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O que M9 significa

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Alguém pode me dizer o que M9 significa no meio M9?

Eu tentei pesquisar no Google, mas ainda não consigo encontrar.


Engenharia Escherichia coli para conversão de metanol

Bactérias metilotróficas utilizam metanol e outros compostos de um carbono reduzido como sua única fonte de carbono e energia. Para esse propósito, essas bactérias desenvolveram uma série de enzimas e vias especializadas. Aqui, usamos uma abordagem de biologia sintética para selecionar e introduzir um conjunto de "genes de metiltrofia" em Escherichia coli baseado em em sílico considerações e análise de balanço de fluxo para permitir a dissimilação e assimilação do metanol. Determinamos que a abordagem mais promissora que permite a utilização de metanol foi a implementação de metanol desidrogenase dependente de NAD e o estabelecimento do ciclo do monofosfato de ribulose pela expressão dos genes para hexulose-6-fosfato sintase (Hps) e 6-fosfo-3- hexuloisomerase (Phi). Para testar as enzimas de melhor desempenho no hospedeiro heterólogo, uma série de candidatos a enzimas de diferentes organismos doadores foram selecionados e analisados ​​sistematicamente quanto a seus em vitro e na Vivo atividades em E. coli. Entre estes, Mdh2, Hps e Phi originários de Bacillus methanolicus foram considerados os mais eficazes. Experimentos de rotulagem usando 13 C metanol com E. coli a produção dessas enzimas mostrou até 40% de incorporação de metanol nos metabólitos centrais. A presença da via de oxidação de formaldeído dependente de glutationa endógena de E. coli não afetou adversamente a taxa de conversão de metanol. Tomados em conjunto, os resultados deste estudo representam um grande avanço no sentido de estabelecer metilotrofos sintéticos por transferência de genes.


NOVO para 2014 & # 8211 Next Generation M Series

Nota do editor: as informações abaixo vêm do site do fabricante e nossa análise das máquinas verifica as informações.

O NOVO 2014 M9 Life Ionizer é um redesenho completo que substitui seu popular LIFE 9100. O “M” na Série M significa Máximo & # 8211 e LIFE significa isso! O novo M-9 supera todos os outros ionizadores:

  • Água alcalina com um pH que se ajusta até 11,5
  • Maior potencial antioxidante que ajusta até -800 ORP
  • SMPS MAX Yield Power ™ & # 8211 ajusta até 252 a 504 watts *

A riqueza de espécies de árvores aumenta o armazenamento de carbono do ecossistema em florestas subtropicais

Os ecossistemas florestais são um componente integral do ciclo global do carbono, pois absorvem e liberam grandes quantidades de C em curtos períodos de tempo (fluxo de C) ou o acumulam em períodos mais longos (estoque de C). No entanto, permanece a incerteza sobre se e em que direção os fluxos de C e, em particular, os estoques de C podem diferir entre florestas de alta e baixa riqueza de espécies. Com base em um conjunto de dados abrangente derivado de medições baseadas em campo, testamos o efeito da riqueza de espécies (3-20 espécies de árvores) e idade do povoamento (22-116 anos) em seis compartimentos de estoques de C acima e abaixo do solo e quatro componentes dos fluxos de C em florestas subtropicais no sudeste da China. Em todos os povoamentos florestais, o estoque total de C foi de 149 ± 12 Mg ha -1 com a riqueza explicando 28,5% e a idade explicando 29,4% da variação nesta medida. Os povoamentos ricos em espécies tinham estoques e fluxos de C mais altos do que os povoamentos com baixa riqueza e, além disso, os povoamentos antigos tinham maiores estoques de C do que os jovens. No geral, para cada espécie de árvore adicional, o estoque total de C aumentou 6,4%. Nossos resultados fornecem evidências abrangentes para o sequestro de C acima e abaixo do solo mediado pela diversidade em florestas subtropicais ricas em espécies no sudeste da China. Portanto, as políticas de florestamento nesta região e em outros lugares devem considerar uma mudança do foco atual em monoculturas para plantações multiespécies para aumentar a fixação de C e, assim, diminuir o aumento de CO atmosférico2 concentrações e aquecimento global.

Palavras-chave: Ecossistema de armazenamento de carbono de fluxo de carbono BEF-China funcionando biodiversidade florestal florestal de folhas largas perenes.


Materiais e métodos

Produtos Químicos e Reagentes

Todos os produtos químicos e solventes foram adquiridos da Sigma-Aldrich, a menos que indicado de outra forma. Endonucleases de restrição e enzimas modificadoras de DNA eram da New England Biolabs. O plasmídeo de DNA foi extraído usando o kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). O sequenciamento de DNA foi subcontratado à Eurofins SAS (Ebersberg, Alemanha).

Construção de Plasmídeo

Os vetores pZA23, pZA33, pZE23 e pZS23 de Expressys & # x000AE foram usados ​​porque são indutíveis por IPTG e abrigam uma estrutura mais leve do lacI gene que reduz o seu tamanho (2 358 a 3 764 pb) e são moduláveis ​​(origem de replicação fácil de alterar, marcador de resistência e promotor do vetor por restrição / ligação). Neste estudo, o promotor PA1lac0-1 em pZA33 foi substituído pelo promotor constitutivo proC e pelo promotor induzível Ptac, gerando pZA37 e pZA36, respectivamente. Da mesma forma, o promotor PA1lac0-1 de pZS23 foi substituído por proD gerando pZS28.

A clonagem de genes foi realizada usando NEBuilder HIFI DNA Assembly Master Mix (NEB E2621). Este método permite que vários fragmentos sejam montados em uma única etapa. A mistura comercial fornecida pela New England Biolabs contém (a) uma exonuclease, que cria 3 & # x02032 extremidades de fita simples, o que facilita a montagem dos fragmentos, que compartilham uma complementaridade de sequência (b) uma polimerase, que preenche os espaços vazios após os fragmentos foram montados e (c) uma ligase, que une fragmentos. o E. coli kdsD, fsaA e aldA genes foram amplificados a partir do DNA do genoma extraído de E. coli K12 MG1655 por PCR usando os iniciadores descritos na Tabela S1. Fragmentos (kdsD & # x0002B fsaA ou aldA) foram então inseridos por HiFi assembly & # x000AE em pZ linearizado previamente com primers que hibridizam em ambos os lados do MCS. Todos os plasmídeos foram verificados por sequenciação. Os plasmídeos resultantes contendo o kdsD, fsaA e aldA os genes são relatados na Tabela 2.

mesa 2. Plasmídeos usados ​​ou construídos neste estudo.

Construção e transformação de tensão

o E. coli cepas utilizadas neste trabalho estão listadas na Tabela 3. Deleção do gene (ou seja, glcD, fucA, mgsA, pfkA, ptsG) foi feita por transdução usando o fago P1vir. A preparação dos lisados ​​P1vir e os procedimentos de transdução foram realizados como descrito em Bremer et al. (1984) com pequenas modificações. Cepas (cepa doadora) da coleção KEIO (Murakami et al., 2007) com uma única deleção e um cassete de resistência a antibióticos canamicina foi inoculado (200 & # x003BCl de uma pré-cultura noturna feita em LB) em 5 ml de LB contendo 0,2% D-glicose e CaCl 5 mM2 por 30 min a 37 & # x000B0C. Em seguida, 100 & # x003BCl de P1vir lisado (& # x0007E 5 & # x000D7 10 8 fagos / ml) foi adicionado a cada cultura de doador e incubado a 37 & # x000B0C por 2 a 3 h até que a cultura estivesse límpida e as células estivessem completamente lisado (Baba et al., 2006). Os lisados ​​foram recuperados por filtração usando filtros de seringa estéreis de 25 mm com uma membrana de suporte de 0,2 & # x003BCm (Pall) e preservados a 4 & # x000B0C. Para deletar o gene de interesse, a cepa receptora foi infectada com P1vir contendo o cassete de deleção do gene doador com resistência à canamicina. Para tanto, a cepa receptora foi previamente cultivada em 5 ml de meio LB a 37 & # x000B0C, coletada por centrifugação a 1.500 g por 10 min e ressuspensa em 1,5 ml de MgSO 10 mM4 e 5 mM de CaCl2. O Lisado P1vir contendo o cassete de deleção do gene da cepa doadora foi adicionado (0,1 ml) à suspensão da cepa receptora e incubado por 30 min a 37 & # x000B0C. Então, 0,1 ml de citrato de sódio 1 M foi adicionado, então 1 ml LB, e esta suspensão celular foi incubada por 1 h a 37 & # x000B0C, 200 rpm antes de ser espalhada em um meio LB sólido com o antibiótico apropriado. As colônias foram selecionadas por PCR para isolar eventos de transdução bem-sucedidos. A remoção da cassete do antibiótico foi realizada por transformação das estirpes de bactérias com o plasmídeo pCP20 contendo a FLP recombinase, seguido de verificação por PCR.

Tabela 3. E. coli cepas utilizadas e construídas neste trabalho.

As cepas não comerciais competentes foram preparadas de acordo com o protocolo de Chung et al. (1989) com pequenas modificações como se segue. Uma pré-cultura foi feita durante a noite em LB durante a noite. A cultura LB fresca foi então inoculada com células em um DO600 de 0,1. Quando fazer600 atinge cerca de 0,5, 2 ml de cultura foram coletados e o sedimento resultante foi ressuspenso em 300 & # x003BCl tampão TSS [2,5%(w / v) PEG 3350, 1 M MgCl2, 5%(vol / vol) DMSO]. Após 10 min em gelo, o plasmídeo de interesse foi adicionado à suspensão de células, a qual foi posteriormente incubada por 30 min em gelo. Esta etapa foi seguida por um choque térmico a 42 & # x000B0C por 90 s. As células transformadas foram colocadas em gelo por 10 min, em seguida, 400 & # x003BCl LB foi adicionado e a cultura foi incubada a 200 rpm por 1 h a 30 & # x000B0C. Após centrifugação a 8.000 rpm por 2,5 min, o pellet celular foi ressuspenso em 600 & # x003BCl de LB e 150 & # x003BCl foram espalhados em placas LB sólidas com o antibiótico apropriado.

Condições de cultura

Para as técnicas de biologia molecular, as cepas de bactérias foram cultivadas em meio LB (10 g / L de tripton, 5 g / L de extratos de levedura e 5 g / L de NaCl), e 5 g / L de ágar foi adicionado para meio sólido em placas de Petri. Para a produção de GA, foi utilizado o meio mineral M9. Salvo indicação em contrário, continha por litro: 18 g Na2 HPO 4 * 12H2O, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, 2 g NH4Cl, 0,5 g de MgSO 4 * 7H2O, 0,015 CaCl 2 * 2H2O, 1 ml de FeCl 0,06 M3 a partir de uma solução estoque 1000 & # x000D7 em HCl concentrado, 2 ml de solução estoque 10 mM de tiamina HCl, 20 g MOPS e 1 ml de solução de oligoelementos (solução 1000 & # x000D7 de 0,5 g Na2EDTA e # x0002A 2H2O, 0,18 g de CoCl 2 * 6H2O, 0,18 g de ZnSO 4 * 7H2O, 0,4 g de Na2 MoO 4 * 2H2O, 0,1 g H3BO3, 0,12 g MnSO 4 * H2O, 0,12 g CuCl2 & # x000D7 H2O). A fonte de carbono D-glicose, L-arabinose ou D-xilose foi adicionada a uma concentração final de 10 g / l, o pH foi ajustado para 7 com ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico (MOPS) e, em seguida, esterilizado por filtração através 0,2 & # x003BCm membranas. Os antibióticos ampicilina, canamicina e cloranfenicol foram adicionados quando necessário nas concentrações de 100, 50 e 25 mg / L, respectivamente. Para o E. coli cepas defeituosas na atividade da transcetolase (& # x00394tktA & # x00394tktB), Meio M9 foi suplementado com 500 & # x003BCM L-fenilalanina, 250 & # x003BCM L-tirosina, 200 & # x003BCM L-triptofano, 6 & # x003BCM p-aminobenzoato, 6 & # x003BCM p-hidroxidenzoato e 280 & # x003BCM shikimato e traço de LB (20% V / V) Para as cepas com defeito na atividade gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (& # x00394gapA), o meio M9 foi completado com 0,4 g / L de ácido málico ajustado a pH 7 com KOH. Quando necessário, os antibióticos apropriados foram adicionados ao meio a 100 & # x003BCg / mL para ampicilina, 50 & # x003BCg / mL para canamicina ou 25 & # x003BCg / mL para cloranfenicol. As culturas de bactérias foram colocadas em agitador rotativo a 200 rpm e a 37 & # x000B0C. O crescimento foi monitorado medindo a absorbância a 600 nm com um espectrofotômetro (Biochrom Libra S11).

Produção, purificação e ensaios de enzimas

o kdsD, fsaA, e aldA genes foram amplificados usando primers na Tabela S1 e clonados no vetor de expressão pET28a (Novagen). o E. coli cepa BL21 (DE3) transformada com o plasmídeo com esses genes foram inoculados a partir de uma pré-cultura feita em LB-canamicina (50 mg / L) em 200 mL de LB-Canamicina a 600 nm (DO600) de 0,1 a 16 & # x000B0C em um agitador rotativo a 200 rpm. Quando fazer600 atingiu 0,6 & # x020130,8, a expressão da proteína de interesse foi induzida pela adição de IPTG na concentração final de 1 mM de IPTG de 1 mM. Após 16 h a 16 & # x000B0C, a cultura foi coletada por centrifugação a 4.800 rpm por 15 min a 4 & # x000B0C. O sedimento celular foi ressuspenso em 1,5 mL de tampão de lavagem (HEPES 50 mM, pH 7,5 NaCl 0,3 M) e sonicado quatro vezes (30 s cada) a 30% de potência em gelo. As proteínas marcadas com HIS foram purificadas usando resina de cobalto de acordo com o protocolo descrito no kit comercial (Clontech). A purificação da proteína foi verificada por eletroforese SDS-PAGE e a concentração de proteína foi medida pelo método de Bradford (Bradford, 1976)

Os ensaios de enzimas foram feitos em um Tris-Cl, 100 mM pH 7,5 / 10 mM MgCl2 buffer a 37 & # x000B0C. Salvo indicação em contrário, a atividade KdsD foi medida em um ensaio acoplado na presença de 3 mM NAD & # x0002B e 5 mM D-Ribu-5P com 10 & # x003BCg / ml de cada um de FsaA e AldA. O FSA foi medido por acoplamento do GAP produzido a partir da clivagem de Ara5P 3 mM com a oxidação de NADH 0,2 mM a 340 nm na presença de 1 U / ml de triose isomerase e glicerol-3-P desidrogenase. AldA foi medido no mesmo tampão por redução de NAD & # x0002B (3 mM) a 340 nm na presença de glicolaldeído 5 mM.

Métodos analíticos

Os metabólitos extracelulares foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com um cromatógrafo Ultimate 3000 (Dionex, Sunnyvale, EUA). O sistema de HPLC foi equipado com uma coluna de troca catiônica (Aminex, HPX87H 300 & # x000D7 7,8 mm, 9 & # x003BCm, BioRad), um injetor automático (WPS-3000RS, Dionex), um detector de IR (RID 10A, Shimadzu) e um detector de UV (SPD-20A, Shimadzu). O volume de injeção da amostra foi de 20 & # x003BCL, e os compostos foram separados em uma coluna Aminex HPX-87H protegida por uma pré-coluna Micro-Guard Cation H (BioRad, EUA). A separação foi realizada a 35 & # x000B0C com 1,25 mM de H2TÃO4 a 0,5 mL min & # x022121 como fase móvel. Todas as amostras foram centrifugadas (2 min a 10.000 g) e filtradas por seringa (0,2 & # x003BCm), e o sobrenadante resultante mantido a & # x0221220 & # x000B0C até a análise.

Modelagem em escala de genoma e análise de equilíbrio de fluxo

A escala do genoma iJO1366 E. coli modelo (Orth et al., 2011) foi adaptado para simular a produção de GA por meio da via do glicoptimus. Notavelmente, um modificado fsaA a reação foi adicionada ao modelo para permitir a conversão de arabinose-5P em gliceraldeído-3P e glicolaldeído. As análises de balanço de fluxo parcimonioso (pFBA) foram realizadas usando o software OptFlux (Rocha et al., 2010), usando D-glicose, L-arabinose ou D-xilose como fonte de carbono. Para cada simulação, a taxa de absorção da fonte de carbono foi arbitrariamente definida em 10 mmol. g CDW - 1 .h & # x022121. A manutenção não associada ao crescimento foi estabelecida em 3,15 mmolATP. g CDW - 1 .h & # x022121, e as reações envolvidas no sistema de transporte de elétrons foram restringidas para simular uma razão P / O realista, conforme descrito anteriormente (Orth et al., 2011). As simulações pFBA foram realizadas usando a exportação GA como a função objetivo para maximizar.

Métodos estatísticos

As análises estatísticas foram conduzidas no Microsoft Excel & # x000AE usando o pacote Analysis ToolPak. Um bicaudal não emparelhado t-teste foi usado para comparar os níveis de indução de fluorescência, em que um nível alfa de p & # x0003C 0,05 foi definido para significância.


Informação sobre o autor

Esses autores contribuíram igualmente: Yuxin Chen, Yuanyuan Huang.

Afiliações

Departamento de Biologia Evolutiva e Estudos Ambientais, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça

Yuxin Chen, Yuanyuan Huang, Pascal A. Niklaus e Nadia Castro-Izaguirre

Laboratório principal dos ecossistemas costeiros e pantanosos (Ministério da Educação), Faculdade do Meio Ambiente e Ecologia, Universidade de Xiamen, Xiamen, China

Escola de Ciências da Vida / Laboratório Estadual de Biocontrole, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China

Departamento de Diversidade Fisiológica, Centro Helmholtz de Pesquisa Ambiental (UFZ), Leipzig, Alemanha

Centro Alemão de Pesquisa Integrativa da Biodiversidade (iDiv) Halle — Jena — Leipzig, Leipzig, Alemanha

Adam Thomas Clark e Helge Bruelheide

Martin Luther University Halle-Wittenberg, Halle (Saale), Alemanha

Laboratório Estadual de Vegetação e Mudança Ambiental, Instituto de Botânica, Academia Chinesa de Ciências, Pequim, China

Departamento de Geografia, Universidade de Zurique, Zurique, Suíça

Instituto de Ecologia, Faculdade de Ciências Urbanas e Ambientais, Universidade de Pequim, Pequim, China

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Contribuições

Y.C. e B.S. concebeu o estudo. Y.C. e A.T.C. desenvolveu o procedimento analítico. Y.C. realizaram as análises com contribuições de Y.H. e B.S. H.B., N.C.-I., Y.C., K.M., Y.H., P.A.N. e B.S. contribuíram para a coleta de dados. Todos os autores discutiram os resultados da análise e ajudaram a escrever o artigo.

Autor correspondente


Discussão

Compreender como a estrutura em nanoescala dos sistemas biológicos se relaciona com a função é uma busca contínua e desafiadora. Uma dificuldade é que apenas algumas sondas são capazes de interrogar diretamente estruturas nesta escala: elétrons, raios X e nêutrons. Os elétrons tiveram a mais ampla aplicação em biologia celular e o EM continua a ser a ferramenta mais poderosa para estudar a ultraestrutura celular. No que diz respeito ao B. subtilis membrana, um estudo crio-EM de células seccionadas e substituídas por congelamento, forneceu uma imagem impressionante da arquitetura celular, incluindo a parede celular. [56] No entanto, a estrutura da membrana plasmática não foi bem determinada e sua espessura foi estimada em 66 ± 8 Å, um valor surpreendentemente grande. Nossos resultados complementam esta imagem EM do envelope celular, fornecendo uma determinação de espessura hidrofóbica de alta resolução obtida sob condições fisiológicas.

O espalhamento de raios-X e de nêutrons tem sido amplamente usado para estudar a estrutura de membranas modelo compostas de misturas de lipídios definidas [3–5,28,29,46] ou extratos lipídicos naturais. [6–12] O espalhamento de raios-X também tem sido usado recentemente para o estudo ex vivo de membranas celulares, [6] mas sua aplicação a células intactas é confundida pela questão do espalhamento de fundo de água e biomoléculas. O espalhamento de nêutrons fornece uma solução única para o problema de fundo na forma de variação de contraste isotópica. Mostramos aqui que a variação de contraste in vivo através da marcação metabólica pode efetivamente suprimir o espalhamento do meio celular complexo, enquanto destacando características específicas de interesse, mesmo quando surgem de componentes menores, como lipídios (aproximadamente 1% da massa úmida celular). Além disso, os nêutrons frios usados ​​para experimentos de espalhamento são adequados para estudos em células vivas por causa de sua baixa energia cinética (& lt0,025 eV) e seu caráter não ionizante - em contraste com raios-X de alta energia e feixes de elétrons (& gt5.000 eV).

As aplicações anteriores de espalhamento de nêutrons in vivo dependiam apenas do contraste de solvente externo, que em alguns casos foi suficiente para observar o espalhamento de Bragg de estruturas repetidas em membranas tilacóides [57,58] e mitocôndrias. [59] Esses estudos não revelaram a estrutura da membrana em si, mas forneceram informações sobre o arranjo de membranas compactadas. Ao criar contraste interno, ou seja, ao rotular diferencialmente componentes celulares específicos, permitimos, pela primeira vez, medições ultraestruturais de alta resolução em uma única membrana. Neste trabalho, demonstramos o poder de uma abordagem baseada em biologia química para criar contraste interno seletivo, permitindo medições de alta resolução da espessura da membrana in vivo.

Nossa abordagem de variação de contraste in vivo também fornece uma nova ferramenta para estudar a estrutura da membrana lateral em células vivas. Os métodos estruturais baseados em nêutrons oferecem vantagens distintas, pois relatam a estrutura lipídica nanoscópica diretamente, sem a necessidade de modelos ou sondas extrínsecas. Indicações de mistura não uniforme [60,61] dentro da membrana plasmática surgiram contemporaneamente com o modelo de mosaico de fluido de referência proposto em 1972, [16] o conceito de domínios de membrana tornou-se bem estabelecido em meados da década de 1970 [62] e a jangada lipídica hipótese foi formalizada em 1997. [21] No entanto, a existência de domínios lipídicos permaneceu controversa, [63] e como eles são considerados transitórios e menores do que o limite de difração da luz (200 nm), eles escaparam da observação por técnicas microscópicas convencionais. Recentemente, no entanto, a microscopia de fluorescência de ultra-resolução foi usada para identificar ilhas difusionalmente restritas na escala de 20 nm na membrana plasmática de células epiteliais renais de ratos. [6] Nossa observação da segregação de lipídios em uma escala comparável na membrana plasmática de B. subtilis é consistente com a existência de domínios lipídicos análogos em bactérias e apóia a noção de que conjuntos de lipídeos nanoscópicos são uma característica integral das membranas biológicas.

A barreira crítica que impediu a aplicação de técnicas de espalhamento de nêutrons de alta resolução in vivo era a falta de um meio para criar contraste interno. Nesse trabalho, superamos a barreira e mostramos que B. subtilis é um sistema de modelo in vivo ideal para a aplicação de estratégias de variação de contraste de nêutrons. Por meio de condições de crescimento específicas e genótipos selecionados, fomos capazes de atenuar o contraste celular globalmente e reintroduzir com precisão o contraste na membrana. Com a capacidade de controlar as propriedades químicas e isotópicas dos lipídios da membrana, fomos capazes de interrogar a estrutura transversal e lateral da membrana. A mesma abordagem geral ao contraste seletivo pode ser potencialmente estendida a outras biomoléculas e organismos modelo para aplicações fora da arena da membrana. Mais imediatamente, a plataforma experimental in vivo pode ser usada para investigar a resposta da membrana plasmática a uma ampla gama de estímulos físicos, químicos, genéticos e ambientais. Prevemos que essa capacidade será, portanto, valiosa em muitas áreas, como desenvolvimento de antibióticos, produção de biocombustíveis, função de proteína de membrana e compreensão da interação entre a membrana, citoesqueleto e parede celular na criação de uma interface multifuncional protetora adaptável.


LB Media

LB é o meio mais comum usado para cultivar recombinantes Escherichia coli (E. coli) O LB media foi denominado por Giuseppe Bertani como “caldo de lisogenia” devido às pesquisas que realizava sobre lisogenia. LB é comumente referido incorretamente como Luria-Bertani media, Luria Broth ou Lennox Broth. A mídia LB também é usada para cultivar uma variedade de outros organismos facultativos.

Componentes da mídia LB

Uma razão pela qual o LB é comumente usado é porque ele é simples de fazer, com apenas alguns ingredientes, triptona, extrato de levedura e cloreto de sódio (NaCl). A triptona, uma mistura de peptídeos gerados pela digestão da caseína com a enzima pancreática tripsina, fornece nitrogênio e carbono. O extrato de levedura fornece vitaminas (incluindo vitaminas B) e alguns oligoelementos. O NaCl fornece íons de sódio para transporte e equilíbrio osmótico. E. coli derivada da cepa K-12, uma das cepas parentais mais comumente usadas de E. coli em uso na biologia molecular hoje são deficientes na produção de vitamina B.

Antecedentes históricos de LB

LB é um meio nutricionalmente rico que tem sido usado desde a década de 1950 para a cultura de Enterobacteriaceae e para ensaios de placa bacteriófago. LB permite um crescimento rápido com bons rendimentos de crescimento para muitas espécies. Em 1951, Giuseppe Bertani desenvolveu LB para otimizar a formação de placa em um Shigella cepa indicadora de Enterobacteriaceae. Hoje, a mídia LB é a mídia mais comum para o crescimento de cepas recombinantes de E. coli. Existem três formulações comuns de LB: LB Miller, LB Lennox e LB Luria. Todos são às vezes chamados de LB, embora a formulação de LB Miller seja a formulação comum ou mais padrão de LB. As formulações alternativas de LB variam na concentração de NaCl (Tabela 1).

Tabela 1. Formulações de LB.

Ingredientes % Luria (g / L) Lennox (g / L) Miller (g / L)
Triptona 1.0% 10 10 10
Extracto de levedura 0.5% 5 5 5
Cloreto de sódio (NaCl) 0,05, 0,5 ou 1,0% 0.5 5 10

A confusão sobre o nome LB é compreensível, dada a história de Bertani, Luria e Lennox. Giuseppe Bertani era membro do laboratório Luria na Universidade de Indiana quando formulou a mídia LB. Ed Lennox também foi membro do laboratório Luria e trabalhou com Bertani em alguns dos primeiros experimentos de lisogenia utilizando Shigella. Salvador Luria publicou um artigo em 1955 no qual copiava a formulação original de Bertani e LB às vezes é incorretamente atribuído a Luria devido à sua estatura científica, e por isso também pode ser incorretamente referido como Caldo de Luria. A formulação original de Bertani era 1,0% de Bacto triptona (10,0 g / L), 0,5% de extrato de levedura (5,0 g / L), 1,0% de NaCl (10,0 g / L), 0,1% de glicose (1,0 g / L) pH ajustado para 7,0 com NaOH 1 N. A glicose foi adicionada após a autoclavagem. Com o tempo, a adição de glicose foi eliminada de todas as formulações de LB. O nome Miller vem da formulação do livro Experimentos em Biologia Molecular por Jeffery Miller, publicado em 1972, que não contém glicose. A formulação original e mais comum de LB, Miller, contém NaCl a 1,0%. Em 1955, Ed Lennox estava estudando mecanismos de síntese de DNA utilizando cepas de E. coli sensível ao estresse osmótico desenvolveu uma formulação de LB contendo metade do sal da formulação original, ou seja, 0,5% de NaCl. Esta formulação é conhecida como LB Lennox. Hoje, LB Lennox é usado para o cultivo de E. coli ao usar antibióticos sensíveis ao sal, como Blasticidina, Puromicina e Zeocina. Uma terceira formulação de LB, contendo a menor quantidade de sal, é referida como LB Luria. Esta formulação contém 0,05% de NaCl. LB Luria é usado para isolar organismos marinhos, como Vibrio cholerae.

Mecanismos de crescimento em LB

A mídia LB foi originalmente projetada para o crescimento de bactérias em baixas densidades. O crescimento exponencial, um período de crescimento em estado estacionário, é estimado para terminar quando o OD600 (densidade óptica a 600 nm) está entre 0,6 e 1,0. Sabe-se que o crescimento de E. coli em LB geralmente para quando o OD600 atinge aproximadamente 2,0 em condições normais de crescimento, correspondendo a aproximadamente 0,6 mg E. coli (peso seco) por mL. Em 2007, D’Ari e colegas realizaram um estudo abrangente das características de crescimento em LB, olhando especificamente para a fisiologia de E. coli K-12, uma das cepas mais comuns utilizadas na biologia molecular hoje. Eles demonstraram que as células K-12 cresceram no LB Miller com um OD final600 de 0,6 -1,0 nem sempre estão no mesmo estado fisiológico. D’Ari e colegas de trabalho confirmaram observações anteriores de crescimento diauxic (crescimento em duas fases) em LB e notaram que o crescimento exponencial parou em

OD600 0.3, muito mais cedo do que comumente se pensa. Sabe-se que E. coli é conhecido por ter um crescimento fraco quando o pH excede 9,0, e não é incomum que o meio LB mude para um pH próximo a 9,0. No entanto, quando D’Ari e colegas de trabalho ajustaram o pH de LB, não houve efeito na curva de crescimento, ao passo que, quando a glicose foi adicionada à mídia, as culturas puderam crescer para DO600 6,49. Isso sugere que o crescimento de E. coli em LB é limitado em carbono. Conforme observado, a formulação original de LB por Bertani continha 0,1% de glicose. Esta pesquisa demonstra que embora o LB seja um bom meio para o crescimento de rotina, ele não deve ser usado para estudos fisiológicos onde a reprodutibilidade e um período prolongado de crescimento exponencial são necessários.

LB e Seleção

Há uma variedade de aditivos que podem ser adicionados ao meio LB para identificação ou seleção de uma população de organismos. Os antibióticos são frequentemente adicionados ao meio LB para selecionar células que foram projetadas para ter resistência a um ou mais antibióticos. X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo) ou Bluo-Gal (indolil-β-galactosídeo halogenado) pode ser adicionado ao meio LB para triagem azul-branca para inserção de sequência em um local de clonagem múltipla (MCS) em um plasmídeo contendo o fragmento α do gene da β-galactosidase. Para induzir a expressão de genes controlados pelo promotor lac, o análogo da lactose não metabolizável IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo) é adicionado ao meio. Em bactérias onde não há sequência inserida no plasmídeo, as colônias de MCS serão azuis, uma vez que X-Gal ou Bluo-Gal serão clivados pela β-galactosidase para formar 5-bromo-4-cloro-indoxil. Para plasmídeos onde há uma inserção, não haverá uma β-galactosidase funcional e as colônias permanecerão brancas.


A interrupção do mutualismo por uma formiga invasora reduz a fixação de carbono para uma formiga fundacional da África Oriental

Formigas invasoras moldam assembléias e interações de espécies nativas, mas seu efeito nos processos ecológicos fundamentais é mal compreendido. Na África Oriental, Pheidole megacephala formigas invadiram povoamentos monodominantes da formiga Acacia drepanolobium, extirpando os defensores das formigas nativas e tornando as árvores vulneráveis ​​aos danos do dossel por herbívoros vertebrados. Usamos experimentos e observações para quantificar os efeitos diretos e interativos de formigas invasoras e grandes herbívoros sobre A. drepanolobium fotossíntese em um período de 2 anos. Árvores que foram invadidas por ≥ 5 anos exibiram 69% menos fotossíntese da árvore inteira durante as principais estações de crescimento, resultante da interação entre formigas invasoras e herbívoros vertebrados que causaram declínios na fotossíntese nos níveis das folhas e dossel. Também pesquisamos árvores pouco antes e depois da invasão, descobrindo que a invasão recente induziu apenas pequenas mudanças na fisiologia da folha. Nossos resultados de árvores individuais provavelmente aumentam de escala, destacando o potencial das espécies invasoras para alterar a fixação de carbono no nível do ecossistema e outros ciclos biogeoquímicos.


Esses autores contribuíram igualmente: Fernanda Pinheiro, Omar Warsi.

Afiliações

Instituto de Física Biológica, Universidade de Colônia, Colônia, Alemanha

Fernanda Pinheiro e Michael Lässig

Departamento de Bioquímica Médica e Microbiologia, Uppsala University, Uppsala, Suécia

Omar Warsi e Dan I. Andersson

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Contribuições

Todos os autores estiveram envolvidos na investigação, redação do rascunho original, revisão e edição do manuscrito final.

Autores correspondentes


Reconhecimentos

Agradecemos J.R. Luque-Ortega pela ajuda nos experimentos de captação de oxigênio. Agradecemos a M. Abrahams, M. Mo e S. Burning pela leitura crítica do manuscrito. O JN agradece a T. Conrad por sua ajuda durante a estadia em San Diego e a E. Díaz e M.A. Prieto por sua valiosa ajuda e sugestões durante a reconstrução metabólica. O JN recebeu uma bolsa pré-doutorado I3P do Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) e a estadia do JN em San Diego foi apoiada por uma bolsa I3P de curta duração.