,25 e linhagens de córtex.
00: 03: 50.15 E vai fazer isso indefinidamente.
00: 03: 52.17 Cada vez que ele se divide, ele fica.
00: 03: 54.19 faz mais duas células,
00: 03: 56.15 sendo o interno a endoderme,
00: 03: 58,25 sendo o outro o córtex.
00: 04: 01.08 Agora, fizemos uma triagem, uma triagem genética,
00: 04: 04.17 conforme descrevi na minha primeira palestra.
00: 04: 06.04 E nesta tela,
00: 04: 08.11 procurávamos algo muito simples.
00: 04: 10.16 Estávamos à procura de mutantes com raízes mais curtas
00: 04: 12,15 em comparação com o tipo selvagem.
00: 04: 14.11 E aqui, vemos isso em uma seção real
00: 04: 20.18 através de uma raiz real,
00: 04: 23.20 o tipo selvagem tinha. esse é o córtex.
00: 04: 25.08 A próxima camada é a endoderme.
00: 04: 27.00 E então, existem essas duas camadas
00: 04: 28,25 - córtex do lado de fora, endoderme do lado de dentro.
00: 04: 31.06 Em um dos mutantes, o primeiro mutante que encontramos,
00: 04: 33.14 que chamamos de raiz curta
00: 04: 35.13 porque pensamos nisso apenas como tendo uma raiz mais curta no momento.
00: 04: 38.10 vimos que, na verdade, ele tem apenas uma única camada
00: 04: 42,12 entre a camada externa da epiderme
00: 04: 44,11 e a camada interna de tecido vascular.
00: 04: 47.12 Nós, então, mais tarde, encontramos outra planta.
00: 04: 49.25 Também tinha uma raiz mais curta,
00: 04: 52.01, mas na verdade estávamos procurando ver se faltava uma camada
00: 04: 55.20. Chamamos este espantalho,
00: 04: 57.15 depois do personagem de O Mágico de Oz que está faltando alguma coisa.
00: 04: 59.19 No caso de O Mágico de Oz, falta o cérebro.
00: 05: 03.05 E descobrimos que, novamente, há apenas uma camada
00: 05: 07.09 entre a camada externa da epiderme
00: 05: 08.27 e o tecido vascular interno.
00: 05: 12.11 E o que nós.
00: 05: 14.21 quando caracterizamos esses mutantes,
00: 05: 17.00 perguntando no que aquela camada restante havia se tornado,
00: 05: 19.07 descobrimos que com a raiz curta,
00: 05: 22.16 tornou-se o córtex.
00: 05: 25.03 Então, a raiz curta estava sem endoderme.
00: 05: 27.18 Bem, no espantalho, encontramos atributos do córtex e da endoderme.
00: 05: 31,12 E a nossa interpretação, então,
00: 05: 34.14 é baseado no grande salto de fé da genética,
00: 05: 38.05 que é se você pode definir o que deu errado no mutante,
00: 05: 41.28 que diz qual é o gene normal
00: 05: 44.11 - aquele que sofreu mutação -
00: 05: 46.04 faz em seu contexto normal,
00: 05: 47,24 ou o que o gene do tipo selvagem faz
00: 05: 51,05 no contexto do tipo selvagem.
00: 05: 53.08 Então, na raiz curta, descobrimos que havia duas coisas
00: 05: 56.01 que deu errado.
00: 05: 57.13 Está faltando a divisão que divide
00: 06: 01.02 para a endoderme e córtex,
00: 06: 02.23 e só faz o córtex.
00: 06: 04.17 Então, isso diz que a raiz curta.
00: 06: 06.17 a proteína de raiz curta,
00: 06: 08.07 a proteína normal de raiz curta,
00: 06: 10.05 deve estar envolvido em fazer.
00: 06: 12.09 ambos fazendo com que essa divisão ocorra
00: 06: 14.07, bem como fazer a endoderme, especificando a endoderme.
00: 06: 18.18 Bem, no espantalho, porque encontramos
00: 06: 21.14 atributos do córtex e da endoderme em uma célula,
00: 06: 25.27 que sugere fortemente que o espantalho
00: 06: 28.04 está principalmente envolvido em fazer com que essa divisão ocorra
00: 06: 30.25 para separar o córtex e a endoderme.
00: 06: 34.27 Agora, depois de caracterizarmos esses mutantes
00: 06: 38.16 para descobrir o que o produto genético deve fazer,
00: 06: 42.00 o próximo passo foi identificar os genes reais
00: 06: 44.06 que havia sofrido mutação.
00: 06: 46.07 Fizemos isso procurando por inserções
00: 06: 48,26 para os genes que os interromperam.
00: 06: 51.20 E identificamos os genes para raiz curta e espantalho.
00: 06: 56.02 Descobriu-se que aqueles. aqueles produtos genéticos
00: 06: 59.00 - as proteínas que eles produziram -
00: 07: 00.21 eram, na verdade, muito semelhantes entre si.
00: 07: 03.17 Eles vieram da mesma classe de fatores de transcrição.
00: 07: 07.03 Esta é uma classe de fatores de transcrição específicos para plantas.
00: 07: 10.13 Agora, os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA,
00: 07: 13.16 ligam-se à região reguladora do DNA,
00: 07: 16.06 ou seja, a parte do DNA
00: 07: 18.21 logo acima de onde a proteína será produzida.
00: 07: 22.11 E eles controlam quando e onde essa proteína
00: 07: 25,16 é feito.
00: 07: 26,27 Então, dado onde a proteína de raiz curta está funcionando
00: 07: 31.06 - tem que fazer esta divisão, e tem que especificar a endoderme -
00: 07: 35.11 naturalmente esperávamos que fosse expresso
00: 07: 39,13 naquela célula pouco antes da divisão
00: 07: 41,21 e na endoderme após a divisão.
00: 07: 45.27 Enquanto espantalho, esperávamos ser expressos
00: 07: 48.14 pelo menos na célula onde a divisão
00: 07: 50.17 tem que ocorrer.
00: 07: 52,02 Então, nós então.
00: 07: 53.20 para olhar para esses genes,
00: 07: 55.08, usamos uma série de abordagens diferentes.
00: 07: 58.00 Ou seja, para ver onde são expressos,
00: 08: 00.03 fundimos suas regiões promotoras,
00: 08: 02.06 ou seja, a parte do DNA
00: 08: 04.08 que faz com que sejam expressos em locais específicos.
00: 08: 07.18 fundimos essa primeira proteína fluorescente verde, GFP.
00: 08: 12.15 E como você pode ver, GFP, como o nome sugere,
00: 08: 15.15 faz com que as células fiquem verdes fluorescentes
00: 08: 17.28 quando uma luz laser incide sobre eles.
00: 08: 22.06 E o que vimos com o espantalho
00: 08: 25.03 foi isso, de fato,
00: 08: 26.25 parece ser expresso exatamente onde esperávamos,
00: 08: 28.18 ou seja, é expresso naquela célula filha
00: 08: 31,07 que tem que dividir.
00: 08: 32.20 Permanece ligado na endoderme
00: 08: 34,15 após essa divisão,
00: 08: 36.05 por motivos que trabalhamos mais tarde.
00: 08: 38.16 Mas a surpresa veio com a raiz curta.
00: 08: 41.12 A raiz curta não foi expressa nessas células.
00: 08: 44,12 onde tem que se dividir, aqui.
00: 08: 46.09 Em vez disso, foi expresso apenas nos tecidos internos,
00: 08: 50,05 o tecido vascular.
00: 08: 51.18 E então, o que estava acontecendo aqui?
00: 08: 53.25 Bem, foi só quando olhamos
00: 08: 56,21 na proteína da raiz curta.
00: 08: 58.12 e para fazer isso, usamos o mesmo promotor,
00: 09: 01.03, mas desta vez estava dirigindo
00: 09: 03.25 a região de codificação da raiz curta,
00: 09: 05.22 ou seja, a parte do DNA
00: 09: 08.06 que codifica os aminoácidos que farão a proteína.
00: 09: 11,12 fundimos isso ao GFP, e o que vimos?
00: 09: 14.05 Vimos, agora, que tem uma localização muito diferente.
00: 09: 16,29 Então, o RNA, como eu disse,
00: 09: 20.01 foi expresso no tecido vascular,
00: 09: 21.22, mas a proteína é expressa no tecido vascular
00: 09: 23,29, bem como nas células onde esperávamos,
00: 09: 28.05 ou seja, esta é a célula-tronco aqui embaixo,
00: 09: 30,12 e então permanece ligado na endoderme
00: 09: 33,02 após essa divisão -
00: 09: 34.29 exatamente as células onde deve especificar seus destinos.
00: 09: 38.21 Além disso, você vê que sua localização,
00: 09: 40.23 aquelas coisas parecidas com bolas verdes que você está vendo aqui.
00: 09: 44.11 esses são os núcleos.
00: 09: 46.08 Fatores de transcrição atuam nos núcleos,
00: 09: 49,02 que é onde está o DNA.
00: 09: 51.02 Eles têm que se ligar ao DNA.
00: 09: 52,15 E isso. então, tudo parece bem.
00: 09: 56.02 proteína de raiz curta, pensamos,
00: 09: 58.01 está se movendo de uma célula para outra
00: 10: 00.07 através dos chamados plasmodesmos.
00: 10: 02.08 Estes são os canais que permitirão.
00: 10: 05.10 permitir seletivamente certas moléculas
00: 10: 07.11 como as proteínas se movem.
00: 10: 08.29 Eles não permitem que todas as moléculas se movam,
00: 10: 10.28 apenas os muito específicos,
00: 10: 12,29 como a proteína de raiz curta.
00: 10: 14,16 Agora, deixe-me recapitular o que eu disse a você até agora.
00: 10: 18.14 A raiz curta é expressa no tecido vascular.
00: 10: 22.09 Ele se move fisicamente para a endoderme.
00: 10: 26.14 E então você pode fazer a pergunta,
00: 10: 30.13 por que não continua passando por lá?
00: 10: 32,06 É porque esses canais
00: 10: 34.11 só existem entre o tecido vascular e a endoderme?
00: 10: 38,10 E a resposta é, não.
00: 10: 40.00 Os canais existem desde o.
00: 10: 42.16 de dentro para fora.
00: 10: 45.13 O motivo pelo qual para aqui
00: 10: 48.14 é onde ele interage com a proteína do espantalho.
00: 10: 51.14 a proteína do espantalho é expressa, como já mencionei,
00: 10: 55.06 exatamente onde você esperava - na endoderme.
00: 10: 57.04 E interage fisicamente.
00: 10: 59.06 então, a proteína de espantalho e a proteína de raiz curta co.
00: 11: 01.20 formam um complexo.
00: 11: 04.04 E é isso que impede a proteína de raiz curta
00: 11: 06.20 de avançar mais adiante,
00: 11: 08.09 até as camadas externas da raiz.
00: 11: 12.09 E podemos mostrar isso com esta pequena animação.
00: 11: 15,27 Então, a raiz curta se move,
00: 11: 17.13 interage fisicamente com o espantalho.
00: 11: 20.00 Mostramos então que as proteínas da raiz curta e do espantalho
00: 11: 23,07 ligam-se ao DNA.
00: 11: 24.28 Então, eles se ligam ao promotor do gene do espantalho.
00: 11: 28,22 O que isso causa?
00: 11: 29.14 Isso causa um rápido aumento do espantalho.
00: 11: 32.05 Quanto mais espantalho for feito,
00: 11: 33.29 quanto mais vem e se liga com a raiz curta,
00: 11: 36,17 liga-se ao promotor.
00: 11: 37,29 Isso cria um ciclo de feedback positivo
00: 11: 39,23 uma e outra e outra vez,
00: 11: 41.12 fazendo mais e mais espantalho.
00: 11: 43.17 Também descobrimos que a raiz curta
00: 11: 46.19 pode se ligar ao espantalho
00: 11: 48,26 e se ligam a outros genes.
00: 11: 50.11 Não se liga apenas ao gene do espantalho,
00: 11: 52.04 mas se ligam aos promotores de outros genes.
00: 11: 54.27 E formulamos a hipótese de que
00: 11: 57.20 entre aqueles outros genes cujo pro.
00: 11: 59.08 podemos, com sorte, encontrar genes
00: 12: 01.09 que estão envolvidos na obtenção desse segundo
00: 12: 04.14 divisão assimétrica a ocorrer,
00: 12: 05.27 a divisão que separa a endoderme do córtex.
00: 12: 09.11 Para tentar encontrar esses genes,
00: 12: 11.11 da maneira como fizemos
00: 12: 14,17 em que usamos uma forma induzível de raiz curta.
00: 12: 16,26 Agora, quando digo induzível,
00: 12: 18.16 o que quero dizer é que em sua forma normal,
00: 12: 21.27 ou seja, sem adição do indutor,
00: 12: 24.20 vemos o fenótipo de raiz curta.
00: 12: 26,26 Isso é o que você vê aqui.
00: 12: 28.07 Este é o fenótipo de raiz curta.
00: 12: 30.03 Mas nesta planta,
00: 12: 32.16 introduzimos o gene de raiz curta
00: 12: 35.14 fundido a algo chamado receptor de glicocorticóide.
00: 12: 39.02 Agora, o que acontece quando aquele receptor de glicocorticóide
00: 12: 42.21 é anexado à raiz curta
00: 12: 44,19 é isso que o impede de ir para o núcleo.
00: 12: 47,07 Novamente, este é um fator de transcrição
00: 12: 49,17 - atua no núcleo -
00: 12: 51,05 então isso está mantendo-o fora do núcleo, mantendo-o inativo.
00: 12: 54.16 Quando adicionamos o indutor,
00: 12: 56,25 neste caso dexametasona,
00: 12: 58.25 o que vemos é que realmente obtemos
00: 13: 01.13 uma raiz mais longa
00: 13: 03.07 e obtemos ambas as camadas de células feitas,
00: 13: 05.03 o interno e o externo feitos.
00: 13: 07,22 Isso. porque agora a raiz curta está sendo permitida
00: 13: 12.12 para entrar no núcleo e agir.
00: 13: 14.25 E então, o que fizemos foi então
00: 13: 17.05 olhamos ao longo do tempo.
00: 13: 18.25 Então, adicionamos o indutor,
00: 13: 21.02 e olhamos para 1 hora, 2 horas, 3 horas, etc.
00: 13: 23.08 O que descobrimos foi que cerca de 6 horas,
00: 13: 25.12 começamos a ver a ocorrência de divisões.
00: 13: 28.24 Havia apenas algumas divisões ocorrendo
00: 13: 32.00 nesta camada que não foi dividida.
00: 13: 34.02 Então, toda esta camada, aqui,
00: 13: 36,06 não foi dividido.
00: 13: 37,23 Adicionamos o indutor.
00: 13: 39,23 6 horas depois, começamos a ver as divisões.
00: 13: 41,25 Por 7 horas, vemos muitas e muitas divisões.
00: 13: 45,18 Então, o. então pensamos, bem,
00: 13: 48.04 se pudéssemos olhar apenas para aquele período de 6 a 7 horas,
00: 13: 51.18 e se pudéssemos apenas encontrar esta camada de células.
00: 13: 55.20 há muitas outras células, aqui,
00: 13: 59.02 que não estão fazendo nada em que estamos interessados ​​nesse ponto.
00: 14: 01.23 Queremos isolar apenas essas células amarelas, aqui.
00: 14: 04.12 E a maneira como fizemos isso foi fazer o seguinte.
00: 14: 10.02 Dissociamos a raiz usando enzimas
00: 14: 13.00 que rompem as paredes celulares que existem.
00: 14: 15.10 que ligam as células umas às outras.
00: 14: 16.29 As células permanecem intactas,
00: 14: 18.21, mas agora são células individuais.
00: 14: 21.12 E então passamos essas células por um classificador de células ativadas por fluorescência,
00: 14: 25.13 uma máquina FACS,
00: 14: 27.19 que nos permite obter apenas as células verdes.
00: 14: 30.03 A partir dessas células verdes, fazemos RNA.
00: 14: 32.17 E usamos esse RNA para hibridizar.
00: 14: 35.00 neste ponto, estávamos usando microarrays.
00: 14: 38.06 E isso nos permitiu ver quanto RNA havia
00: 14: 42,14 para cada célula do. na planta,
00: 14: 45.06 e para ver os níveis desses RNAs.
00: 14: 47,28 E então, fizemos isso em diferentes momentos.
00: 14: 50.16 E olhamos para 1 hora, 3 horas,
00: 14: 52,28 6 horas, 12 horas.
00: 14: 55.08 E estávamos à procura de genes que surgiram.
00: 14: 58.15 que se tornou mais expresso.
00: 15: 00.10 Neste caso, o amarelo é mais expresso.
00: 15: 04.01 O azul é menos expresso.
00: 15: 06.10 Então. que se tornou mais expresso apenas no período de 6 horas,
00: 15: 08.24 e talvez tenha caído depois.
00: 15: 11.06 E encontramos genes que esperávamos
00: 15: 14,13 - espantalho, porque, novamente, a raiz curta vira espantalho
00: 15: 17.08 para fazer esse feed. esse ciclo de feedback positivo.
00: 15: 20.09 Mas um gene que surpreendeu foi a ciclina D6.
00: 15: 24.06 Agora, as ciclinas fazem parte da maquinaria do ciclo celular.
00: 15: 27.01 Muitas células estão se dividindo na raiz.
00: 15: 30.19 E pensamos, há algo de especial sobre esta ciclina em particular?
00: 15: 34.27 A primeira sugestão de que havia algo especial
00: 15: 37.17 sobre esta ciclina D6 em particular
00: 15: 39.17 é quando fizemos um ensaio
00: 15: 41.21 que é chamado de imunoprecipitação da cromatina.
00: 15: 45.14 ou seja, olhamos para ver se o fator de transcrição
00: 15: 48.11 é, na verdade, anexar a si mesmo.
00: 15: 50,12 está ligado ao DNA.
00: 15: 52.04 e quando digo fator de transcrição,
00: 15: 54.01 neste caso estávamos procurando por raiz curta e espantalho,
00: 15: 57.02 e perguntando se eles estavam ligados ao DNA,
00: 15: 59.20 região reguladora, para ciclina D6?
00: 16: 03.05 E então, o que você vê aqui é que
00: 16: 06.00 estamos analisando o verdadeiro promotor do Cyclin D6,
00: 16: 09.12 e descobrimos que, de fato,
00: 16: 11.29 raiz curta e espantalho estão ligados
00: 16: 14,21 para certas regiões.
00: 16: 17.03 Estes são. cada um é um fragmento desse promotor.
00: 16: 20.02 Então, não está vinculado a essas partes,
00: 16: 22.20 mas eles estão vinculados a essas partes aqui.
00: 16: 24.22 Então, isso sugere fortemente que a raiz curta e o espantalho,
00: 16: 27.21 esses dois importantes fatores de transcrição
00: 16: 30.00 para obter essa divisão,
00: 16: 32.13 ligam-se diretamente a esta ciclina em particular
00: 16: 34,24 para fazer com que seja ativado.
00: 16: 38.20 A segunda evidência de que havia algo muito especial
00: 16: 40.28 sobre esta ciclina, esta ciclina do tipo D,
00: 16: 44.25 é seu padrão de expressão.
00: 16: 47.12 Quando fundimos seu promotor ao GFP,
00: 16: 49.02 descobrimos que é expresso bem naquela célula
00: 16: 51,24 logo antes da divisão longitudinal.
00: 16: 54.12 Aqui, você vê em uma seção transversal
00: 16: 57.26 que só o vemos em duas dessas células.
00: 16: 59.16 Esses devem estar se dividindo um pouco mais cedo
00: 17: 02.15 do que as outras células na seção de 8 células.
00: 17: 06.02 Então, o que eu disse é que
00: 17: 08.24 a raiz curta vem do tecido vascular,
00: 17: 10.25 move fisicamente para a próxima camada,
00: 17: 12.27 interage com o espantalho.
00: 17: 14.20 Isso faz com que um ciclo de feedback positivo seja feito.
00: 17: 18.04 Quanto mais espantalho é feito, mais é feito.
00: 17: 20,27 Portanto, este é um aumento exponencial no espantalho.
00: 17: 23.29 Eu também lhe disse que a raiz curta e o espantalho
00: 17: 26.01 juntos interagem com um promotor desta ciclina tipo D.
00: 17: 30.24 Este é um loop feed-forward que faz o cyclin,
00:17:35, 26 que então, como eu mostrei a vocês,
00: 17: 38.07 é fundamental para que ocorra a segunda divisão celular assimétrica.
00: 17: 41.00 Há outra parte desta rede
00: 17: 42.22 que foi descoberto por
00: 17: 45.20 o laboratório de Ben Scheres,
00: 17: 47.13 por Alfredo Cruz-Ramirez,
00: 17: 49.22 e eles descobriram que havia uma proteína
00: 17: 51.26 chamado retinoblastoma relacionado, RBR,
00: 17: 54.18 que bloqueia fisicamente a atividade do espantalho
00: 17: 58.06 quando se liga ao espantalho.
00: 18: 00.10 Agora, isso se conecta à nossa primeira rede através do Cyclin D6,
00: 18: 03.27 porque este ciclina D6, na verdade,
00: 18: 07.05 com sua quinase associada,
00: 18: 09.11 fosforila RBR.
00: 18: 11.02 Quando RBR é fosforilado
00: 18: 13,04 - quando há uma molécula de fosfato ligada a esta proteína -
00: 18: 15.28 então isso impede a ligação ao espantalho.
00: 18: 19,07 Bem, se você olhar para esta rede, aqui,
00: 18: 21.10 é difícil saber quando começa
00: 18: 24.05 e quando para.
00: 18: 25.20 Se RBR estiver ligado ao espantalho
00: 18: 28,22 e isso impede o resto deste processo,
00: 18: 31.03 como é que isso vai começar?
00: 18: 32.27 Ou se a ciclina D6 tiver RBR fosforilado,
00: 18: 35.28 então qual é o papel da RBR?
00: 18: 38,24 Então, para entender isso melhor,
00: 18: 40.16 usamos um conjunto de equações diferenciais ordinárias
00: 18: 43,26 para mapear as atividades
00: 18: 47,07 de cada uma dessas proteínas
00: 18: 49.12 e como eles afetam os outros.
00: 18: 51.29 E a partir disso
00: 18: 54,06 - este conjunto de equações diferenciais ordinárias -
00: 18: 56.01 se você deixar funcionar,
00: 18: 59.17 sugere que existe algo chamado biestabilidade.
00: 19: 02.00 Então, neste gráfico, você vê o nível inferior.
00: 19: 04.04 são os níveis do espantalho,
00: 19: 06.01 e há um nível inferior,
00: 19: 07.23 e depois há um nível superior,
00: 19: 10.00 sugerindo que o espantalho está ligado ou desligado,
00: 19: 12,03 e raramente passa um tempo intermediário.
00: 19: 15.13 E isso é interpretado como uma mudança,
00: 19: 18.13 que toda esta rede age para
00: 19: 22.18 ligue ou desligue o espantalho,
00: 19: 24.09 sem nada no meio.
00: 19: 26.08 E isso deve fazer essa divisão em um único momento
00: 19: 28,24 e fazer com que essa divisão ocorra como uma troca.
00: 19: 32.19 Então, deixe-me resumir o que eu disse a você
00: 19: 35.08 nesta primeira parte da palestra,
00: 19: 37.07 que é aquela proteína de raiz curta
00: 19: 39.11 passa de uma célula para a próxima,
00: 19: 41.09 move-se do tecido vascular para a endoderme.
00: 19: 43.25 a raiz curta induz a expressão de espantalho.
00: 19: 46.16 Juntos, eles ativam esta ciclina tipo D.
00: 19: 50.08 E esta rede de. todo esse processo
00: 19: 54.27 atua como um botão liga / desliga
00: 19: 57.08 para fazer uma divisão muito específica ocorrer
00: 19: 59.15 que padroniza a raiz,
00: 20: 02.01 faz com que a endoderme seja feita por dentro,
00: 20: 04.11 córtex a ser feito do lado de fora.
00: 20: 07.04 Agora, nesta parte da minha palestra,
00: 20: 10.19 Quero descrever como você. como as plantas se ramificam,
00: 20: 14.14 como eles obtêm seus sistemas de raiz
00: 20: 18.16 para ser feito em locais específicos,
00: 20: 20.11 porque ramificação é o que permite raízes
00: 20: 22.07 para realmente explorar o ambiente do solo.
00: 20: 24.01 Imagine se você tivesse apenas uma única raiz de toque descendo.
00: 20: 27.04 Você só conseguia os nutrientes e a água naquele único local.
00: 20: 33.19 No entanto, a maioria das plantas têm raízes que se ramificam,
00: 20: 35.29 e, assim, permitir que explorem
00: 20: 38.23 uma gama muito mais ampla de seu ambiente de solo.
00: 20: 42.05 Agora, as raízes dos ramos são incríveis,
00: 20: 44.21 a forma como são feitos.
00: 20: 46.04 Eles são feitos, na verdade, na camada que se parece com o tecido vascular,
00: 20: 50.15, mas na verdade tem um nome especial.
00: 20: 52.13 Chama-se periciclo.
00: 20: 54.04 É a camada que fica dentro da endoderme.
00: 20: 56.17 Então, na verdade vai para a epiderme, córtex,
00: 20: 59,05 endoderme, periciclo.
00: 21: 01.09 E quando o periciclo recebe os sinais certos,
00: 21: 03.20 começa a se dividir.
00: 21: 06.12 E se divide e forma outra camada,
00: 21: 08,22 nesta segunda camada,
00: 21: 10,08 e então isso se divide novamente para dar três camadas, etc, etc,
00: 21: 13,28 até que você finalmente se forme dentro da raiz.
00: 21: 16.23 isso está dentro da raiz em crescimento.
00: 21: 19,02 que você encontra. formar todas as camadas
00: 21: 21.28 que você encontra na ponta normal da raiz.
00: 21: 24,22 Então, em uma segunda vez,
00: 21: 26.18 ele realmente força sua saída
00: 21: 29.03 através da endoderme sobreposta e do córtex.
00: 21: 31.27 Tudo isso aconteceu do periciclo.
00: 21: 34.20 A endoderme e o córtex ainda estão lá.
00: 21: 36,23 Ele força sua saída
00: 21: 39.08 até formar essa nova raiz lateral.
00: 21: 41.20 Agora, se você olhar ao longo da superfície de uma raiz de Arabidopsis,
00: 21: 46.17 parece que essas raízes laterais,
00: 21: 48.27 essas raízes ramificadas,
00: 21: 50.13 são quase igualmente espaçados.
00: 21: 52.17 E o que pensamos por muito tempo
00: 21: 55,24 era aquele espaçamento igual
00: 21: 57.29 foi devido ao fato de que quando uma raiz começou a se formar,
00: 22: 01.17 que isso causou
00: 22: 04.14 um conjunto de sinais a serem produzidos,
00: 22: 06.07 e aqueles sinais diziam, ok, sem motivo.
00: 22: 08.19 Estou fazendo uma raiz saindo daqui.
00: 22: 10.20 não há razão para fazer outra raiz
00: 22: 13,02 acima de mim ou abaixo de mim.
00: 22: 14,19 Então, tinha inibição lateral.
00: 22: 16.20 Mas trabalho originalmente do laboratório de Tom Beeckman
00: 22: 19,22 e depois do nosso trabalho.
00: 22: 21.13 mostramos que pode haver outra maneira
00: 22: 25.09 de fazer com que essas raízes sejam posicionadas nos locais certos.
00: 22: 28.10 E o que o Beeckman Lab tinha visto originalmente
00: 22: 32.22 foi a evidência de um evento de expressão gênica oscilante
00: 22: 37.10 perto da ponta da raiz
00: 22: 39,04 - não na ponta da raiz,
00: 22: 41.11 mas mais nas células que estão começando a se alongar.
00: 22: 42,29 E você vê, aqui,
00: 22: 47.09 que o que fizemos foi pegar um marcador para essa oscilação,
00: 22: 49.08 fundi-lo a algo chamado luciferase.
00: 22: 51.09 então, não proteína fluorescente verde, mas luciferase.
00: 22: 53,28 e o motivo do uso da luciferase
00: 22: 56.07 é que não dura muito tempo,
00: 22: 59,08 para que você possa ver as oscilações.
00: 23: 01.10 Com proteína fluorescente verde,
00: 23: 03.07 ele apenas liga e continua ligado,
00: 23: 05.13 porque a proteína dura tanto tempo.
00: 23: 07.20 Então, usando a luciferase,
00: 23: 09.19 você pode ver que há um evento oscilante
00: 23: 12.13 aqui na raiz.
00: 23: 14.01 Depois, continua ligado.
00: 23: 16.09 E nesta representação 2-D,
00: 23: 18.02 você pode ver essa oscilação, e então, depois da oscilação, ela fica ligada.
00: 23: 22.25 Essa oscilação é aproximadamente a cada 6 horas.
00: 23: 27.13 Então, não é uma oscilação circadiana.
00: 23: 29,23 Não é a cada 24 horas.
00: 23: 31.16 É aproximadamente a cada 6 horas.
00: 23: 34,05 Novamente, ele oscila,
00: 23: 36.14 e depois sai para trás.
00: 23: 39.08 depois que essa oscilação ocorre, ainda há expressão,
00: 23: 42,22 e esses pontos de expressão permanecem ativados.
00: 23: 46,22 Se você acender as luzes depois.
00: 23: 48.14 isso tudo é feito no escuro
00: 23: 50.20 para que possamos ver a luciferase.
00: 23: 52.15 Se você ligar as luzes depois,
00: 23: 54.15 você vê que em cada um desses locais de pré-ramificação,
00: 23: 56.14 agora há uma formação de raiz lateral.
00: 23: 59.11 Então, o que pensamos sobre isso,
00: 24: 02.02 e como os chamamos, são sites de pré-ramificação.
00: 24: 04.19 Estas são localizações.
00: 24: 07.03 uma competência para formar uma raiz lateral,
00: 24: 09.09 para formar uma raiz ramificada,
00: 24: 11.16 que foi anulado antes da formação
00: 24: 14,29 dessas raízes laterais.
00: 24: 17.12 Então, se mudarmos a taxa de crescimento da raiz
00: 24: 20.00 - por exemplo, colocando-o em um ciclo de luz de 24 horas
00: 24: 23.01 em oposição a 16.
00: 24: 25,06 16 horas de luz / 8 horas de escuridão -
00: 24: 27.12 se você olhar ao longo dela, parece que há
00: 24: 30.17 muito mais locais de pré-ramificação em um curto período,
00: 24: 33.00 um espaço de classificação da raiz.
00: 24: 36.00 E, de fato, por um determinado período de tempo,
00: 24: 38.15, obtemos quase exatamente o mesmo número de sites pré-ramificação
00: 24: 43,03 em um ciclo de luz de 24 horas
00: 24: 44,26 ou um ciclo de luz de 16/8 horas.
00: 24: 47,28 Agora, isso pode fazer sentido,
00: 24: 50.22 porque, como as raízes estão crescendo rápido.
00: 24: 53.01 rapidamente através do solo,
00: 24: 54.25 que tende a significar que há muitos nutrientes,
00: 24: 56,24 muita água,
00: 24: 58.20 e, assim, você pode espalhar seus sites de pré-ramificação,
00: 25: 01.00 espalhe suas raízes laterais.
00: 25: 02.28 Você precisa de menos exploração.
00: 25: 04.23 No entanto, se houver uma redução nos nutrientes
00: 25: 07.16 e a água passando pelo solo compactado,
00: 25: 10.17 você provavelmente deseja ramificar muito mais
00: 25: 14.04 para explorar outras partes do solo
00: 25: 16,16 onde pode estar.
00: 25: 18.04, pode haver mais nutrientes, etc.
00: 25: 19.28 Nesse caso, você quer os sites pré-ramificação mais próximos.
00: 25: 23.01 E então, o que isso significa
00: 25: 25.24 se você tiver aproximadamente o mesmo número de sites pré-ramificação
00: 25: 28,07 por unidade de tempo?
00: 25: 29.16 Significa que, com toda a probabilidade,
00: 25: 31,12 isto funciona como um relógio.
00: 25: 33.03 É um processo semelhante a um relógio que conta o tempo.
00: 25: 35,27 Não está contando as divisões de células.
00: 25: 38.21 E então perguntamos,
00: 25: 40,27 bem, se for um processo semelhante ao de um relógio,
00: 25: 42.15 existe alguma maneira de interromper esse processo semelhante ao de um relógio,
00: 25: 46.01 e isso pode nos levar a.
00: 25: 47.21 nos leva ao mecanismo subjacente.
00: 25: 50.15 E então, uma das coisas que descobrimos
00: 25: 52,23 era isso, se você bloquear a síntese de beta-caroteno.
00: 25: 55.29 o beta-caroteno é o que torna a cenoura laranja, por exemplo.
00: 26: 01.08 também é importante para a visão humana.
00: 26: 04.17 é por isso que dizem para você comer cenouras quando criança.
00: 26: 07.14 Então, bloqueamos a biossíntese de beta-caroteno
00: 26: 10.16 com algo chamado CPTA.
00: 26: 13.04 Quando fizemos isso,
00: 26: 15.02 você percebe que há muito poucos sites de pré-ramificação.
00: 26: 16.16 Você pode contá-los e.
00: 26: 19.27 foi drasticamente eliminado.
00: 26: 21.15 No entanto, se você bloquear toda a produção de beta-caroteno
00: 26: 25.00 e tudo o que o beta-caroteno faz,
00: 26: 26.27 as plantas estão muito infelizes.
00: 26: 29.19 E então, em colaboração com Tim Bugg na Universidade de Warwick.
00: 26: 33.24 ele nos deu um inibidor.
00: 26: 35.27 algo que atua muito especificamente
00: 26: 38.01 quando o beta-caroteno é cortado em pedaços menores.
00: 26: 41.20 E cada uma dessas peças tem um.
00: 26: 44.21 tem uma função diferente.
00: 26: 46,03 Este composto D15
00: 26: 49,15 bloqueia uma clivagem muito específica.
00: 26: 51.28 E perguntamos, bem,
00: 26: 54.06 o que acontece se usarmos isso em vez de bloquear o beta-caroteno?
00: 26: 56.11 E o que descobrimos foi que
00: 26: 58.16 agora as plantas parecem muito felizes -
00: 27: 00.14 eles são verdes as raízes são longas -
00: 27: 02.12 mas, na verdade, eles fazem muito poucos sites pré-ramificação
00: 27: 04.06 e muito poucas raízes laterais depois.
00: 27: 10,20 E então, então perguntamos,
00: 27: 12.24 que aspecto do beta-caroteno.
00: 27: 14.07 novamente, é uma molécula longa.
00: 27: 16.25 É cortado em muitas moléculas menores diferentes.
00: 27: 19.02 E perguntamos, podemos encontrar a molécula que era.
00: 27: 21.14 que é importante para obter essas raízes,
00: 27: 24.09 as raízes dos ramos e as raízes laterais,
00: 27: 27,12 para crescer?
00: 27: 29.08 Para fazer o que fizemos. primeiro fiz foi
00: 27: 31,07 titula o D15
00: 27: 33.21 e encontrou uma concentração que permitiu
00: 27: 35.29 uma certa quantidade de raízes para formar
00: 27: 37,23 - nem todos eles -
00: 27: 39.20 com a ideia de podermos adicionar compostos de volta.
00: 27: 41.13 Estes são compostos diferentes
00: 27: 43.17 que são feitos de beta-caroteno na planta.
00: 27: 46.21 Estes são compostos endógenos.
00: 27: 48.09 Perguntamos se o bloqueamos em 50%,
00: 27: 50.25 adicionado de volta esses compostos um de cada vez,
00: 27: 54.20 podemos encontrar um que realmente
00: 27: 57.07 resgata essa conseqüência das raízes laterais?
00: 28: 00.10 E de todos esses,
00: 28: 02.10 apenas um tinha essa função.
00: 28: 03.23 É algo chamado beta-ciclocitral.
00: 28: 05.26 Beta-ciclocitral, na verdade
00: 28: 09.22 não faz mais branch. sites pré-ramificados,
00: 28: 12.02, mas permite que esses sites pré-ramificação
00: 28: 14.03 que são feitos para crescer.
00: 28: 16.07 E foi capaz de fazer isso
00: 28: 19.17 aumentando a taxa de divisão celular
00: 28: 21.25 nas pontas da raiz.
00: 28: 24.14 Agora, o que descobrimos foi quando o adicionamos ao arroz,
00: 28: 27.09 vimos duas coisas.
00: 28: 29.23 Um é que fez as raízes crescerem mais,
00: 28: 31,28 com mais laterais e laterais mais longas.
00: 28: 34.15 Mas também os fez parecer mais compactos.
00: 28: 37.02 Eles pareciam mais próximos no beta.
00: 28: 40,26 com o.
00: 28: 42.21 tratados com beta-ciclocitral do que no controle.
00: 28: 46.10 E nos perguntamos se isso poderia ter um uso prático.
00: 28: 49.19 Por exemplo, em locais onde há muita irrigação,
00: 28: 53.14 onde a água é retirada do.
00: 28: 56.28 de camadas profundas do solo e, em seguida, pulverizado sobre a superfície do solo,
00: 29: 00.12 não é incomum que a parte superior do solo
00: 29: 03.16 então fica salgado,
00: 29: 05.16 que o. o que foi dissolvido na água da base vem à tona,
00: 29: 10,28 pulveriza,
00: 29: 12,28 e isso produz um gradiente de salinidade
00: 29: 15.07 para que haja muito sal no topo
00: 29: 17.06 e menos sal conforme você desce.
00: 29: 18.26 E perguntamos, se adicionarmos beta-ciclocitral.
00: 29: 20.21 se isso permitir que as raízes cresçam
00: 29: 23.17 mais rápido e mais compacto com arroz.
00: 29: 27.20 se isso ajudaria no crescimento
00: 29: 30.21 em algo como este solo salino.
00: 29: 32.16 Portanto, neste caso, temos um gradiente de solução salina.
00: 29: 35.23 É no topo do solo que
00: 29: 38.24 essas plantas estão crescendo.
00: 29: 40.20 Tínhamos 200 milimolares de sal,
00: 29: 43,24 indo para 0.
00: 29: 45.19 E quando colocamos as plantas em condições normais
00: 29: 47,24 - ou seja, sem beta-ciclocitral -
00: 29: 50.05 eles estão muito infelizes.
00: 29: 51.29 Eles não fazem raízes e não fazem brotos.
00: 29: 53,27 No entanto, se complementarmos a sua rega
00: 29: 56.19 com beta-ciclocitral,
00: 29: 58.01 vemos que podemos obter uma raiz boa e saudável feita,
00h30: 23h23 e a parte aérea da planta parece bem feliz.
00: 30: 03.13 Isso aqui. você pode ver que a profundidade da raiz
00: 30: 05.15 é um pouco maior,
00: 30: 07.09 e a altura do tiro também é um pouco maior.
00: 30: 11,23 Então, para resumir esta parte da minha palestra,
00: 30: 14,17 o que eu mostrei a vocês é que há um processo semelhante ao de um relógio
00: 30: 17,17 que determina a localização das raízes laterais
00: 30: 20.04 ao longo da raiz primária.
00: 30: 23.00 O composto, beta-ciclocitral,
00: 30: 25.04 está envolvido no crescimento da raiz lateral -
00:30:27, 23 fazendo-os crescer para fora.
00: 30: 29.18 E quando adicionado ao arroz,
00: 30: 31.09 beta-ciclocitral estimula o crescimento da raiz
00: 30: 33,22 quando as plantas são cultivadas em solução salina.
00: 30: 36.16 em um gradiente de solo salino,
00: 30: 38.11 provavelmente porque permite que cresça no solo,
00: 30: 41,27 onde há muito sal,
00: 30: 44,11 rápido o suficiente para que entre no solo com menos sal.
00: 30: 47.15 Agora, esta é uma imagem.
00: 30: 50.28 uma foto do meu laboratório,
00: 30: 53.03 as pessoas no meu laboratório almoçando festivamente.
00: 30: 56.04 E então minhas fontes de financiamento para todo esse trabalho.
00: 31: 00.22 E, novamente,
00: 31: 03.10 Eu observaria que há uma primeira parte desta série
00: 31: 05.21 que fala sobre genética de raízes
00: 31: 08.01 e as telas que fizemos para a genética de raízes.

  • Parte 1: Introdução à genética de raízes

Orientação para testes de imunotoxicidade, maio de 1999

Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA
Administração de Alimentos e Medicamentos
Centro de Dispositivos e Saúde Radiológica
Ramo de Biologia Molecular
Divisão de Ciências da Vida
Escritório de Ciência e Tecnologia

Prefácio

Comentário Público

Comentários e sugestões podem ser enviados a qualquer momento para consideração da Agência a, John J. Langone, Ph.D., HFZ-113, 12709 Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852. Os comentários não podem ser levados em consideração pela Agência até que o documento seja próxima revisão ou atualização. Para perguntas sobre o uso ou interpretação deste guia, entre em contato com John J. Langone, Ph.D., pelo telefone 301-443-2911 ou pelo e-mail [email protected]

Cópias Adicionais

Cópias adicionais estão disponíveis na Internet. Você também pode enviar uma solicitação por e-mail para [email protected]hs.gov para receber uma cópia das orientações. Use o documento número 635 para identificar a orientação que você está solicitando.

Orientação para testes de imunotoxicidade 1

Fundo

Em maio de 1995, o Escritório de Avaliação de Dispositivos do Centro de Dispositivos e Saúde Radiológica adotou o Memorando Geral do Programa G95-1. Este guia é uma versão modificada pela FDA do Padrão Internacional ISO-10993, "Avaliação Biológica de Dispositivos Médicos - Parte 1: Avaliação e Teste". Ele fornece uma visão geral dos tipos gerais de testes de toxicidade que devem ser considerados para um dispositivo médico ou materiais constituintes. Na época em que o G95-1 foi adotado, era evidente que orientações adicionais de testes poderiam ser necessárias para a avaliação da toxicidade de um órgão ou sistema individual. Como resultado, a estrutura neste documento foi desenvolvida para focar especificamente nos testes de imunotoxicidade. Deve ser usado em conjunto com o contexto mais amplo de G95-1, como parte da avaliação geral da segurança do produto.

Este guia fornece uma avaliação dos tipos de testes atualmente disponíveis para avaliar os potenciais efeitos adversos dos biomateriais no sistema imunológico. Ele também fornece um processo para selecionar métodos de teste apropriados. O objetivo é obter informações adequadas para ajudar a tomar decisões regulatórias confiáveis, não para estabelecer alegações de que um dispositivo ou material não é imunotóxico. As evidências que apoiam a não imunotoxicidade não estabelecerão a segurança, mas devem fornecer algum nível de garantia de que reações imunotóxicas graves são improváveis.

A estrutura neste guia pretende ser uma ferramenta prática para selecionar os melhores testes, com base em nosso conhecimento atual na área. Ela recomenda fortemente certos testes padronizados e outros testes confiáveis ​​comumente usados ​​(consulte a Tabela 3) por causa da garantia de qualidade adicional que eles fornecem para fins regulatórios. No entanto, como orientação, limita-se a fazer recomendações. Ele não impõe requisitos ao FDA ou à indústria regulamentada.

Testes de imunotoxicidade preditivos adicionais são necessários. À medida que esses métodos se tornam disponíveis, por exemplo, na forma de padrões de consenso, eles também serão recomendados no guia, que será revisado e atualizado periodicamente.

O que queremos dizer com imunotoxicidade

Conforme usado neste documento, imunotoxicidade se refere a qualquer efeito adverso na estrutura ou função do sistema imunológico, ou em outros sistemas como resultado de disfunção do sistema imunológico. Um efeito é considerado adverso ou imunotóxico se prejudicar a imunidade humoral ou celular necessária ao hospedeiro para se defender contra doenças infecciosas ou neoplásicas (imunossupressão) ou se causar dano tecidual desnecessário (autoimunidade, hipersensibilidade ou inflamação crônica). Esta definição incorpora o conceito de que o sistema imunológico está em um equilíbrio complexo que inclui interações com outros sistemas (por exemplo, nervoso e endócrino) que podem utilizar ou ser afetados pelos mesmos mediadores biológicos (por exemplo, neuropeptídeos e hormônios esteróides).

"Mudança" em uma função imunológica ou nível de mediador imunológico pode não aparecer necessariamente como um "efeito adverso", mas sim como imunoestimulação. Deve-se ter cuidado nesses casos, porque um aumento não específico da resposta imune que pode ser interpretado como um efeito benéfico pode resultar na supressão da imunidade específica contra uma infecção particular.

A decisão sobre se um material / dispositivo é imunotóxico deve basear-se nas evidências disponíveis de resultados de testes pré-clínicos e avaliação clínica, bem como na história prévia de uso. Como os dados disponíveis muitas vezes não são conclusivos, o bom senso desempenha um papel importante na avaliação do risco imunotóxico.

Propósito

O objetivo desta orientação é fornecer aos revisores e fabricantes da FDA uma abordagem sistemática para avaliar os potenciais efeitos imunológicos adversos de dispositivos médicos e materiais constituintes. Ele fornece uma estratégia coerente para estabelecer a necessidade de testes de imunotoxicidade e orienta o usuário nas etapas envolvidas na decisão de quais testes específicos devem ser realizados.

Um objetivo importante ao projetar esta orientação foi otimizar os requisitos de teste. Embora novos estudos possam ser necessários para um determinado produto, os revisores e fabricantes são encorajados a usar os dados disponíveis para minimizar os testes. Os dados disponíveis são relevantes se fornecerem as informações necessárias para determinar o risco imunotóxico associado ao uso pretendido do dispositivo ou material, levando-se em consideração a população de pacientes indicada. As fontes de tais informações incluem literatura científica, bancos de dados, padrões nacionais e internacionais reconhecidos e orientações e documentos relacionados de dentro e fora do FDA. Os fabricantes são incentivados a discutir os testes propostos com a FDA para garantir que apenas os testes apropriados e essenciais sejam realizados.

O sistema imunológico é flexível e muitas vezes capaz de utilizar fatores e mecanismos alternativos para compensar as deficiências de uma função imunológica específica. Por essa razão, os testes em modelos animais apropriados podem fornecer um quadro mais preciso da competência do sistema imunológico e uma indicação mais relevante do potencial imunotóxico do que os testes in vitro em que podem faltar mecanismos alternativos compensatórios. No entanto, se uma base científica sólida puder ser fornecida sobre o motivo pelo qual os testes in vitro serão suficientes, então seu uso é encorajado para minimizar despesas e números de animais experimentais.

Formato

A orientação consiste em um fluxograma e três tabelas que seguem o formato G95-1 (ou seja, ISO 10993). O fluxograma é usado para determinar se o teste de imunotoxicidade é provavelmente necessário e inclui a opção de fornecer uma justificativa para a não realização do teste com base nos dados publicados disponíveis ou outras fontes de informação nos mesmos materiais ou semelhantes. Essa abordagem incorpora explicitamente os resultados de estudos existentes e cientificamente sólidos ao processo de tomada de decisão.

Como usar esta orientação

Fluxograma para teste de imunotoxicidade

O fluxograma deve ser usado primeiro para determinar se o teste de imunotoxicidade pode ser necessário para apoiar a segurança do dispositivo. O teste geralmente será apropriado para novos materiais ou quando houver preocupação de que os materiais já em uso para os quais os testes adequados não foram realizados podem ser imunotóxicos. O teste de imunotoxicidade pode não ser necessário se o material do dispositivo for o mesmo que em um dispositivo legalmente comercializado, tiver o mesmo contato corporal, dose e duração e houver um longo histórico de uso sem toxicidade relatada ou dados científicos de domínio público que justifiquem a falta de toxicidade. Se o teste de imunotoxicidade foi realizado conforme especificado em G95-1 / ISO 10993 como parte da avaliação de segurança geral, ele não precisa ser repetido. No entanto, o fluxograma pode ser usado para determinar se o teste de imunotoxicidade adicional é recomendado além do que está especificado em G95-1 / ISO 10993.

A decisão sobre se dados de segurança suficientes estão disponíveis para materiais com um uso pretendido diferente de um uso aprovado será feita caso a caso.

Mesas

Quando o fluxograma indica que o teste de imunotoxicidade é recomendado, as Tabelas 1-3 são usadas sequencialmente para determinar os tipos de teste que podem ser usados ​​para ajudar a avaliar a segurança do produto consistente com o uso pretendido e a população de pacientes indicada e risco esperado versus benefício. Eles se destinam a capturar os efeitos imunológicos adversos e respostas mais importantes que podem estar associados a dispositivos e materiais médicos, ao mesmo tempo que fornecem flexibilidade na decisão de quais testes de imunotoxicidade específicos, se houver, serão realizados.

Tabela 1 EFEITOS IMUNOTÓXICOS POTENCIAIS DE DISPOSITIVOS E MATERIAIS CONSTITUENTES

NOME DO DISPOSITIVO: _______________________________

CONTATO CORPORAL DURAÇÃO DO CONTATO EFEITOS IMUNOTÓXICOS
1 2 3 4 5
Dispositivos de superfície - Pele UMA pmbx x
B pmbx x x x x
C pmbx x x x x
Membranas mucosas UMA pmbx x
B pmbx pmbx mbx x x
C pmbx pmbx mbx mbx mbx
Superfície rompida ou comprometida UMA pmbx x
B pmbx pmbx mbx mbx mbx
C pmbx pmbx mbx mbx mbx
Dispositivos de comunicação externos - dispositivos externos que entram em contato com o sangue circulante (por exemplo, dialisadores e imunoadsorventes) ou a via sanguínea indiretamente em um ponto e servem como um conduto para a entrada no sistema vascular (por exemplo, conjuntos de administração de solução e sangue) ou tecido / osso / dentina (por exemplo, grampos de pele, laparoscópios, materiais de preenchimento dentário) Caminho de Sangue,
Direto e indireto
UMA pmbx x
B pmbx pmbx mbx pmbx mbx
C pmbx pmbx mbx pmbx mbx
Tecido / osso / comunicação dentina UMA pmbx x
B pmbx cpmbx mbx pmbx mbx
C pmbx cpmbx mbx pmbx mbx
Dispositivos de Implante - Tecido / osso, sangue e outros fluidos corporais UMA pmbx x
B pmbx cpmbx mbx pmbx mbx
C pmbx cpmbx mbx pmbx mbx

A = limitada (
B = Prolongado (& gt24 horas a 30 dias)
C = Permanente (& gt30 dias)

1 = Hipersensibilidade
2 = Inflamação Crônica
3 = Imunossupressão
4 = Imunoestimulação
5 = Autoimunidade

Efeitos esperados para vários materiais:
Plásticos e outros polímeros = p
Metais = m
Cerâmica, vidros, compósitos = c
Materiais Biológicos = b
Outros materiais (especifique) = x

A Tabela 1 fornece um guia para os potenciais efeitos imunotóxicos que podem estar associados a materiais de dispositivos médicos. Ele segue o esquema de classificação ISO conforme especificado no FDA General Program Memorandum (Blue Book Memo) G95-1 com base no tipo e duração do contato corporal. Esses efeitos imunotóxicos básicos foram priorizados com base na frequência de ocorrência, duração e gravidade da reação. Por meio dessa abordagem, a Tabela 1 explica as principais reações imunotóxicas que podem ser encontradas com materiais de dispositivos médicos e equilibra a necessidade de ser inclusivo, ao mesmo tempo que minimiza a complexidade.

O glossário a seguir define os efeitos imunotóxicos mostrados na Tabela 1. Informações adicionais podem ser encontradas nas "Referências gerais" listadas no final do guia.

  1. HIPERSENSIBILIDADE: aumento da reatividade a um antígeno ao qual uma pessoa (ou animal) foi previamente exposta, com um efeito adverso em vez de protetor, às vezes usado como sinônimo de alergia. Este guia inclui apenas reações do tipo I (anafiláticas), que são mediadas por anticorpos IgE, e reações do tipo IV (hipersensibilidade tardia) mediadas por linfócitos T, porque são as mais comuns. As reações do tipo I também são as mais graves. As reações de tipo II e tipo III envolvem anticorpos (IgG ou IgM, mas não IgE) e complemento, mas são relativamente raras e têm menor probabilidade de ocorrer com dispositivos / materiais médicos.
  2. INFLAMAÇÃO CRÔNICA: A inflamação é a resposta normal do tecido à lesão local. A inflamação aguda tem vida relativamente curta (dias) e é caracterizada por neutrófilos como o infiltrado celular primário. Em contraste, a inflamação crônica pode durar meses ou mais e é caracterizada pela infiltração de macrófagos e linfócitos. A inflamação crônica pode levar à formação de granuloma imunológico e consequências imunológicas mais graves, como doença autoimune.
  3. IMUNOSUPPRESSÃO: Inibição da resposta imune adaptativa (ou seja, respostas de anticorpos e células T), uma consequência potencial é mais frequente e infecções graves resultantes da redução da defesa do hospedeiro.
  4. IMUNOSTIMULAÇÃO: Ativação indesejada ou inadequada de antígeno específico ou não específico do sistema imunológico. Para esta orientação, a imunoestimulação inclui a.) Imunogenicidade não intencional de biomateriais (por exemplo, anticorpo e / ou resposta imune celular a uma proteína estranha), e b.) Adjuvância, aumento da resposta imune a um antígeno por um material com o qual é misturado ex vivo ou in situ.
  5. AUTOIMUNIDADE: Resposta imune aos constituintes do próprio corpo (autoantígenos).Uma resposta autoimune, indicada pela presença de autoanticorpos ou linfócitos T reativos com o tecido do hospedeiro ou antígenos celulares, pode (mas não necessariamente) resultar em doença autoimune com lesão crônica, debilitante e, às vezes, fatal de tecidos e órgãos. Em alguns casos, os autoantígenos específicos podem não ser caracterizados ou conhecidos.

A inflamação crônica e a imunoestimulação foram incluídas na Tabela 1 junto com os efeitos imunológicos adversos mais geralmente reconhecidos: hipersensibilidade, imunossupressão e autoimunidade. Embora a inflamação faça parte do processo normal de cicatrização de feridas, a inflamação crônica, especialmente com implantes prolongados ou permanentes, precisa ser avaliada porque pode levar ao afrouxamento dos implantes fixados ao osso, formação de cápsula densa ou pseudocápsula ou outros efeitos graves. A imunoestimulação foi incluída separadamente da hipersensibilidade para explicar explicitamente outra atividade imunológica intensificada que pode levar a consequências clínicas graves. Os exemplos incluem imunogenicidade de materiais biológicos ou outros, ou atividade adjuvante que pode não resultar em sinais adversos em experimentos com animais de prazo relativamente curto, mas são motivo de preocupação com implantes de longo prazo ou exposição repetida a materiais injetados que podem resultar em sensibilização ou autoimunidade.

Para esta tabela, os materiais para dispositivos médicos foram colocados em quatro categorias que são amplas o suficiente para incluir a maioria dos tipos de materiais para dispositivos. Os materiais foram atribuídos às caixas com base no contato corporal e duração e seu potencial para produzir os efeitos imunotóxicos indicados. Uma pesquisa na literatura científica e médica foi usada como base primária para fazer essas atribuições.

Uma opção para "Outros materiais" que não se enquadram nas outras quatro categorias também está incluída. Os exemplos incluem estabilizadores químicos de baixo peso molecular, agentes de reticulação para polímeros e produtos de degradação. Esses constituintes, que podem estar presentes ou produzidos em quantidades vestigiais (por exemplo, partes por milhão), devem ser avaliados quanto ao seu potencial para produzir efeitos imunológicos adversos caso a caso. Esta abordagem é consistente com um método em desenvolvimento no CDRH para a avaliação da toxicidade sistêmica, cujas marcas são a caracterização química dos materiais usados ​​no dispositivo e uma avaliação da probabilidade de que esses constituintes produzam efeitos sistêmicos em humanos. "Outros materiais" foram colocados na maioria das categorias de "Contato corporal" e "Duração", uma vez que essas categorias não podem ser excluídas sem dados que sustentem a falta de imunotoxicidade.

Mesa 2 CLASSIFICAÇÃO DE RESPOSTAS IMUNES ASSOCIADAS A POTENCIAIS EFEITOS IMUNOTÓXICOS

EFEITOS IMUNOTÓXICOS RESPOSTAS IMUNES
HISTOPATOLOGIA RESPOSTA HUMORAL RESPOSTAS CELULARES RESISTÊNCIA DO HOST OBSERVE PARA SINAIS DE DOENÇA
CÉLULAS T CÉLULAS ASSASSINAS NATURAIS MACRÓFAGOS GRANULÓCITOS *
1 HIPERSENSIBILIDADE NC C
(IgE em reações do tipo I apenas)
C
(Apenas reações tipo IV)
N / D N / D C N / D C
2 INFLAMAÇÃO C NC C N / D C C N / D C
3 IMUNOSUPPRESSÃO NC C C C C C C C
4 IMUNOSTIMULAÇÃO NC C C N / D NC N / D NC C
5 AUTOIMUNIDADE ** C C C N / D N / D NC N / D C

C = Crítico
NC = Não Crítico
NA = Não aplicável ou desnecessário

* Basófilos, eosinófilos e / ou neutrófilos
** O teste de rotina para autoimunidade não é recomendado (veja o texto).

A Tabela 2 fornece um conjunto de respostas que são comumente associadas aos efeitos imunotóxicos de referência. Quando a Tabela 1 indica que um ou mais efeitos adversos podem estar associados a um material do dispositivo, a Tabela 2 é usada para enfocar os tipos de teste que podem fornecer indicações imunotóxicas associadas a esses efeitos. Como na Tabela 1, as classificações são suficientemente amplas para abranger as respostas predominantes associadas aos efeitos imunotóxicos. As respostas na Tabela 2 são designadas como críticas (C) ou não críticas (NC). Crítico indica que há uma importância primária no teste dessas respostas como indicações de imunotoxicidade. O teste de respostas não críticas pode ser necessário para uma avaliação de segurança adequada, por exemplo, quando os testes críticos são positivos. Em geral, quaisquer sinais de disfunção do sistema imunológico devem ser registrados, mesmo que as observações não tenham sido incluídas como parte de um protocolo formal de estudo. Estudos apropriados devem ser considerados para entender a base para essas respostas.

TABELA 3 EXEMPLOS DE TESTES, INDICADORES E MODELOS PARA AVALIAÇÃO DE RESPOSTAS IMUNES *

RESPOSTAS IMUNES ENSAIOS FUNCIONAIS MEDIADORES SOLÚVEIS FENOTIPAGEM DE OUTROS**
HISTOPATOLOGIA N / D N / D Marcadores de superfície celular Morfologia
RESPOSTA HUMORAL Imunoensaios (por exemplo, ELISA) para a resposta do anticorpo ao antígeno mais adjuvante *
Células formadoras de placas
Proliferação de linfócitos
Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos
Anafilaxia cutânea passiva
Anafilaxia direta
Complemento (incluindo anafilatoxinas C3a e C5a) *, complexos imunológicos Marcadores de superfície celular
RESPOSTAS CELULARES
CÉLULAS T Teste de maximização de cobaia *
Ensaio de linfonodo local em camundongo *
Teste de inchaço na orelha de camundongo
Proliferação de linfócitos
Reação de linfócitos mistos
Padrões de citocinas indicativos de subconjuntos de células T (por exemplo, Th1 e Th2) Marcadores de superfície celular (células T auxiliares e citotóxicas)
CÉLULAS ASSASSINAS NATURAIS Citotoxicidade tumoral N / D Marcadores de superfície celular
MACRÓFAGOS Fagocitose *
Apresentação de antígeno
Citocinas (IL-1, TNF-alfa, IL-6, TGF-beta) Marcadores MHC
GRANULÓCITOS *** Degranulação
Fagocitose
Quimiocinas, aminas bioativas, citocinas inflamatórias, enzimas N / D Citoquímica
RESISTÊNCIA DO HOST Resistência a bactérias, vírus e tumores N / D N / D
SINAIS DE DOENÇA N / D N / D N / D Alergia, Erupção cutânea, Urticária, Edema, Linfadenopatia

NA = Não aplicável ou desnecessário

* Indica os testes mais comumente usados. Os ensaios funcionais são geralmente mais importantes do que os testes de mediadores solúveis ou fenotipagem. As referências no final deste guia fornecem protocolos de teste detalhados.

** Modelos animais de algumas doenças autoimunes humanas estão disponíveis (consulte as referências no final do guia). No entanto, testes de rotina para indução de doenças autoimunes por materiais / dispositivos não são recomendados.

*** Basófilos, eosinófilos e / ou neutrófilos

A Tabela 3 fornece exemplos dos tipos específicos de testes que podem ser usados ​​para estudar as respostas listadas na Tabela 2. Esses exemplos selecionados são apenas representativos do grande número de testes que estão disponíveis atualmente. Os ensaios funcionais fornecem uma medida mais direta da atividade do sistema imunológico e geralmente são mais importantes do que os testes de mediadores solúveis, que são mais importantes do que a fenotipagem. A lista provavelmente irá evoluir à medida que novas e aprimoradas tecnologias são desenvolvidas e marcadores adicionais diretos ou indiretos de respostas imunes são validados e seu valor preditivo documentado. Exemplos de sinais de doença, bem como modelos animais (ensaios de resistência do hospedeiro) para estudar as respostas imunológicas também estão incluídos.

O objetivo desta tabela é facilitar a escolha dos testes, não ser inclusivo ou servir de prescrição para protocolos de teste que os fabricantes devem seguir. As referências da literatura sobre "Teste de imunotoxicidade" no final deste guia fornecem informações detalhadas sobre a seleção e o desempenho de uma variedade de procedimentos de teste que são amplamente usados ​​e considerados válidos. Um teste válido é aquele que demonstrou fornecer resultados precisos e reproduzíveis que são verdadeiramente indicativos do efeito que está sendo estudado.

A Tabela 3 cobre um grande número de procedimentos in vitro e in vivo para medir mudanças em variáveis ​​indicativas de efeitos imunotóxicos. No entanto, um requisito comum é garantir uma base estatística sólida no desenho do estudo que permitirá que as diferenças entre os grupos de teste e controle sejam medidas em um nível desejado de significância estatística (geralmente no nível p & lt 0,05). = "" Também, = "" in = "" all = "" studies = "" care = "" should = "" be = "" taken = "" to = "" mimic = "" as = "" de perto = "" as = "" possível = "" o = "" pretendido = "" usar = "" com = "" consideração = "" para = "" rota = "" de = "" exposição / local = "" de = "" implantação, = " "dose =" "e =" "& gt

Os resultados dos testes de imunotoxicidade pré-clínica devem ser usados ​​para ajudar a avaliar a biocompatibilidade dos materiais como parte da avaliação geral da segurança dos dispositivos médicos. Indicações significativas de imunotoxicidade podem sugerir que estudos de função imunológica devem ser incluídos em ensaios clínicos e estudos pós-comercialização.

Espera-se que os fabricantes sejam seletivos e utilizem testes de imunotoxicidade que sejam apropriados, tecnicamente válidos e preditivos. Ou seja, os testes devem ser úteis na avaliação da atividade imunotóxica em relação às respostas particulares e aos efeitos imunotóxicos em questão, e devem ser suficientemente sensíveis e específicos para produzir dados válidos. Na Tabela 3, os testes mais comumente usados ​​como indicadores de uma resposta imune particular são marcados com um asterisco (*) (por exemplo, imunoensaios em "Resposta Humoral"). Outros testes alternativos válidos são mostrados e também podem ser considerados. As referências no final do Guia (Teste de Imunotoxicidade) fornecem detalhes sobre os protocolos experimentais e a análise e interpretação dos resultados do teste.

Deve-se observar que as tabelas serão utilizadas principalmente para novos materiais, pois o Fluxograma deve isentar a grande maioria dos materiais já em uso. O teste pode ser necessário para materiais atualmente usados ​​em dispositivos médicos se eles tiverem uma duração de contato corporal diferente ou mais longa, ou se a exposição a doses maiores for esperada do que nas aplicações atuais.

A imunogenicidade envolvendo uma resposta imune específica a um biomaterial é uma consideração importante porque pode levar a efeitos adversos graves. Por exemplo, uma proteína estranha (isto é, não humana) pode induzir anticorpos IgE que causam uma reação de hipersensibilidade anafilática (Tipo I). Um exemplo é a proteína látex. Além disso, compostos de baixo peso molecular, e. os aceleradores químicos usados ​​na fabricação de luvas de látex podem induzir uma reação mediada por células T (Tipo IV), resultando em dermatite de contato. Os testes de hipersensibilidade do Tipo I (por exemplo, IgE específica ao antígeno) e do Tipo IV (por exemplo, teste de maximização da cobaia) devem ser considerados para materiais com potencial para causar essas reações alérgicas.

Além das reações de hipersensibilidade, um biomaterial pode desencadear respostas auto-imunes (ou seja, anticorpos ou células T que reagem com os próprios constituintes do corpo). Uma resposta autoimune pode levar a consequências patológicas (ou seja, doença autoimune). Por exemplo, uma proteína estranha pode induzir anticorpos IgG ou IgM que reagem de forma cruzada com uma proteína humana e causar danos ao tecido ao ativar o sistema complemento. Da mesma forma, um biomaterial (por exemplo, um gel ou óleo) agindo como um adjuvante pode induzir uma resposta autoimune prejudicial.

Testes confiáveis ​​para autoanticorpos (por exemplo, ELISA) e células T autorreativas (por exemplo, proliferação de linfócitos) estão disponíveis, e vários modelos animais foram desenvolvidos para estudar certas doenças autoimunes humanas. No entanto, autoanticorpos e linfócitos T autorreativos podem ser apenas indicadores de uma resposta autoimune. Mesmo que uma resposta autoimune possa ser demonstrada em testes pré-clínicos, é difícil obter evidências convincentes de que um biomaterial causa doença autoimune em animais. Portanto, testes de rotina para indução de doenças autoimunes em modelos animais não são recomendados. O teste de autoimunidade em animais pode ser garantido se o uso de longo prazo de um biomaterial for suspeito de causar doença autoimune em humanos. No entanto, espera-se que esses casos sejam extremamente raros. O teste de autoimunidade é uma área adicional em que a discussão com imunologistas / imunotoxicologistas do FDA deve ser útil. As referências no final deste guia fornecem mais informações sobre este tópico.

Suporte de revisor adicional

Além desta orientação e do G95-1, existem outras fontes impressas e computadorizadas de informações que fornecem detalhes didáticos e técnicos detalhados sobre os testes de imunotoxicidade. Várias referências úteis aparecem no final deste guia. Detalhes importantes incluem informações básicas sobre a sensibilidade do teste, especificidade e valor preditivo, protocolos básicos e alternativos, variáveis ​​críticas, resultados previstos, considerações de tempo, resolução de problemas técnicos e referências da literatura primária. Essas informações estarão à disposição dos revisores.

As consultas com imunologistas e imunotoxicologistas no CDRH e em outros centros também fornecerão aos revisores informações úteis sobre o desempenho dos testes de imunotoxicidade e avaliação de dados. Para melhorar a comunicação e a disponibilidade de conhecimento técnico, um "Recurso de Especialização em Imunotoxicologia" está disponível na página inicial da Intranet do CDRH (www.cdrh.fda.gov) que fornece aos revisores acesso a indivíduos em toda a Agência com uma ampla gama de especialização em imunotoxicologia. Isso é além de uma discussão moderada / capacidade de conferência chamada IMMUNOTOX disponível no FDA que fornece um fórum confidencial para a discussão de questões de revisão regulatória em imunologia / imunotoxicologia. Todos esses recursos devem ser utilizados por revisores para facilitar o processo de revisão.

O que a orientação não faz

Este guia fornece orientações sobre os tipos de testes de imunotoxicidade que devem ser considerados para biomateriais. Não é um plano para estabelecer requisitos de teste para materiais / dispositivos. Não prescreve quais testes devem ser realizados ou os protocolos que devem ser seguidos. Nem especifica ou restringe as fontes de informação que podem ser usadas para apoiar uma alegação de que um material não é imunotóxico, embora seja necessário tomar cuidado para garantir que a base para tal alegação repousa em fortes evidências científicas e não depende de propriedade dados sem o direito de referência apropriado. Ao incorporar flexibilidade na tomada de decisões, a orientação se baseia em um bom senso para determinar a necessidade de testes de imunotoxicidade e os testes apropriados que ajudarão a fornecer dados necessários e suficientes para apoiar a segurança do produto.

REFERÊNCIAS

Em geral

"Illustrated Dictionary of Immunology" (Cruse, JM e Lewis, RE, Eds) CRC Press, Boca Raton (1995).

Benjamini, E, Sunshine, G e Leskowitz, S: "Immunology: A Short Course", (3ª edição) Wiley-Liss, Inc., New York (1996).

Janeway, Jr., CA e Travers, P: "Immunobiology: The Immune System in Health and Disease", (3ª Edição) Current Biology-Garland, New York (1997).

Modelos animais de doença autoimune

Rose, NR: "Immunologic Diagnosis of Autoimmune Disease" in "Handbook of Human Immunology" (Lefell, MS, Donnenberg, AD e Rose, NR, Eds) CRC Press, Boca Raton (1997), pp. 111-123.

"Autoimmune Disease Models: A Guidebook" (Cohen, IR e Miller, A, Eds) Academic Press, New York (1994).

"Handbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases" (Vol. I) (Greenwald, RA e Diamond, HS, Eds) CRC Press, Boca Raton (1988).

Teste de Imunotoxicidade

As referências a seguir fornecem informações sobre testes de imunotoxicidade, incluindo metodologia, aplicações e avaliação de dados. Embora a lista não seja abrangente, ela fornece uma base didática e detalhes técnicos que os revisores e fabricantes devem considerar úteis. Freqüentemente, são incluídas referências primárias a artigos originais.

"Clinical Diagnostic Immunology: Protocols in Quality Assurance and Standardization", (Nakamura, RM, Burek, CL, Cook, L, Folds, JM e Sever, JL, Eds) Blackwell Science, Inc., Malden (1998).

"Manual of Clinical Laboratory Immunology", (5ª Edição) (Rose, NR, de Mecario, EC, Folds, JD, Lane, HC e Nakamura, RM, Eds) ASM Press, Washington (1997).

"Experimental Immunotoxicology" (Smialowicz, RJ e Holsapple, MP, Eds) CRC Press, Boca Raton (1996).

"Methods in Immunotoxicology" (Burleson, GR, Dean, JH e Munson, AE, Eds) Wiley-Liss, New York (1995).

"Current Protocols in Immunology" (Coligan, JE, Kruisbeek, AM, Margulies, DH, Shevach, EM e Strober, R, Eds) Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, New York (1992). Suplementado periodicamente com métodos novos ou atualizados.

1 Este documento tem como objetivo fornecer orientação. Representa o pensamento atual da Agência sobre o acima exposto. Ele não cria ou confere quaisquer direitos para ou sobre qualquer pessoa e não opera para vincular a FDA ou o público. Uma abordagem alternativa pode ser usada se tal abordagem satisfizer os requisitos da lei aplicável, regulamentos ou ambos.


NÃO TOME A VACINA COVID

Caros leitores: Espero tirar o fim de semana de folga, então aqui está sua leitura de fim de semana. Junto com minha coluna de hoje & # 8212 https://www.paulcraigroberts.org/2021/02/19/the-covid-deception-serves-an-undeclared-agenda/ & # 8212 e ontem & # 8211 https: // www.paulcraigroberts.org/2021/02/18/the-covid-pandemic-is-the-result-of-public-health-authorities-blocking-effective-treatment/ & # 8212 você terá informações muito melhores do que você pode obtenha da mídia, das burocracias de saúde e de seu médico. Uma leitura dessas informações no fim de semana vai resultar em você extremamente bem informado e, portanto, mais capaz de tomar decisões inteligentes sobre saúde. É motivo de preocupação que autoridades independentes sejam ignoradas e censuradas, evitando assim a discussão pública informada e permitindo que um estabelecimento controle a explicação.

NÃO TOME A VACINA COVID

Espero que minha última coluna tenha levantado sua suspeita de que a resposta de bloqueio, máscara e vacina a Covid tem um propósito ulterior. Caso contrário, talvez a postagem recente de Mike Whitney seja: https://www.unz.com/mwhitney/coronapocalypse-big-pharmas-doomsday-vaccine-666/

Coronapocalypse & # 8211Big Pharma & # 8217s Doomsday Vaccine

Este é o seu quebra-cabeças de vacinas para o dia:

O que o Dr. Barton Williams, Hank Aaron e 46 idosos residentes em uma casa de repouso espanhola têm em comum?

Resposta— Todos morreram logo após receber a vacina Covid-19.

Mas não tiremos conclusões precipitadas, afinal, em todos os casos, a mídia nos garantiu que a vacina não teve nada a ver com suas mortes. Você acredita nisso?

Claro que não, mas isso provavelmente não vai prejudicar sua confiança nas vacinas porque, como você sabe, não confiar nas vacinas é o mesmo que colocar um chapéu de papel alumínio e falar teorias conspiratórias sobre anéis de pedófilos no porão de pizzarias. É uma loucura absoluta. Nunca se deve questionar a integridade inabalável das grandes empresas farmacêuticas que apenas produzem essas drogas milagrosas por razões puramente filantrópicas. É inconcebível que essas misturas experimentais - que nunca foram testadas em animais ou submetidas a testes de longo prazo - possam ter sido criadas para fins políticos em vez de medicinais.Isso é mesmo remotamente possível?

Sim, é possível, mas também é outra teoria da conspiração maluca, então cale a boca e leve o jab, certo?

Errado, porque tudo sobre a vacina Covid está errado, assim como tudo sobre Covid-mania está errado. É tudo sem precedentes, suspeito e, francamente, estranho. Nada passa no teste de cheiro, nada disso. Quando é que alguma vez bloqueámos o país inteiro para travar a propagação de um vírus? Quando nós já colocamos 300 milhões de pessoas saudáveis ​​em quarentena, ordenamos que todos usassem máscaras, fechamos negócios, bares e escolas e empurramos a economia para um penhasco?

Quando os especialistas em saúde pública e seus aliados democratas usurparam os poderes de emergência e governados por decreto do Executivo, essencialmente provocando um curto-circuito nos poderes constitucionais das legislaturas estaduais?

Quando a mídia e os Tech Giants removeram cientistas, epidemiologistas, virologistas e estatísticos de suas plataformas porque suas visões profissionais entraram em conflito com a “narrativa oficial” sem sentido de farsantes de avental branco como Tony Fauci?

Quando as agências estaduais participaram ativamente da purificação das contas de indivíduos cujas opiniões não apóiam a vacinação em massa de milhões de pessoas com um coquetel tóxico que pode ou não afetar a saúde a longo prazo, a fertilidade e, sim, a própria vida?

Quando uma organização de mídia gigante, como a AP, lançou um ataque de página inteira contra “teóricos da conspiração” cujas visões sobre as origens obscuras da infecção de Covid não correspondem às suas? (“Os propagadores por trás das principais teorias de conspiração do COVID-19“, The Seattle Times) E por que isso importa para eles? Os HSH são tão inseguros que sentem que devem depreciar cruelmente as pessoas de quem discordam, em vez de fornecer relatórios detalhados e objetivos? E como esse comportamento maldoso afeta o público? As pessoas querem ver seus meios de comunicação agirem como aplicadores da doutrina do estado, visando e esmagando qualquer um que não repita a doutrina do partido? Eles gostam quando os jornalistas se tornam cães de ataque para o establishment político e a grande indústria farmacêutica? É por isso que temos uma Primeira Emenda?

Mas - tirando a mídia - a experiência do ano passado foi completamente estranha, não foi? E, ainda assim, se alguém simplesmente especular sobre o que eles acham que pode estar causando a estranheza, eles são imediatamente manchados, censurados e arrastados pela lama por um exército de trolls. Tanto para a liberdade de expressão, hein?

Isso é normal ou alguém tem muito medo de estar perdendo o controle sobre o "giro" das informações? Essa é a reação que se esperaria de alguém que está acostumado a monopolizar informações e está determinado a não compartilhar esse poder com mais ninguém. É também o comportamento de alguém que não está sendo completamente franco sobre seus objetivos, alguém que tem algo a esconder.

Então, o que eles estão escondendo? Quem está puxando os cordões da mídia? Quem dá a Fauci e aos governadores democratas suas ordens de marcha? Quem está comandando este fiasco pandêmico ou você não está nem um pouco curioso?

Imagine por um minuto que tudo o que estamos experimentando atualmente não é a resposta aleatória de um governo que está tentando lidar com uma crise espinhosa e estressante, mas parte de um plano mais amplo para gerar o máximo de histeria possível a fim de criar um público submisso que clica em seus saltos e segue ordens sem questionar? Isso é muito rebuscado?

E digamos que no auge da histeria, um raio apareça no céu noturno e de repente haja uma droga milagrosa, uma vacina, que promete libertar as pessoas de sua miséria coletiva e devolvê-las com segurança à vida normal . Não te parece um pouco coincidente? Ah, sim, e não vamos esquecer que esta vacina salva-vidas foi inventada poucos dias após a eleição presidencial. (Nada para ver aqui, siga em frente.) Quase parece que fazia parte de um script, mas isso não poderia ser verdade, porque isso significaria que nossos líderes estão tramando malfeitores desonestos em quem não se pode confiar. Perece o pensamento.

Mas pergunte a si mesmo: quem está promovendo essa nova droga maravilhosa e insistindo que todas as 7 bilhões de pessoas no planeta sejam vacinadas? São os cientistas, virologistas e epidemiologistas que não têm cachorro na luta e cujos julgamentos são baseados apenas na ciência, ou são os burocratas estaduais em conflito, os bajuladores da saúde pública e bilionários benfeitores que buscam acesso à biologia pessoal de toda a humanidade a fim de efetuar as mudanças que eles acreditam que reduzirão a população mundial e reverterão a aceleração projetada da mudança climática? Qual é?

E por que - você pode perguntar - esses ativistas do clima bilionários e benfeitores se decidiram pela saúde pública quando sua verdadeira paixão é o despovoamento e o aquecimento global?

Não é porque eles identificaram as vacinas como o ponto de acesso de que precisam para realizar suas ambições? Não é por isso que eles passaram décadas criando a infraestrutura crítica para as organizações globais de saúde pública, não para melhorar a vida e a saúde de mães e crianças empobrecidas na África e na Índia, mas para expandir e reforçar os tentáculos desta nova vacina internacional. hidra de implantação que pode alcançar toda a terra e atrair todos os seres humanos para suas garras oleosas.

Esta não é uma teoria da conspiração. Essa infraestrutura realmente existe e foi amplamente expandida e fortalecida na última década. Mas por que?

Eu diria que essa infraestrutura não foi meticulosamente montada para salvar a humanidade do “vírus assassino”, mas para implementar uma estratégia de inserção de agulhas nos braços de 7 bilhões de pessoas. Isso não é filantropia. Isso é algo totalmente diferente. Algo calculista, dissimulado e sinistro. Mas esta é apenas minha opinião.

Claro, é tudo uma teoria da conspiração maluca e mesmo que esteja acontecendo, não está realmente acontecendo porque nossos verdadeiros proprietários e nosso novo Czar da Realidade já decidiram que isso não está acontecendo. Na verdade, eles estão procurando por meio da Internet para “desaparecer” qualquer um que se atreva a mencionar o que eles acham que está realmente acontecendo. Dito isso, ainda devemos reconciliar todas as inconsistências, meias-verdades e mentiras completas com o fato de que as pessoas estão morrendo depois de receberem a injeção. Esse é o único fato que não pode ser negado.

Então, como podemos resolver essas inconsistências? Como explicamos o estado de emergência permanente que só serve para fortalecer o poder dos tiranos e seus lacaios, como reconciliamos os bloqueios, as máscaras, o fechamento de escolas e a obliteração deliberada de nossa civilização por um vírus que mata apenas 1 em cada 400 pessoas infectadas? [Mata porque o tratamento eficaz é evitado: https://www.paulcraigroberts.org/2021/02/18/the-covid-pandemic-is-the-result-of-public-health-authorities-blocking-effective-treatment /]

É impossível. Isso não pode ser feito. Quando o governo enlouquece e perde a confiança do povo, os céticos apresentam teorias que explicam o que está acontecendo. É natural. E é isso que está acontecendo agora.

Quanto às vacinas, bem, sabemos que profissionais conceituados nos alertaram que essas injeções de zumbis podem afetar a fertilidade, a saúde e a mortalidade, mas isso é provável? Afinal, os especialistas, celebridades e mídia estão promovendo essas vacinas de mRNA com mais exuberância do que qualquer lançamento de produto da Madison Avenue na história. Talvez devêssemos deixar nossas preocupações de lado e seguir o fluxo. Afinal, o que pode dar errado? Verifique isso, exceto em uma entrevista com o Dr. Chris Shaw, Ph.D, Especialista em Neuroplasticidade e Neuropatologia. Aqui está o que ele disse:

“O construto PEG revestido de mRNA com lipídios - pelo próprio estudo da Moderna - não fica localizado, mas se espalha por todo o corpo, incluindo o cérebro. Encontrado em estudos com animais na medula óssea, cérebro, nódulos linfáticos, coração, rins, fígado, pulmões, etc. Os médicos estão dizendo que a vacina NÃO atravessa a barreira hematoencefálica, mas isso NÃO é verdade. ... Se chegar ao cérebro, haverá uma resposta autoimune que causará inflamação. O que caracteriza virtualmente todas as doenças neurodegenerativas é esta proteína mal dobrada que é característica da doença de Lou Gerrigs, do Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, etc. São proteínas diferentes , mas eles tendem a formar essas folhas de proteínas mal dobradas chamadas de folhas beta. Agora você está pedindo às células em várias partes do corpo - incluindo o cérebro - que façam muitas dessas proteínas e as liberem para o exterior e, temos certeza de que é isso que tudo está fazendo? Você está obtendo aglomerados de proteínas mal dobradas dentro dos neurônios? Isso seria uma coisa ruim de se fazer. Então, você gostaria de saber onde está, quanto existe e quais grupos de neurônios são direcionados. .e esses são os tipos de questões que você gostaria que as empresas resolvessem muito antes de obterem autorização e descobrirem alguns anos depois que têm um problema. ”

“Este é um vasto experimento que deveria ter sido feito em laboratório em animais e agora está sendo feito em pessoas. O potencial é que você irá prejudicar muitas pessoas enquanto faz este experimento.” ("PREOCUPAÇÕES DO NEUROCIENTISTA SOBRE VACINAS DE COVID", Chris Shaw, Ph.D, Especialista em Neuroplasticidade e Neuropatologia)

É para mim. Francamente, prefiro não ter toxinas sintéticas de uma vacina experimental flutuando em meu cérebro, mas sou só eu.

Agora confira este clipe de uma entrevista com Robert F Kennedy Jr para um pouco de história sobre essas vacinas de mRNA:

“O que sabemos sobre o coronavírus com 30 anos de experiência é que uma vacina contra o coronavírus tem uma peculiaridade única, que é qualquer tentativa de fabricação da vacina resultou na criação de uma classe de anticorpos que realmente tornam as pessoas vacinadas mais doentes quando, por fim, sofrem exposição para o vírus selvagem. Após a epidemia de SARS que começou em 2002, a China lançou um esforço conjunto para desenvolver uma vacina contra o coronavírus. Eles conseguiram desenvolver 30 modelos promissores e escolheram os quatro “melhores da classe” para fabricar e testar em furões, o animal mais análogo aos seres humanos no que diz respeito a infecções respiratórias superiores.

Todos os furões desenvolveram respostas de anticorpos admiráveis, robustas e duráveis, e os cientistas acreditaram que haviam tirado a sorte grande. Mas então, quando os animais foram expostos ao vírus selvagem, algo assustador aconteceu. Os animais vacinados adoeceram e morreram com inflamação em todo o corpo. A vacina criou uma condição conhecida como resposta imune inerente paradoxal, que ampliou o dano causado pela doença em vez de preveni-lo.

Os cientistas da época relembraram uma ocorrência semelhante na década de 1960, quando o NIH havia conduzido estudos sobre uma vacina para o VSR, uma doença respiratória superior muito semelhante ao coronavírus. As 35 crianças nesse estudo desenvolveram uma forte resposta de anticorpos, mas ficaram terrivelmente doentes após a exposição ao RSV selvagem. Duas das crianças morreram. Lembrando desse incidente, os cientistas em 2012 abandonaram seus esforços para criar aquela vacina. E é por isso que hoje você está ouvindo terríveis avisos de setores inesperados ... que todos alertaram que uma vacina contra o coronavírus pode acabar deixando as pessoas mais doentes devido ao coronavírus, em vez de evitar a doença. ” (“Entrevista com Robert F Kennedy J”, Children's Health Defense)

Repito: “quando os animais foram expostos ao vírus selvagem, algo assustador aconteceu. Os animais vacinados adoeceram e morreram com inflamação em todo o corpo. ”

Este é um tema recorrente quando se lê literatura alternativa sobre a vacina de mRNA. Isso também pode explicar por que os fabricantes de vacinas pularam os testes com animais antes de buscar a aprovação do FDA. Devemos também observar que nenhuma das vacinas da safra atual concluiu seus testes de Fase 3, que não serão concluídos dentro de dois anos a partir de hoje. Os leitores não devem achar isso reconfortante.

Vamos parar um minuto e cavar um pouco mais fundo nessa ideia de que as vacinas podem realmente deixar você mais doente e talvez morrer. Aqui está uma sinopse de um artigo de pesquisa publicado na Nature em julho de 2020 sobre a condição chamada Melhoramento dependente de anticorpos:

“O aumento dependente de anticorpos (ADE) da doença é uma preocupação geral para o desenvolvimento de vacinas e terapias de anticorpos porque os mecanismos que fundamentam a proteção dos anticorpos contra qualquer vírus têm um potencial teórico para amplificar a infecção ou desencadear imunopatologia prejudicial. Esta possibilidade requer consideração cuidadosa neste ponto crítico da pandemia de doença coronavírus 2019 (COVID-19) ...

As implicações de nossa falta de conhecimento são duplas. Em primeiro lugar, estudos abrangentes são urgentemente necessários para definir correlatos clínicos de imunidade protetora contra SARS-CoV-2.Segundo, porque ADE da doença não pode ser previsto com segurança após vacinação ou tratamento com anticorpos - independentemente de qual vírus é o agente causador - ele irá ser essencial depender de uma análise cuidadosa da segurança em humanos à medida que as intervenções imunológicas para COVID-19 avançam….

É claro que depois de muitos anos e atenção considerável, a compreensão do ADE da doença após a vacinação ou administração de anticorpos antivirais é insuficiente para prever com segurança que uma dada intervenção imunológica para uma infecção viral terá resultados negativos em humanos ...

Estudos adicionais focados no mecanismo são necessários para determinar se os modelos de pequenos animais e NHP de infecção por vírus, incluindo para SARS-CoV-2, podem prever os prováveis ​​benefícios ou riscos de vacinas ou intervenções de anticorpos passivos em humanos….

Nesse ínterim, será necessário testar diretamente a segurança e definir correlatos de proteção conferidos por vacinas e anticorpos contra SARS-CoV-2 e outros patógenos virais em ensaios clínicos em humanos. ” ("Uma perspectiva sobre o potencial realce dependente de anticorpos de SARS-CoV-2", Nature)

1 Você pode ficar doente e morrer. (Citação– “O realce dependente de anticorpos (ADE) cria o“ potencial para amplificar a infecção ou desencadear imunopatologia prejudicial. ”)

2Nós não sabemos o que não sabemos. (Citação– “... ADE da doença não pode ser previsto com segurança após a vacinação ou tratamento com anticorpos ... será essencial depender de uma análise cuidadosa de segurança em humanos à medida que as intervenções imunológicas para COVID-19 avançam ...”)

3Estamos voando às cegas e esperando o melhor. (Citação– “Estudos adicionais focados no mecanismo são necessários para determinar se os modelos de pequenos animais e NHP de infecção por vírus, incluindo para SARS-CoV-2, podem prever os prováveis ​​benefícios ou riscos de vacinas ou intervenções de anticorpos passivos em humanos…. ”)

4Vamos continuar testando porque não temos ideia se o que estamos fazendo é seguro. (Citação– “Nesse ínterim, será necessário testar diretamente a segurança e definir correlatos de proteção conferidos por vacinas e anticorpos contra SARS-CoV-2 e outros patógenos virais em ensaios clínicos em humanos.”)

Assim, enquanto Shaw vê um conjunto de problemas potenciais, Kennedy vê outros completamente diferentes. Mas isso é apenas a ponta do iceberg, porque o Dr. J. Patrick Whelan, um reumatologista pediátrico, acredita que as vacinas de mRNA podem causar lesões microvasculares no cérebro, coração, fígado e rins de maneiras não avaliadas em testes de segurança. Na verdade, ele até escreveu uma carta detalhada ao FDA em dezembro alertando-os explicitamente sobre esses perigos potenciais. Aqui está um trecho de um artigo da Global Research que fornece os detalhes:

“Estou preocupado com a possibilidade de que as novas vacinas destinadas a criar imunidade contra a proteína spike SARS-CoV-2 tenham o potencial de causar lesão microvascular no cérebro, coração, fígado e rins de uma forma que atualmente não parece ser avaliados em testes de segurança desses medicamentos em potencial. ”

Whelan estava se referindo ao fato de que as vacinas de mRNA funcionam incorporando o projeto genético para a proteína spike chave na superfície do vírus em uma fórmula que - quando injetada em humanos - instrui nossas próprias células a fazer a proteína spike….

Com base na pesquisa conduzida até o momento, é muito provável que alguns receptores das vacinas de mRNA da proteína spike apresentem os mesmos sintomas e lesões associados ao vírus.

Mais uma vez, de acordo com Whelan, “o potencial de causar lesão microvascular (inflamação e pequenos coágulos sanguíneos chamados microtrombos) no cérebro, coração, fígado e rim ... não foi avaliado nos testes de segurança.” ..

Ignorar esses avisos válidos e cientificamente comprovados pode resultar em centenas de milhões de pessoas sofrendo lesões potencialmente fatais ou danos permanentes após a vacinação. Também irá corroer ainda mais a confiança cada vez menor que nosso país tem em nossas agências reguladoras federais para proteger a saúde de todos os americanos

Infelizmente, as preocupações de Whelan não foram reconhecidas e a agência, em vez disso, confiou nos dados limitados dos ensaios clínicos. O VRBPAC endossou o uso da vacina Pfizer em 10 de dezembro. No dia seguinte, o FDA emitiu a primeira autorização de uso de emergência da vacina COVID-19, permitindo que a vacina Pfizer-BioNTech COVID-19 fosse amplamente distribuída em indivíduos com 16 anos ou mais sem chamada para os estudos adicionais que Whelan considerou essenciais para garantir a segurança da vacina, especialmente em crianças ”. (“Could Spike Protein in Moderna, Pfizer Vaccines Cause Blood Coots, Brain Inflammation and Heart Attacks?” Pesquisa Global)

Esses são apenas alguns dos muitos avisos que os profissionais médicos emitiram publicamente. Eles refletem as crescentes preocupações sobre este novo regime de vacinas duvidosas. Desnecessário dizer que seus avisos caíram em ouvidos surdos ou se perderam no barulho da celebração em torno da nova droga milagrosa. Enquanto falamos, milhões de pessoas em todo o mundo estão sendo injetadas com uma nanopartícula experimental que pode ou não afetar sua saúde e bem-estar pelo resto de suas vidas. Eles basearam sua decisão não em dados científicos sólidos e em resultados de longo prazo, mas na implacável disseminação do medo seguida por uma explosão de mídia extravagante e avassaladora. Essa manipulação grosseira das percepções do público impede o que qualquer pessoa razoável chamaria de “consentimento informado”. Estamos sendo conduzidos como ovelhas ao matadouro.

Então, aqui está a pergunta de um milhão de dólares: as vacinas da Covid são seguras ou não?

Como podem ser? Eles não foram suficientemente testados, a tecnologia é nova e experimental, os Ensaios de Fase 3 não foram concluídos, ensaios completos em animais nunca foram realizados, não há dados sobre efeitos colaterais adversos de longo prazo e o produto final foi espalhado através da “borracha selo ”FDA sob a cláusula de Autorização de Uso de Emergência (EUA). Além disso, os profissionais médicos estão agora nos alertando que as vacinas podem “causar lesões microvasculares no cérebro, coração, fígado e rins”.

O povo americano precisa considerar essas coisas antes de tomar sua decisão

A vacina Covid não fornece imunidade

Isso está me fazendo pensar em um nível mais profundo sobre a recuperação natural / imunidade versus a imunidade da vacina de uma perspectiva de longo prazo. Leia o artigo a seguir muito interessante, sim, o foco está nas vacinas e na imunidade de longo prazo, mas concentre-se na diferença entre as vacinas contra a varíola e o sarampo e as vacinas contra o tétano e a difteria, a primeira dá um pouco do vírus & # 8220live & # 8221 e a última atenuada / morta os primeiros vírus dão imunidade vitalícia, os últimos precisam de reforços !!

Então, com a vacina Covid, as pessoas nem mesmo estão recebendo um vírus atenuado, apenas uma codificação (mRNA) para que nossas células façam uma proteína spike do vírus e então o corpo fabrica anticorpos contra ela. É provável que essa imunidade tenha vida curta. Pra gente como eu, quem teve o vírus tomou suplementos recuperou minha imunidade é pra COISA DE VERDADE. A memória de longo prazo dos anticorpos provavelmente armazenou tudo agora na minha medula e também a memória não apenas de uma mera proteína de pico, mas de TODO o nucleocapídeo do vírus. Portanto, eu teoricamente seria imune a meros mutantes que são variantes em suas proteínas de pico (que é como eles se fixam em nossas células e, portanto, as mutações provavelmente estão tornando o vírus mais transmissível).

Além disso, uma vacina irá promover imunidade a apenas 1 cepa do vírus e a imunização em massa contra uma cepa irá promover a frequência de mutação do vírus, uma vez que irá reduzir uma cepa sobre a outra e os mutantes podem, portanto, & # 8220 absorver & # 8221 mais fácil, portanto, um vai precisar de vacinação todos os anos para sempre. Nova vacina no próximo ano para os & # 8220mutantes & # 8221 e assim por diante. Em comparação com obtê-lo naturalmente, usar a vacina God & # 8217s, se preferir, provavelmente promoverá imunidade de longo prazo a variantes / mutantes por muitos anos, talvez décadas. Isso seria & # 8220verdadeira & # 8221 imunidade de rebanho, não & # 8220 artificial & # 8221 imunidade de rebanho. Estou no caminho certo aqui, acredito em algo que não está sendo relatado de forma alguma. Imunidade de rebanho verdadeira vs. artificial.

Portanto, e eu não sou um & # 8220anti vaxxer & # 8221, mas um vaxxer cuidadoso. Sou um cientista, vamos & # 8217s seguir a ciência. Estamos muito além de nossas cabeças porque aqueles que controlam estão empurrando essas vacinas. Medo, dinheiro e poder são grandes motivadores. As vacinas podem ser um pouco úteis por agora, mas a longo prazo, tenho preocupações significativas aqui. Por razões óbvias. A & # 8220victory & # 8221 provavelmente terá vida curta se dependermos das vacinas.

O que você precisa saber sobre a vacina COVID

Este artigo deixa claro que estamos sendo experimentados, não vacinados:


As novas evidências assustadoras sobre plásticos livres de BPA

Todas as noites na hora do jantar, um ritual familiar acontecia na casa de Michael Green & # 8217s: ele deslizou um copo com canudinho de aço inoxidável sobre a mesa para sua filha de dois anos, Juliette, e ela uivou pelo de plástico rosa . Freqüentemente, Green desistia. Mas ele tinha uma sensação desagradável. Como um defensor da saúde ambiental, ele lutou para livrar os copos com canudinho e as mamadeiras do aditivo plástico comum bisfenol A (BPA), que imita o hormônio estrogênio e tem sido associado a uma longa lista de sérios problemas de saúde. O copo com canudinho Juliette & # 8217s foi feito de uma nova geração de plásticos sem BPA, mas Green, que dirige o Centro de Saúde Ambiental com sede em Oakland, Califórnia, encontrou pesquisas sugerindo que alguns desses estrogênios sintéticos também continham.

Ele ponderou essas descobertas enquanto o centro se preparava para a celebração do aniversário em outubro de 2011. Naquela noite, Green, um homem franzino com cabelo loiro desalinhado e olhos azul-claros, subiu ao palco e colocou os copos com canudinho Juliette & # 8217s no pódio. Ele relatou seus confrontos noturnos. & # 8220Quando ela ganha & diabo, toda vez que me preocupo com quais são os impactos na saúde dos produtos químicos que vazam daquele copo com canudinho & # 8221, ele disse, antes de listar alguns dos problemas ligados a esses produtos químicos & mdashcancer, diabetes, obesidade. Para ajudar a resolver o enigma, disse ele, sua organização planejou testar copinhos sem BPA para substâncias químicas semelhantes ao estrogênio.

O centro enviou o copo plástico Juliette & # 8217s, junto com 17 outros comprados da Target, Walmart e Babies R Us, para o CertiChem, um laboratório em Austin, Texas. Mais de um quarto & mdashincluding Juliette & # 8217s & mdash voltou positivo para atividade estrogênica. Esses resultados refletem as descobertas do laboratório & # 8217s em sua pesquisa mais ampla financiada pelo National Institutes of Health sobre plásticos livres de BPA. CertiChem e seu fundador, George Bittner, que também é professor de neurobiologia na Universidade do Texas-Austin, foram recentemente co-autores de um artigo no jornal NIH Perspectivas de saúde ambiental. Ele relatou que & # 8220 quase todos & # 8221 plásticos disponíveis comercialmente que foram testados lixiviaram estrogênios sintéticos & mdasheven quando não foram & # 8217t expostos a condições conhecidas por desbloquear produtos químicos potencialmente prejudiciais, como o calor de um microondas, o vapor de uma máquina de lavar louça ou o sol & Raios ultravioleta # 8217s. De acordo com a pesquisa de Bittner & # 8217s, alguns produtos livres de BPA na verdade liberaram estrogênios sintéticos que foram mais potente do que o BPA.

O estrogênio desempenha um papel fundamental em tudo, desde o crescimento ósseo até a ovulação e a função cardíaca. Muito ou pouco, especialmente no útero ou durante a primeira infância, pode alterar o desenvolvimento do cérebro e dos órgãos, levando a doenças mais tarde na vida. Os níveis elevados de estrogênio geralmente aumentam o risco de câncer de mama na mulher.

Produtos químicos estrogênicos encontrados em muitos produtos comuns têm sido associados a uma litania de problemas em humanos e animais. De acordo com um estudo, o pesticida atrazina pode transformar sapos machos em fêmeas. DES, que já foi prescrito para prevenir abortos espontâneos, causou obesidade, tumores vaginais raros, infertilidade e crescimentos testiculares entre aqueles expostos no útero. Os cientistas relacionaram o BPA a doenças como asma, câncer, infertilidade, baixa contagem de espermatozoides, deformidade genital, doenças cardíacas, problemas hepáticos e TDAH. & # 8220 Escolha uma doença, literalmente escolha uma doença, & # 8221 diz Frederick vom Saal, professor de biologia da Universidade de Missouri-Columbia que estuda o BPA.

O BPA explodiu nas manchetes em 2008, quando histórias sobre embalagens de & # 8220tóxicas para bebês & # 8221 e & # 8220poison & # 8221 se tornaram onipresentes. Bom Dia America emitiu um & # 8220 alerta ao consumidor. & # 8221 O New York Times instou o Congresso a proibir o BPA em produtos para bebês. A senadora Dianne Feinstein (D-Calif.) Advertiu no Huffington Post que & # 8220 milhões de bebês estão expostos a produtos químicos perigosos escondidos à vista de todos. & # 8221 Pais preocupados limparam suas despensas de recipientes de plástico, e varejistas como Walmart e Babies R Us começaram a retirar mamadeiras e copinhos das prateleiras. Projetos de lei proibindo o BPA em itens de cuidados infantis começaram a surgir em vários estados do país.

Hoje, muitos produtos de plástico, de copos com canudinho e liquidificadores a recipientes Tupperware, são comercializados como livres de BPA. Mas as descobertas de Bittner & # 8217s - algumas das quais foram confirmadas por outros cientistas - sugerem que muitas dessas alternativas compartilham as qualidades que tornam o BPA tão potencialmente prejudicial.

Esses resultados surpreendentes desencadearam uma luta acirrada com a indústria de plásticos de US $ 375 bilhões por ano. O American Chemistry Council, que faz lobby para os fabricantes de plásticos e tem procurado refutar a ciência que liga o BPA aos problemas de saúde, se uniu à Eastman Chemical & mdashthe fabricante do Tritan, um plástico amplamente usado comercializado como livre de atividade estrogênica & mdash em uma campanha para desacreditar Bittner e sua pesquisa. A empresa chegou a dizer aos clientes corporativos que a Agência de Proteção Ambiental (EPA) rejeitou os métodos de teste do Bittner & # 8217s. (Não tem & # 8217t.) Eastman também processou a CertiChem e sua empresa irmã, PlastiPure, para impedi-los de divulgar suas descobertas de que o Tritan é estrogênico, convencendo um júri de que seu produto não apresentava atividade estrogênica. E lançou uma campanha de relações públicas promovendo a segurança do Tritan & # 8217s, visando o grupo mais vulnerável aos estrogênios sintéticos: famílias com crianças pequenas. & # 8220Pode ser difícil para os consumidores dizer o que é realmente seguro & # 8221, disse o vice-presidente da divisão de plásticos especiais da Eastman & # 8217s, Lucian Boldea, em um vídeo da web, antes que a imagem de uma mulher grávida aparecesse na tela. Com o Tritan, ele acrescentou, & # 8220 os consumidores podem se sentir confiantes de que o material usado em seus produtos está livre de atividade estrogênica. & # 8221

A ofensiva da Eastman é apenas a mais recente em uma ampla campanha da indústria para lançar dúvidas sobre os perigos potenciais dos plásticos em embalagens de alimentos, embalagens e brinquedos & campanha de mdasha que se assemelha aos métodos usados ​​pela Big Tobacco para sufocar as evidências científicas sobre os perigos do fumo . De fato, em muitos casos, as indústrias de plásticos e químicas contaram com os mesmos cientistas e consultores que defenderam o Big Tobacco. Esses esforços, detalhados em documentos internos da indústria revelados durante a batalha legal do Bittner & # 8217s com a Eastman, semearam a confusão pública e obstruíram a regulamentação dos EUA, mesmo com as proibições do BPA surgindo em outras partes do mundo. Eles também sufocaram o debate sobre a segurança dos plásticos em geral. Ao mesmo tempo, crescem as evidências de que os produtos tão comuns em nossa vida diária podem estar liberando produtos químicos tóxicos para o nosso corpo, com consequências que afetam não apenas a nós, mas muitas gerações futuras.

A luta pela segurança dos plásticos remonta a 1987, quando Theo Colborn, uma avó de 60 anos com um recente doutorado. em zoologia, foi contratado para investigar misteriosos problemas de saúde na vida selvagem ao redor dos Grandes Lagos. Trabalhando para a Conservation Foundation sediada em Washington, DC (agora parte do World Wildlife Fund), ela começou a coletar artigos de pesquisa. Em pouco tempo, seu minúsculo escritório foi abarrotado do chão ao teto com caixas de papelão de estudos detalhando uma gama desconcertante de doenças e câncer mdash, órgãos sexuais encolhidos, fertilidade em queda, supressão imunológica, pássaros que nascem com bicos cruzados e olhos faltando. Algumas espécies também sofriam de uma síndrome bizarra que fazia com que pintinhos aparentemente saudáveis ​​definhassem e morressem.

Embora as aflições e as espécies variassem amplamente, Colborn finalmente percebeu que eles tinham dois fatores em comum: os filhotes eram os mais atingidos e, de uma forma ou de outra, todos os sintomas dos animais estavam ligados ao sistema endócrino, a rede de glândulas que controla o crescimento, o metabolismo e a função cerebral, com os hormônios como seus mensageiros químicos. O sistema também desempenha um papel fundamental no desenvolvimento fetal. Colborn suspeitou que os hormônios sintéticos em pesticidas, plásticos e outros produtos agiam como & # 8220 venenos de segunda mão & # 8221 com a exposição dos pais & # 8217 causando aflição em seus filhos. Inicialmente, seus colegas estavam céticos. Mas Colborn coletou dados e amostras de tecido de populações longínquas de vida selvagem e desenterrou estudos anteriormente esquecidos que sustentavam sua teoria. Em 1996, quando Colborn co-publicou seu livro marcante Nosso Futuro Roubado, ela havia conquistado muitos céticos. Com base em parte em sua pesquisa, o Congresso aprovou uma lei naquele ano exigindo que a EPA analisasse cerca de 80.000 produtos químicos - a maioria dos quais nunca havia passado por qualquer tipo de teste de segurança para efeitos de desregulação endócrina e apresentasse um relatório em 2000.

Por volta dessa época, vom Saal, da University of Missouri & # 8217s, um biólogo tagarela que anteriormente trabalhou como piloto no Quênia, começou a estudar os efeitos dos estrogênios sintéticos no desenvolvimento fetal de camundongos. A primeira substância que testou foi o BPA, um produto químico usado em plásticos duros e transparentes, especialmente a variedade conhecida como policarbonato, para torná-los mais flexíveis e duráveis. (Ele também é encontrado em itens de uso diário, de selantes dentários e bolsas de sangue de hospital a recibos de caixa registradora e o revestimento de latas.) Os estrogênios que ocorrem naturalmente se ligam às proteínas do sangue, limitando a quantidade que chega aos receptores de estrogênio. Mas vom Saal descobriu que isso não era verdade para o BPA, que contornou o sistema de barreira natural do corpo e se enterrou profundamente nas células de ratos de laboratório.

Vom Saal suspeitou que isso tornaria o BPA & # 8220 um inferno de muito mais potente & # 8221 em pequenas doses. Trabalhando com os colegas Susan Nagel e Wade Welshons, professor de biologia veterinária, ele começou a testar os efeitos do BPA em quantidades 25 vezes menores do que o limite de segurança da EPA & # 8217s. No final da década de 1990, eles publicaram dois estudos descobrindo que ratos machos cujas mães foram expostas a essas doses baixas durante a gravidez tinham próstatas aumentadas e baixa contagem de espermatozoides. Mesmo em quantidades microscópicas, parecia, o BPA poderia causar os tipos de problemas de saúde terríveis que Colborn encontrou na vida selvagem. Em pouco tempo, outros cientistas começaram a detectar doenças entre animais expostos a doses mínimas de BPA.

Essas descobertas representaram uma ameaça direta aos fabricantes de plásticos e produtos químicos, que contra-atacaram usando táticas que os fabricantes de tabaco transformaram em uma forma de arte. No final da década de 1990, quando as empresas de tabaco concordaram em abandonar as práticas de marketing enganosas sob um acordo com 46 estados, muitos dos cientistas e consultores da folha de pagamento da indústria & # 8217s fizeram uma transição perfeita para a defesa do BPA.

Os interesses de plásticos e produtos químicos trabalharam em estreita colaboração com o Grupo Weinberg, que administrou o esforço Big Tobacco & # 8217s White Coat Project para recrutar cientistas para criar dúvidas sobre os efeitos do fumo passivo na saúde. Logo Weinberg, que se autodenomina uma empresa de & # 8220 defesa do produto & # 8221, estava produzindo white papers e fazendo lobby junto aos reguladores. Também subscreveu um grupo comercial com seu próprio jornal científico, Toxicologia Regulatória e Farmacologia, que publicou estudos descobrindo que o BPA era seguro.

A indústria também trabalhou lado a lado com o Harvard Center for Risk Analysis, um think tank afiliado à faculdade de saúde pública da universidade que tem um histórico de aceitar doações de corporações e publicar pesquisas favoráveis ​​a seus produtos. No início dos anos 1990, seu fundador, John D. Graham & mdashwho mais tarde foi escolhido como czar regulador de George W. Bush & mdashlobbied para anular uma descoberta da EPA de que o fumo passivo causava câncer de pulmão, enquanto solicitava grandes contribuições da Philip Morris.

Em 2001, conforme os estudos sobre o BPA se acumulavam, o American Chemistry Council convocou o centro para convocar um painel de cientistas para investigar o BPA em baixas doses. O centro pagou aos painelistas US $ 12.000 para participar de três reuniões, de acordo com Fast Company. Seu relatório final, lançado em 2004, baseou-se em apenas alguns estudos favorecidos pela indústria e concluiu que a evidência de que a exposição a baixas doses de BPA prejudicava a saúde humana era & # 8220muito fraca. & # 8221 Neste ponto, cerca de 100 estudos em baixa dose de BPA estavam em circulação. Nem um único estudo financiado pela indústria descobriu que é prejudicial, mas 90 por cento daqueles por cientistas financiados pelo governo descobriram efeitos dramáticos, variando de um risco aumentado de câncer de mama à hiperatividade. Quatro dos 12 membros do painel insistiram mais tarde que o centro apagasse seus nomes do relatório por causa de dúvidas sobre sua exatidão.

Os interesses químicos, enquanto isso, forjaram profundas incursões no governo Bush, permitindo-lhes dirigir secretamente o processo regulatório. Por décadas, a Food and Drug Administration garantiu aos legisladores e ao público que o BPA é seguro em doses baixas. Mas uma investigação de 2008 pela Milwaukee Journal Sentinel revelou que a agência confiou em lobistas da indústria para rastrear e avaliar a pesquisa de BPA e baseou sua avaliação de segurança em dois estudos financiados pela indústria - um dos quais nunca foi publicado ou revisado por pares.

O painel nomeado pela EPA para desenvolver diretrizes para a triagem de desreguladores endócrinos exigida pelo Congresso também foi abastecido por cientistas apoiados pela indústria. Incluía Chris Borgert, um consultor de toxicologia que havia trabalhado em estreita colaboração com a Philip Morris para desacreditar a pesquisa da EPA sobre o fumo passivo. Mais tarde, ele serviu como presidente da Sociedade Internacional de Toxicologia Regulatória e Farmacologia, organização patrocinada pelo Grupo Weinberg, que se reunia nos escritórios de um lobista de plásticos.

Os membros do painel da EPA dizem que Borgert parecia determinado a reprimir o processo. & # 8220Ele estava sempre demorando, sempre tentando confundir a questão, & # 8221 lembra um participante. E a abordagem de triagem que a EPA definiu veio direto do manual da indústria & # 8217s. Entre outras coisas, os produtos químicos seriam testados em um tipo de rato conhecido como Charles River Sprague Dawley - que, estranhamente, não responde a hormônios sintéticos como o BPA.

A melhor forma de testar a atividade estrogênica se tornaria uma frente-chave na luta pela segurança do plástico. O Conselho Americano de Química juntou forças com um aliado improvável, PETA, para lutar contra testes de segurança química em grande escala em animais. Ao mesmo tempo, Borgert e outros cientistas financiados pela indústria argumentaram que o outro método comum para testar células que respondem na presença de estrogênio não necessariamente nos diz como uma substância afetaria animais ou humanos. Na verdade, um enorme estudo em andamento do NIH descobriu que os testes baseados em células acompanham de perto os estudos em animais, que previram com precisão os efeitos dos estrogênios sintéticos, particularmente DES e BPA, em humanos.

Stanton Glantz, que dirige o Centro de Pesquisa e Educação para o Controle do Tabaco na Universidade da Califórnia-San Francisco, argumenta que o objetivo real da indústria química em desafiar os métodos de teste específicos é minar os testes de segurança como um todo. & # 8220Como as empresas de tabaco, eles querem estabelecer um padrão de prova que é inalcançável & # 8221, diz ele. & # 8220Se eles estabeleceram o padrão de prova, eles & # 8217 ganharam a luta. & # 8221

Durante o auge da batalha pelo BPA, vom Saal viajava periodicamente para o Texas e se aninhava ao redor da mesa de jantar com seu velho amigo George Bittner, cuja casa tem vista para um bosque de nogueiras nos arredores de Austin. Bittner, que possui um Ph.D. em neurociência de Stanford, é peculiar e irascível. Mas ele tem uma mente brilhante para a ciência e interesse em aplicá-la a problemas do mundo real. Em seu laboratório na UT-Austin, ele desenvolveu uma técnica de regeneração de nervos que ajudou ratos aleijados a andar em poucos dias. E ele se interessou profundamente pela pesquisa de vom Saal & # 8217s sobre desregulação endócrina. & # 8220Apareceu-me como o problema de saúde pública mais importante de nosso tempo & # 8221 Bittner me disse quando nos encontramos em seu laboratório. & # 8220Estes produtos químicos foram correlacionados com muitos efeitos adversos em estudos com animais e eles & # 8217são muito difundidos. As implicações potenciais para a saúde humana surpreendem a mente. & # 8221

No final da década de 1990, Bittner & mdasha homem atarracado e ruivo com cabelos ruivos ralos e óculos Napoleon Dynamite que havia feito uma boa soma investindo em imóveis e commodities & mdashbegan ponderando a ideia de lançar uma empresa privada que trabalhava com fabricantes e organizações de saúde pública para testar produtos para desreguladores endócrinos. Ele acreditava que essa abordagem poderia ajudar a aumentar a conscientização e quebrar o impasse regulatório, embora também tenha lucro.

Em 2002, armado com uma doação de US $ 91.000 do National Institutes of Health, Bittner lançou duas empresas: CertiChem, para testar plásticos e outros produtos para estrogênios sintéticos, e PlastiPure, para encontrar ou desenvolver alternativas não estrogênicas. Bittner então convocou Welshons para projetar um teste especial usando uma linha de células de câncer de mama, que se multiplicam rapidamente na presença de estrogênio. Possui um braço robótico, que é muito mais preciso do que uma mão humana no manuseio de material microscópico.

Mas logo Bittner começou a bater de frente com Welshons e vom Saal. Bittner queria que os pesquisadores cedessem os direitos do teste que Welshons havia desenvolvido, enquanto eles insistiam que pertencia à Universidade de Missouri. Eventualmente, eles tiveram uma amarga desavença. Welshons e vom Saal apresentaram uma queixa ao NIH, alegando que Bittner havia deturpado os dados do laboratório Welshons & # 8217 em um folheto. (Bittner afirma que simplesmente excluiu dados de amostras contaminadas que o instituto não encontrou evidências de irregularidades.) Bittner, enquanto isso, recrutou V. Craig Jordan, professor de farmacologia da Universidade de Georgetown com experiência em hormônios e mdashhe descobriu uma terapia hormonal agora comum que bloqueia a propagação do câncer de mama - para refinar o protocolo de teste. Em 2005, Bittner abriu um laboratório comercial em um frondoso parque de escritórios em Austin. Ele conseguiu atrair alguns clientes de renome, incluindo a Whole Foods, que contratou a CertiChem para aconselhá-la sobre produtos químicos desreguladores endócrinos e testar alguns de seus produtos.

Nesse ponto, o BPA estava entre os produtos químicos mais estudados do planeta. Em novembro de 2006, vom Saal e um alto funcionário do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental reuniram um grupo de 38 pesquisadores importantes de várias disciplinas para avaliar os mais de 700 estudos existentes sobre o assunto. O grupo posteriormente emitiu uma & # 8220 declaração de consenso & # 8221 que expôs algumas conclusões assustadoras: Mais de 95 por cento das pessoas nos países desenvolvidos foram expostas a níveis de BPA que estão & # 8220 dentro da faixa & # 8221 associados a problemas de saúde em animais, de câncer e diabetes resistente à insulina até a puberdade precoce. Os cientistas também descobriram que havia & # 8220 grande motivo de preocupação com relação ao potencial de efeitos adversos semelhantes em humanos & # 8221 especialmente devido ao aumento acentuado desses mesmos distúrbios.

Ao mesmo tempo, um novo corpo de pesquisa estava descobrindo que o BPA alterava os genes dos animais & # 8217 de maneiras que causavam doenças. Por exemplo, pode desligar um gene que suprime o crescimento do tumor, permitindo que o câncer se espalhe. Essas mudanças genéticas foram transmitidas de geração em geração. & # 8220Um veneno mata você & # 8221 vom Saal explica. & # 8220Uma substância química como o BPA reprograma suas células e acaba causando uma doença em seu neto que o mata. & # 8221

Os cientistas também estavam descobrindo ligações entre produtos químicos desreguladores do sistema endócrino conhecidos como ftalatos e problemas de saúde, incluindo anormalidades genitais e infertilidade em humanos. Esses aditivos químicos eram comumente encontrados em plásticos macios e flexíveis, como os usados ​​em chupetas e bicos de mamadeira. Em 2008, o Congresso aprovou uma lei proibindo seis tipos de ftalatos em produtos infantis. À medida que as preocupações com o BPA atingiam o público, o Congresso também lançou uma investigação sobre os esforços da indústria para manipular a ciência e a regulamentação, e vários estados propuseram banimentos do BPA.

Em 2009, a BPA Joint Trade Association & mdashwhich incluiu o American Chemistry Council, Coca-Cola e Del Monte, entre outros & mdash reuniu-se no Cosmos Club, um retiro exclusivo para membros em Washington, DC & # 8217s Dupont Circle. De acordo com a ata da reunião vazou para o Milwaukee Journal Sentinel, o grupo explorou estratégias de mensagens, & # 8220incluindo o uso de táticas de medo (por exemplo, & # 8216Você deseja mais ter acesso à comida para bebês? & # 8217). & # 8221 O & # 8220 & # 8216 Santo Graal & # 8217 porta-voz & # 8221 participantes concordaram, era uma & # 8220 jovem mãe grávida que estaria disposta a falar em todo o país sobre os benefícios do BPA. & # 8221

Mesmo enquanto a indústria criava pontos de discussão defensivos, algumas empresas começaram a oferecer alternativas sem BPA. Mas muitas vezes eles não se incomodavam em testá-los para outros compostos potencialmente tóxicos ou hormônios sintéticos. Nem precisavam: De acordo com a lei dos EUA, os produtos químicos são considerados seguros até prova em contrário, e as empresas raramente são obrigadas a coletar ou divulgar dados de segurança química. Michael Green, o diretor do Centro de Saúde Ambiental que se preocupou com o copo com canudinho de sua filha # 8217s, diz que isso resulta em um & # 8220 jogo de invólucros tóxicos & # 8221: Corporações que sofrem pressão para eliminar as toxinas costumam substituí-las por produtos químicos não testados, que às vezes acabou por ser tão perigoso. & # 8220É & # 8217 um experimento científico não planejado que & # 8217 estamos fazendo em nossas famílias & # 8221 Green me disse quando o visitei em sua casa na Bay Area, onde Juliette, agora com 5 anos, estava vestindo uma fantasia de princesa rosa.

Uma das opções sem BPA mais populares, especialmente entre empresas que atendem a famílias e consumidores preocupados com a saúde, era o Tritan, um plástico transparente, resistente e resistente ao calor que a Eastman lançou em 2007. (A Eastman também produz o produto químico que manchou o água potável de 300.000 habitantes da Virgínia Ocidental em janeiro.) Uma empresa fundada pelo guru da medicina alternativa, Dr. Andrew Weil, lançou uma linha de mamadeiras Weil feitas de Tritan, que foi anunciada como & # 8220revolucionária & # 8221 e & # 8220ultra-segura & # 8221 material . A garrafa térmica começou a fazer xícaras com canudinho Tritan, decoradas com Barbie e Batman. Com cada vez mais consumidores exigindo produtos sem BPA, Nalgene, CamelBack, Evenflo, Cuisinart, Tupperware, Rubbermaid e muitas outras empresas também trabalharam com Tritan em suas linhas de produção.

A Eastman, uma empresa de US $ 7 bilhões que se separou da Eastman Kodak na década de 1990, garantiu a seus clientes corporativos que havia feito testes extensivos de segurança no Tritan. Mas seus métodos eram questionáveis. De acordo com documentos internos da Eastman, em 2008 a Eastman assinou um contrato de dois anos com a Sciences International, outra empresa de defesa de produtos que desempenhou um papel fundamental na campanha de desinformação científica da indústria do tabaco # 8217. Seguindo o conselho da Sciences & # 8217, Eastman encomendou um estudo que usava modelagem de computador para prever se uma substância contém estrogênios sintéticos, com base em sua estrutura química. O modelo sugeriu que um dos ingredientes do Tritan & # 8217s & mdashtrifenil fosfato, ou TPP & mdash, era mais estrogênico do que o BPA.

A Eastman, que nunca revelou essas descobertas a seus clientes, encomendou mais tarde outro estudo, este envolvendo células de câncer de mama. Novamente, os resultados iniciais pareceram positivos para a atividade estrogênica. Em um e-mail para colegas, o toxicologista sênior da Eastman & # 8217s, James Deyo, chamou isso de um & # 8220 oh momento de merda. & # 8221

Os testes de cultura de células para efeitos estrogênicos geralmente envolvem mergulhar o plástico em álcool ou água salgada e, em seguida, expor as células a várias concentrações de substâncias químicas que vazam. Depois que Deyo informou ao laboratório que suas descobertas devem & # 8220 ser formuladas muito bem em relação à falta de & # 8221 atividade estrogênica, ele emitiu um relatório que contava apenas os dados das concentrações mais baixas & mdasheven, embora isso violasse as diretrizes de teste do laboratório & # 8217s, e fez o os resultados parecem negativos quando não são & # 8217t. & # 8220O laboratório ignorou seus próprios critérios e deturpou suas descobertas, & # 8221 diz Michael Denison, professor de toxicologia da Universidade da Califórnia-Davis que avaliou o documento.

A Eastman não foi a única empresa testando o Tritan. Em 2009, Bittner & # 8217s PlastiPure, que estava em busca de alternativas não estrogênicas para recomendar aos clientes, começou a examinar produtos feitos com ele e descobriu que alguns tinham ainda mais atividade estrogênica do que suas contrapartes carregadas de BPA. O CEO da PlastiPure & # 8217s, Mike Usey, diz que a CertiChem revelou isso aos clientes, mas muitos escolheram a Tritan de qualquer maneira.

Isso fazia parte de um padrão mais amplo de indiferença. De acordo com Usey, centenas de fabricantes, incluindo a maioria dos grandes fabricantes de mamadeiras, entraram em contato com a CertiChem para perguntar sobre como testar seus produtos sem BPA para substâncias estrogênicas, mas poucos realmente seguiram adiante. & # 8220Sua posição era: Até que os consumidores estejam exigindo produtos não estrogênicos, não há & # 8217s razão para ser um dos primeiros a adotar & # 8221 Usey explica. & # 8220Eles querem atrasar o máximo que podem, porque sabem que qualquer transição lhes custará. & # 8221 Em alguns casos, os fabricantes pagaram pelos testes e nunca coletaram os resultados. & # 8220Eles não queriam saber os resultados porque há responsabilidade em saber, & # 8221 diz Usey. & # 8220Eles & # 8217 estão certos no sentido de que você não deseja saber se não vai resolver o problema. & # 8221

Apesar de suas descobertas & # 8220oh merda & # 8221, em 2010 a Eastman começou a produzir materiais de marketing alegando que o Tritan estava livre de todos os estrogênios sintéticos. Uma seção de seu site apresentava o slogan & # 8220Segurança é nosso ingrediente principal & # 8221 junto com fotos de crianças sorridentes comendo e bebendo em recipientes de plástico. O site afirmava que uma & # 8220 pesquisa de terceiros & # 8221 havia mostrado que o Tritan era livre de atividade estrogênica, mas quando os clientes corporativos tentaram verificar essa informação, Eastman ficou cauteloso. No início de 2010, a Philips Avent, um dos principais produtores de mamadeiras e copinhos com canudinho, perguntou sobre a realização de testes de laboratório externo no Tritan. O químico sênior Emmett O & # 8217Brien da Eastman & # 8217Brien enviou um e-mail para colegas, dizendo: & # 8220 Precisamos [fazer] todo o possível para convencer o cliente a NÃO fazer o teste de EA [atividade estrogênica]. & # 8221 A Philips foi persuadida. Mas, de acordo com o testemunho de executivos da Eastman, naquele mesmo ano, a Nestl & eacute examinou o Tritan e descobriu que ele lixiviava estrogênio sintético. (Fr & eacuted & eacuterique Henry, porta-voz da Nestl & eacute, reconhece que a empresa testou o Tritan, mas nega que os resultados tenham sido positivos.) Nestl & eacute, no entanto, continuou usando Tritan em algumas de suas garrafas de água.

Bittner e Usey, por sua vez, decidiram abrir o capital. & # 8220Enquanto a demanda do consumidor não estava & # 8217 lá, os fabricantes de produtos sentiam que estávamos vendendo a eles um problema em vez de uma solução, & # 8221 Usey explica. & # 8220Vemos isso como o único caminho a seguir. & # 8221 Bittner & # 8217s empresas, que receberam mais de US $ 8 milhões em financiamento do NIH, começaram a trabalhar com Jordan, o professor de Georgetown, em um artigo para publicação. No outono de 2010, Usey participou da ABC Kids Expo, uma extravagância de produtos para crianças & # 8217s em Las Vegas, e distribuiu panfletos com um gráfico mostrando como vários produtos que foram comercializados como não estrogênicos se comparam nos testes da CertiChem & # 8217s. As mais estrogênicas entre elas, as mamadeiras Weil Baby, eram feitas de Tritan. (A empresa referiu Mother Jones a um comunicado à imprensa em seu site afirmando que & # 8220 permanece confiante de que o Tritan está seguro. & # 8221)

Logo os clientes da Eastman & # 8217s começaram a perguntar sobre as descobertas da CertiChem & # 8217s. Na maior parte, Eastman os convenceu a desconsiderar as afirmações de Bittner & # 8217s. A certa altura, O & # 8217Brien se reuniu com executivos da Whole Foods. Eles estavam pensando em substituir suas lixeiras de policarbonato por outras feitas de Tritan, embora Bittner os tivesse informado previamente que o produto era estrogênico. De acordo com um memorando que O & # 8217Brien escreveu mais tarde, quando o assunto surgiu, ele respondeu atacando Bittner, a quem chamou de & # 8220shady & # 8221 e os resultados de seu teste, que ele alegou serem & # 8220muito questionáveis. & # 8221 Mais tarde, os executivos da Whole Foods pressionaram O & # 8217Brien sobre os outros testes realizados no Tritan.

O químico alegou, falsamente, que eles foram realizados por cientistas independentes sem financiamento de Eastman e não havia encontrado nenhuma evidência de que o Tritan lixiviou estrogênios sintéticos. Whole Foods & mdashwhich se recusou a comentar esta história & mdash lavou adiante e instalou caixas Tritan em muitas de suas 270 lojas nos Estados Unidos.

A Eastman se recusou a responder a perguntas para esta história, mas divulgou um comunicado escrito dizendo que havia & # 8220 pago os laboratórios por seu tempo e experiência e não por uma conclusão específica & # 8221 e permaneceu & # 8220 confiante no teste e na segurança de Tritan. & # 8221

Em março de 2011, o Perspectivas de Saúde Ambiental artigo de Jordan e pesquisadores da CertiChem e PlastiPure apareceu online. Eles testaram 455 recipientes de alimentos comprados em lojas e produtos de armazenamento, incluindo vários feitos de Tritan. Os resultados? Setenta e dois por cento lixiviaram estrogênios sintéticos. E todo tipo de plástico comumente usado em embalagens de alimentos (polipropileno e poliestireno, por exemplo) deu positivo em alguns casos, o que sugeria que não havia maneira infalível de evitar a exposição.

Outros cientistas também encontraram evidências de produtos químicos que imitam o estrogênio em plásticos sem BPA. Em 2009, dois toxicologistas ambientais alemães testaram PET, um plástico comumente usado em garrafas de água, em uma variedade de caramujos de lama que produzem mais embriões quando expostos ao estrogênio sintético. Os caracóis criados em garrafas PET produziram o dobro daqueles criados em um prato de cultura de vidro.

Esses estudos não identificam quais produtos químicos estrogênicos são lixiviados dos plásticos livres de BPA, mas muitos desses produtos são conhecidos por conter ftalatos ou bisfenol S (BPS), um primo químico do BPA que os fabricantes de plástico freqüentemente usam em seu lugar. Os testes de cultura de células sugerem que o BPA e o BPS têm efeitos semelhantes.

Em outros casos, pouco se sabe sobre os efeitos específicos dos produtos químicos envolvidos na saúde, mas uma revisão da literatura de 2012 por 12 cientistas proeminentes descobriu que há & # 8220 evidências substanciais & # 8221 de que os produtos químicos desreguladores endócrinos geralmente prejudicam a saúde humana. & # 8220Sabemos que há um custo quando alteramos os níveis desses hormônios em nossos corpos, independentemente de como o fazemos, & # 8221 diz a autora principal do estudo & # 8217s, Laura Vandenberg, professora de ciências da saúde ambiental na Universidade de Massachusetts-Amherst. & # 8220Mesmo pequenas mudanças no início da vida podem alterar o desenvolvimento do cérebro e dos órgãos e nos preparar para doenças mais tarde. & # 8221

Um mês após o estudo de Bittner & # 8217s aparecer, o American Chemistry Council contatou Chris Borgert, o ex-cientista da indústria do tabaco que bloqueou o Programa de Triagem de Disruptor Endócrino da EPA & # 8217s. De acordo com e-mails internos, o conselho e a Sociedade da Indústria de Plásticos ofereceram pagar a ele US $ 15.000 para escrever uma breve carta ao editor do jornal & # 8217s refutando o estudo da CertiChem & # 8217s e para recrutar outro cientista para assinar. A carta argumentou que as descobertas da CertiChem & # 8217s foram & # 8220 não convincentes & # 8221 apenas porque uma substância se comportou como estrogênio em um prato de cultura não significava que o faria em animais ou humanos.

Ao mesmo tempo, Eastman fez planos para processar a CertiChem e a PlastiPure por propaganda enganosa. Esperando que Bittner atacasse depois de receber os papéis, a empresa lançou uma blitz preventiva de relações públicas. & # 8220Ao promover proativamente a segurança do Tritan, & # 8221 observou um memorando interno, & # 8220 ele colocará a PlastiPure em uma posição de provar que Eastman estava errado. & # 8221 A empresa também pagou a um cientista chamado Thomas Osimitz $ 10.000 para escrever um artigo de pesquisa no Tritan. Enquanto Osimitz trabalhava aparentemente de forma independente, Deyo, o toxicologista de Eastman, microgerenciou o processo, desde a concepção do estudo até a redação da introdução. O desenho do estudo de Deyo & # 8217s virtualmente garantiu que a atividade estrogênica não seria encontrada. Por exemplo, ele optou por usar o rato de laboratório Charles River Sprague Dawley insensível a hormônios. Em vez de testar o Tritan em si, ele instruiu Osimitz a testar apenas alguns ingredientes do Tritan e o mdashTPP, aquele que levantou bandeiras vermelhas no estudo de modelagem por computador, não foi incluído. (A União Europeia, desde então, classificou o composto como um disruptor endócrino suspeito.)

Em junho de 2012, Osimitz & # 8217s paper & mdashfinding que Tritan não era estrogênico & mdashappearam in Toxicologia Alimentar e Química, um jornal amigável do setor. Seu editor, A. Wallace Hayes, foi anteriormente vice-presidente de pesquisa bioquímica e biocomportamental da R.J. Reynolds, que liderou o ataque contra a ciência que associa o fumo passivo a problemas de saúde humana.

As revistas científicas geralmente exigem que os autores divulguem quaisquer conflitos de interesse. Mas o Toxicologia Alimentar e Química o artigo não fez menção ao papel de Eastman & # 8217s no estudo. De acordo com e-mails internos da Eastman, a empresa também pretendia contratar Osimitz para escrever um segundo artigo, novamente com & # 8220no & hellipmention of Eastman. & # 8221 Como Deyo observou, & # 8220 a credibilidade é um pouco melhorada se não for & # 8216Eastman & # 8217 autores. & # 8221

Depois que seus próprios dados foram publicados, Eastman começou a enterrar as descobertas de Bittner & # 8217s. Em agosto de 2012, a empresa processou a CertiChem e a PlastiPure, que alegou estarem espalhando informações falsas sobre a Tritan para gerar demanda por seus próprios serviços. Os advogados de Eastman pediram ao juiz que proibisse ambas as firmas de alegar que Tritan era estrogênico - disse que testes baseados em células podem detectar atividade estrogênica, embora os cientistas os usem rotineiramente para esse propósito. Por décadas, os cientistas confiaram na mesma linha de células de câncer de mama que Bittner & # 8217s lab usa, MCF-7, para rastrear a atividade estrogênica. De acordo com UMass & # 8217 Vandenberg, essas células provaram & # 8220 notavelmente boas em nos dizer se os compostos encontrados em plásticos e produtos de cuidados pessoais imitam o estrogênio & # 8221 e suas & # 8220 taxas de falha são minúsculas. & # 8221

Em 15 de julho de 2013, Bittner enfrentou Eastman em um tribunal federal em Austin. Os advogados da empresa deram duro. Especificamente, eles alegaram que dirigir uma empresa que testava produtos para atividade estrogênica, bem como uma que ajudava as empresas a encontrar alternativas não estrogênicas, criou um conflito de interesses. (Bittner responde que não tem mais conflitos do que um médico que diagnostica e trata os pacientes.) Mas eles não desafiaram diretamente a validade das descobertas de Bittner. Em vez disso, eles se apoiaram na questionável afirmação da indústria de que os testes baseados em células humanas não são suficientes para estabelecer a atividade estrogênica.

A principal testemunha de Eastman, Chris Borgert, argumentou que os estudos com animais & mdashwhich a indústria também lutou para minar & mdash eram um indicador mais revelador.Mas mesmo eles não eram & # 8220 em si mesmos & # 8221 definitivos. Para que o resultado seja relevante, os efeitos devem ser demonstrados & # 8220 em um animal, pelo menos, e depois em humanos. & # 8221 Não houve menção às barreiras éticas e legais para testes em humanos. E o juiz proibiu os advogados de Bittner & # 8217s de mencionar os laços com a indústria do tabaco da Borgert & # 8217s, que Eastman argumentou serem & # 8220prejudiciais. & # 8221 Isso deixou o júri mal equipado para avaliar sua credibilidade.

O testemunho de Borgert & # 8217s pode ter causado menos danos do que outros fatores. Os advogados de Bittner se esforçaram para explicar a ciência aos jurados, e Bittner ficou irritado no depoimento. Welshons, que projetou os testes CertiChem & # 8217s, testemunhou em um depoimento & mdash, assim como & # 8217d disse ao NIH & mdasht que Bittner havia deturpado alguns dados em um folheto. Os advogados de Bittner conseguiram impedir que seu depoimento fosse apresentado. Mas, diz Bittner, seus advogados hesitaram em apresentar evidências importantes, como números sobre o financiamento da CertiChem & # 8217s NIH, porque isso poderia ter tornado o testemunho de Welshons & # 8217 admissível. Bittner também afirma que sua rixa com vom Saal e Welshons dificultou o recrutamento de testemunhas.

Ainda assim, vários cientistas proeminentes testemunharam a favor da CertiChem, incluindo UC-Davis e # 8217 Michael Denison, que inventou um teste amplamente usado para a atividade estrogênica usando células ovarianas humanas. Denison testemunhou que ele & # 8217d testou 27 amostras de Tritan para atividade estrogênica usando este método e registrou positivos em todos os níveis.

Mas os dados mais notáveis ​​podem ter vindo de ninguém menos que Wade Welshons. Antes do teste, o cientista da Universidade de Missouri, que esperava provar que Bittner estava errado, começou a testar os produtos Tritan em seu laboratório. Para sua surpresa, ele acabou confirmando as descobertas da CertiChem & # 8217s. & # 8220Não importa o que eu penso deles pessoalmente, & # 8221 Welshons me disse. & # 8220Se eles estão certos, eles & # 8217 estão certos e muitas das minhas objeções não importam mais. & # 8221

As conclusões de Welshons & # 8217 nunca chegaram aos tribunais, entretanto, e quando os jurados retornaram seu veredicto no final de julho, eles condenaram as empresas da Bittner & # 8217s por falsa propaganda e concorrência desleal. Eles também concluíram que o Tritan não era estrogênico. Seu raciocínio, de acordo com entrevistas pós-veredicto, ecoou as afirmações de Eastman & # 8217s de que a atividade estrogênica não poderia ser estabelecida apenas por meio de testes baseados em células. Em sua decisão final, o juiz também observou que o & # 8220júri provavelmente não ficou impressionado com o comportamento combativo do Dr. Bittner & # 8217. & # 8221 E ele censurou os dois lados por não terem explicado a ciência em termos que os jurados pudessem entender. No final, ele barrou as empresas da Bittner & # 8217s de falar sobre suas descobertas no Tritan, pelo menos em um ambiente comercial. Mas ele se recusou a impedir as empresas de afirmar que seus testes poderiam detectar estrogênios sintéticos.

A longa batalha legal esgotou os cofres da CertiChem e da PlastiPure & # 8217s & mdash & # 8221Nós & # 8217 despedimos metade de nossa equipe & # 8221 Usey me disse. & # 8220Ele praticamente nos esmagou & # 8221 & mdashand encorajou Eastman. Depois que comecei a levantar questões sobre Tritan, Rick W. Harrison, advogado da gigante química, inadvertidamente me copiou em um e-mail sobre a estratégia de controle de danos da Eastman & # 8217. & # 8220Se isso de alguma forma for captado pela mídia tradicional & mdashOprah ou mídia de NY & mdashEastman enviará Lucian [Boldea, o vice-presidente da divisão de plásticos especiais da Eastman & # 8217s] ou quem quer que esteja no programa preparado com o veredicto, ordem e julgamento e expresse surpresa e indignação por estes questões ainda estão sendo levantadas após três anos de litígio & # 8221 ele escreveu. & # 8220O tribunal / júri falou e falou alto. & # 8221

A indústria, enquanto isso, reviveu sua campanha para minimizar os perigos do BPA. Um mês após a conclusão do caso Eastman, o American Chemistry Council relançou seu site pró-BPA, FactsAboutBPA.org. A seção sobre saúde infantil sugere que o BPA não é prejudicial, mesmo para bebês prematuros. & # 8220Eles & # 8217 estão voltando exatamente aos argumentos que apresentavam em 1998 & # 8221 diz vom Saal. & # 8220É como se os últimos 15 anos não tivessem acontecido. & # 8221

Os reguladores dos EUA também continuaram a ignorar as evidências crescentes que ligam o BPA e produtos químicos semelhantes a doenças humanas, mesmo com as proibições surgindo em todo o mundo. Embora mais de 90 estudos examinando pessoas com vários níveis de exposição sugiram que o BPA afeta os humanos tanto quanto os animais, o FDA anunciou recentemente que sua pesquisa & # 8220 apóia a segurança do BPA & # 8221 em recipientes e embalagens de alimentos. E o programa da EPA que deveria examinar cerca de 80.000 produtos químicos para desregulação endócrina não examinou totalmente uma única substância. Em 2010, a agência buscou a aprovação da Casa Branca para adicionar alguns produtos químicos desreguladores endócrinos que são comumente encontrados em plásticos e entre eles BPA, ftalatos e uma classe de compostos conhecidos como PBDEs & mdashto sua lista de & # 8220químicos preocupantes & # 8221 porque descobriu que eles & # 8220 pode apresentar um risco irracional para a saúde humana. & # 8221 Isso exigiria que os fabricantes de produtos químicos compartilhassem os dados dos testes de segurança com os reguladores federais. A proposta ficou estagnada até setembro passado, quando a EPA a retirou discretamente, junto com uma regra proposta que exigia que os fabricantes divulgassem dados de segurança sobre produtos químicos em seus produtos.

Ainda assim, Bittner não está desistindo da luta. Quando visitei o escritório da CertiChem & # 8217s em Austin recentemente, ele estava sentado descalço em uma mesa de conferência cercado por copinhos e pilhas de cadernos de laboratório. CertiChem e PlastiPure estavam planejando apelar da decisão Eastman (eles & # 8217 já fizeram isso) e estavam trabalhando com Denison em dados para novos papéis, um sobre atividade estrogênica em resinas plásticas, que são usadas para fazer produtos plásticos e contêm menos aditivos que podem resultados distorcidos. Bittner chamou uma série de gráficos no retroprojetor, mostrando os resultados de vários novos plásticos sem BPA que ele havia testado para atividade estrogênica. Ele passou seu apontador laser sobre um gráfico que exibia os resultados para Tritan. A linha se curvou abruptamente. & # 8220Eastman venceu a batalha & # 8221, disse ele. & # 8220Mas isso não & # 8217 significa que vencerá a guerra. & # 8221

Atualização (3/3/14): Depois que esta história foi para a imprensa, a US Food and Drug Administration publicou um artigo descobrindo que o BPA era seguro em doses baixas. No entanto, devido à contaminação laboratorial, todos os animais & mdashinclusando o grupo de controle & mdash foram expostos a este produto químico. Cientistas acadêmicos dizem que isso levanta sérias questões sobre a credibilidade do estudo & # 8217s. Fique ligado para relatórios mais detalhados sobre o estudo mais recente da FDA & # 8217s.