Em formação

Objetivo do promotor EF1 alfa

Objetivo do promotor EF1 alfa


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Contexto: Tenho visto promotores usados ​​para que os vírus da terapia gênica tenham como alvo células específicas, então estou me referindo a essa função aparente deles. Como exemplo, vi promotores GFAP usados ​​para direcionar astrócitos (vi isso em muitos outros artigos, mas este é o primeiro que encontrei no google).

Estou curioso para saber qual é o propósito do promotor EF1-alfa em um vírus lentilha / retro / Adeno-Associado para a expressão do gene?

Parece que é frequentemente usado para direcionar células-tronco embrionárias, mas eu também tinha visto outro lugar onde "O sistema de expressão Lenti-X (versão EF1α) permite que você produza títulos excepcionalmente altos de lentivírus recombinante para expressão de qualquer cDNA em qualquer tipo de célula suscetível à transdução lentiviral. " Isso me fez pensar que talvez, uma vez que esse promotor 'tem como alvo' células-tronco que mais tarde se transformam em qualquer tipo de célula, essa citação significa que o promotor EF1-alfa pode ser usado para alvejar células indiscriminadamente? Isso é verdade?

Por favor, perdoe quaisquer suposições incorretas de minha parte, sou um novato neste campo.


EF1-alfa é considerado um promotor onipresente / constitutivo; é eficaz em todas as células animais e tende a fornecer uma expressão forte. As células-tronco embrionárias (e outras) são mais difíceis de atingir do que outras células porque não expressam genes sob os promotores específicos do tipo de célula que são frequentemente usados ​​para outras populações de células, que é o motivo pelo qual você está vendo isso ser usado especificamente para esse aplicativo, mas esse não é o único uso.

Você encontrará muitas informações sobre o promotor em sites comerciais individuais e, em vez de promover sites específicos, sugiro pesquisas como https://www.google.com/search?q=ef1+alpha+constituitive ou https: // www.google.com/search?q=ef1+alpha+ubiquitous - o uso de EF1-alpha não é "propriedade" de ninguém, então, quando dizem essas coisas, não é apenas porque estão tentando vender a você algum método especial deles, eles estão apenas usando uma abordagem padrão de campo.


Sistemas de vetores lentivirais para expressão de genes constitutivos

Esses sistemas de expressão lentiviral são projetados para a expressão de genes constitutivos de um promotor CMV ou EF1-alfa.

Esses sistemas de expressão lentiviral são projetados para a expressão de genes constitutivos de um promotor CMV ou EF1-alfa.


Introdução

Os vetores de expressão desempenham papéis importantes na terapia genética. Os vetores atualmente usados ​​para a expressão gênica têm uma série de limitações 1-3, como integração aleatória no genoma do hospedeiro ou apenas retenção transitória. A integração aleatória pode levar à mutagênese de inserção e ao silenciamento do transgene. Portanto, o vetor ideal, principalmente para terapia gênica, deve ser retido nas células sem integração. O vetor plasmídeo epissomal não viral pEPI foi desenvolvido pela primeira vez por Piechaczek et al. 4 pEPI requer uma região de fixação de andaime / matriz (S / MAR) ligada a uma unidade de expressão 5, 6. A transcrição ativa a montante do S / MAR que corre nesta sequência é necessária e provavelmente suficiente para a replicação epissomal. Quando S / MAR é colocado a montante de um local de terminação da transcrição ou é excluído, o vetor é perdido ou integrado 7. O vetor pEPI replica-se independentemente com um baixo número de cópias em todas as células verificadas. Além do baixo número de cópias, outras desvantagens do vetor pEPI incluem expressão instável ou baixa do transgene 8, 9. Nos estudos subsequentes, esforços consideráveis ​​foram feitos para melhorar os vetores baseados em pEPI, como a inserção de ciselementos atuantes e reduzindo a quantidade de sequência bacteriana 10, 11.

Em nosso estudo anterior, construímos um vetor epissomal abrigando uma sequência de DNA de 387 pb compreendendo um motivo MAR característico e avaliamos diferentes promotores nos vetores epissomais. Descobrimos que o promotor CMV teve o melhor desempenho em termos de magnitude de expressão e estabilidade 11, 12. No entanto, a expressão do transgene era instável, o número de cópias era baixo e a magnitude da expressão ainda era insatisfatória.

A composição de um vetor plasmídeo, incluindo promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação e outros elementos de expressão, influencia a magnitude e a estabilidade da expressão do transgene. Embora o promotor CMV forneça alta expressão gênica, há relatos de que com os períodos de cultivo prolongados, a produtividade diminui 13, 14. O CMV é propenso ao silenciamento transcricional que está associado à metilação do DNA 15, 16. Em contraste, vários promotores fortes foram explorados com o objetivo de expressão potente de longo prazo de um gene. Promotores de origem mamífera têm sido usados ​​mais amplamente para este propósito, entre os quais o fator de alongamento da tradução eucariótico humano 1 alfa (EF-1α, símbolo do gene EEF1A1) o promotor é constitutivamente ativo em uma ampla gama de tipos de células. O promotor EF-1α é frequentemente ativo em células nas quais os promotores virais falham em expressar os genes controlados e em células nas quais os promotores virais são gradualmente silenciados 17-19. Alguns estudos indicaram que os promotores de genes endógenos de mamíferos, como EEF1A1 pode ser mais resistente ao silenciamento do que os promotores virais são 20-22. O promotor EF-1α usado em conjunto com regiões flanqueadoras do gene CHO EF-1α é mais ativo em células CHO em comparação com o uso de promotores CMV e SV40 isoladamente 23, 24.

Para aumentar ainda mais a função dos promotores, vários elementos intensificadores foram adicionados a montante dos promotores. Neste estudo, avaliamos o desempenho de vários elementos potenciadores, o promotor EF-1α, o promotor CAG (um promotor de fusão compreendendo um intensificador de CMV, o promotor de β-actina de galinha e um sítio aceitador de splice de β-globina de coelho) e mutantes de promotor de CMV em o vetor epissomal e testou seu nível de expressão de transgene e estabilidade em células CHO-K1. Nossos resultados devem beneficiar os pesquisadores que projetam vetores epissomais para alcançar alta expressão e estabilidade a longo prazo.


Função de um promotor de biologia

Promotores. Promotores são Sequências de DNA& # 32 cujo propósito não é codificar informações sobre o próprio organismo & # 32, mas ao invés disso, eles servem como uma espécie de interruptor & quotOn & quot para iniciar o processo biológico de transcrição para os genes que seguem a sequência de DNA do promotor. A enzima, & # 32RNA polimerase, & # 32que realiza o processo de transcrição.

O que é uma sequência promotora?

sequências promotoras. Um comprimento de DNA no início de um gene& # 32 ao qual moléculas chamadas fatores de transcrição se ligam a fim de controlar a atividade do gene, seja bloqueando ou aumentando a produção de RNA mensageiro.

O que é um promotor proximal?

Um promotor proximal é um região no ácido desoxirribonucléico (DNA)& # 32 logo antes do início de um gene onde proteínas e outras moléculas se ligam em preparação para ler esse gene. A região promotora é essencial para a maioria dos genes serem lidos e transcritos em proteínas, & # 32 tanto em células procarióticas simples quanto em eucariotos mais complexos.

Os promotores são proteínas?

Um promotor é um região do DNA onde a transcrição de um gene é iniciada. Os promotores são um componente vital dos vetores de expressão porque controlam a ligação de RNA polimerase& # 32 ao DNA. A RNA polimerase transcreve o DNA em mRNA, que é finalmente traduzido em uma proteína funcional.


Promotores comuns para eucariontes e procariontes

Incluímos duas tabelas de referência abaixo listando alguns dos promotores mais comuns de bactérias e mamíferos. Essas listas não são exaustivas, mas devem ser um bom ponto de partida ao tentar escolher o promotor perfeito!

Promotores eucarióticos

Promotor Usado principalmente para Transcrição de RNA Descrição Expressão Considerações adicionais
CMV Expressão geral mRNA Promotor de expressão de mamífero forte do citomegalovírus humano Constitutivo Pode conter uma região potenciadora. Pode ser silenciado em alguns tipos de células.
EF1a Expressão geral mRNA Expressão forte de mamífero a partir do fator de alongamento humano 1 alfa Constitutivo Tende a dar uma expressão consistente, independentemente do tipo de célula ou fisiologia.
SV40 Expressão geral mRNA Promotor de expressão de mamífero do vírus vacuolante de símio 40 Constitutivo Pode incluir um intensificador.
PGK1 (humano ou camundongo) Expressão geral mRNA Promotor de mamífero do gene fosfoglicerato e quinase. Constitutivo Expressão generalizada, mas pode variar de acordo com o tipo de célula. Tende a resistir à regulação negativa do promotor devido à metilação ou desacetilação.
Ubc Expressão geral mRNA Promotor de mamífero do gene da ubiquitina C humana Constitutivo Como o nome indica, esse promotor é onipresente.
beta actina humana Expressão geral mRNA Promotor de mamífero do gene da beta actina Constitutivo Onipresente. A versão frango é comumente usada em híbridos promotores.
CAG Expressão geral mRNA Promotor de mamífero híbrido forte Constitutivo Contém intensificador de CMV, promotor de beta actina de frango e aceitador de splice de beta-globina de coelho.
TRE Expressão geral mRNA Promotor do elemento de resposta à tetraciclina Induzível com tetracilina ou seus derivados. Normalmente contém um promotor mínimo com baixa atividade basal e vários operadores de tetraciclina. A transcrição pode ser ativada ou desativada dependendo de qual transativador tet é usado.
UAS Expressão geral mRNA Promotor de Drosophila contendo sítios de ligação Gal4 Específico Requer a presença do gene Gal4 para ativar o promotor.
Ac5 Expressão geral mRNA Forte promotor de inseto do gene Drosophila Actin 5c Constitutivo Normalmente usado em sistemas de expressão para Drosophila.
Poliedrina Expressão geral mRNA Forte promotor de inseto de baculovírus Constitutivo Normalmente usado em sistemas de expressão para células de insetos.
CaMKIIa Expressão gênica para optogenética mRNA Promotor de proteína quinase II dependente de Ca2 + / calmodulina Específico Usado para expressão neuronal / CNS. Modulado por cálcio e calmodulina.
GAL1, 10 Expressão geral mRNA Promotores adjacentes de levedura, transcritos de forma divergente Indutível com galactose reprimível com glicose Podem ser usados ​​independentemente ou em conjunto. Regulado pela GAL4 e GAL 80.
TEF1 Expressão geral mRNA Promotor do fator de alongamento da transcrição de levedura Constitutivo Análogo ao promotor EF1a de mamífero.
GDS Expressão geral mRNA Promotor de expressão de levedura forte de gliceraldeído 3-fosfago desidrogenase Constitutivo Muito forte, também chamado de TDH3 ou GAPDH.
ADH1 Expressão geral mRNA Promotor de levedura para álcool desidrogenase I Reprimido por etanol A versão completa é forte com alta expressão. Os promotores truncados são constitutivos com expressão mais baixa.
CaMV35S Expressão geral mRNA Forte promotor de planta do vírus do mosaico da couve-flor Constitutivo Ativo em dicotiledôneas, menos ativo em monocotiledôneas, com alguma atividade em células animais.
Ubi Expressão geral mRNA Promotor de planta do gene da ubiquitina de milho Constitutivo Dá alta expressão nas plantas.
H1 pequena expressão de RNA shRNA Do promotor de RNA polimerase III humana Constitutivo Pode ter expressão ligeiramente mais baixa do que U6. Pode ter melhor expressão em células neuronais.
U6 pequena expressão de RNA shRNA Do pequeno promotor nuclear U6 humano Constitutivo Murine U6 também é usado, mas pode ser menos eficiente.

Promotores procarióticos

Promotor Usado principalmente para Descrição Expressão Considerações adicionais
T7 transcrição in vitro / expressão geral Promotor do bacteriófago T7 Constitutivo, mas requer T7 RNA polimerase. Quando usado para transcrição in vitro, o promotor conduz o transcrito sentido OU antisense dependendo de sua orientação para o seu gene.
T7lac Altos níveis de expressão gênica Promotor de bacteriófago T7 mais operadores lac Expressão basal desprezível quando não induzida. Requer T7 RNA polimerase, que também é controlada pelo operador lac. Pode ser induzido por IPTG. Comumente encontrados em vetores pET. Muito estritamente regulamentado pelos operadores de lac. Bom para modular a expressão gênica por meio de concentrações variadas de indutores.
Sp6 transcrição in vitro / expressão geral Promotor do bacteriófago Sp6 Constitutivo, mas requer polimerase de RNA de SP6. A polimerase SP6 tem alta processabilidade. Quando usado para transcrição in vitro, o promotor conduz o transcrito sentido OU antisense dependendo de sua orientação para o seu gene.
araBAD Expressão geral Promotor do operon metabólico da arabinose Induzível por arabinose e repressão catabólica reprimida na presença de glicose ou por ligação competitiva do anti-indutor fucose Mais fraco. Comumente encontrados em vetores pBAD. Bom para regulação rápida e baixa expressão basal, entretanto, não é adequado para modular a expressão gênica por meio de concentrações variadas de indutores.
trp Altos níveis de expressão gênica Promotor do operon triptofano de E. coli Reprimível Fica desligado com altos níveis de triptofano celular.
laca Expressão geral Promotor do operon lac Constitutivo na ausência de repressor lac (lacI ou lacIq). Pode ser induzido por IPTG ou lactose. Promotor vazado com expressão um tanto fraca. A mutação lacIq aumenta a expressão do repressor 10x, estreitando assim a regulação do promotor lac. Bom para modular a expressão gênica por meio de concentrações variadas de indutores.
Ptac Expressão geral Promotor híbrido de lac e trp Regulado como o promotor lac Contém a região -35 de trpB e a região -10 de lac. Regulamentação muito rígida. Bom para modular a expressão gênica por meio de concentrações variadas de indutores. Geralmente melhor expressão do que lac sozinho.
pL Altos níveis de expressão gênica Promotor do bacteriófago lambda Pode ser regulável por temperatura Freqüentemente emparelhado com o repressor cI857 sensível à temperatura.
T3 transcrição in vitro / expressão geral Promotor do bacteriófago T3 Constitutivo, mas requer T3 RNA polimerase Quando usado para transcrição in vitro, o promotor conduz a transcrição sentido OU antisense dependendo de sua orientação para o seu gene

Embora esta lista seja um ótimo lugar para começar, as tabelas acima não se aprofundam no tecido ou nos promotores específicos de desenvolvimento disponíveis para os cientistas. Os plasmídeos são muitas vezes utilizados para fins terapêuticos e, nesses casos, é importante identificar os promotores específicos do tecido corretos, conforme descrito pelos pesquisadores do NIH aqui.

Nota: A. Max Juchheim contribuiu para a redação deste artigo.


PSF-EF1-UB-NEO / G418 ASCI - EF1 ALFA PROMOTOR G418 SELEÇÃO DE PLASMIDE

Nível de expressão do promotor: Este plasmídeo contém o promotor do fator de alongamento humano 1 para dirigir a expressão da proteína. O promotor EF1 alfa contém um grande íntron que ajuda a manter a expressão do promotor em cultura de longo prazo. Embora mostre uma expressão significativamente mais baixa na maioria dos tipos de células em comparação com o promotor CMV por transfecção transitória, o promotor pode manter a atividade por mais tempo em muitos tipos de células ao fazer linhas de células estáveis. O promotor ubiquitina que conduz o gene de resistência G418 demonstra níveis semelhantes de expressão ao promotor EF1 alfa na maioria dos tipos de células. O promotor Ubiquitina contém um grande intron que ajuda a manter a atividade do promotor.

Aplicativo

Clonagem em um gene: Este plasmídeo foi projetado para ser compatível com uma variedade de técnicas de clonagem. O local de clonagem múltipla contém uma variedade de locais de restrição comumente usados ​​para clonagem. Usando esses locais, os genes podem ser inseridos usando métodos de clonagem padrão com DNA ligase. Outros métodos, como clonagem independente de ligase (LIC) Gibson Assembly InFusionHD ou Seamless GeneArt, também podem ser usados ​​e, como todos os nossos plasmídeos são baseados no mesmo backbone, o mesmo método pode ser usado para clonagem em todos os nossos vetores de catálogo.

Notas de sites de clonagem múltipla: Existem alguns sites importantes no MCS. Isso inclui o site NcoI, o site XbaI e os sites BsgI e BseRI. O local NcoI contém um códon inicial que está imediatamente a jusante de um local de ligação ribossômica Kozak e Shine-Dalgarno. Isso permite o posicionamento ideal dos genes quando o códon de início é colocado neste local. Se isso não for necessário e você deseja usar um local a jusante para clonagem de genes, você pode remover o local NcoI clivando o plasmídeo com KpnI.

O site XbaI contém um códon de parada. Este códon de parada é posicionado em uma posição específica em relação aos locais BsgI e BseRI que estão imediatamente a jusante. Quando BseRI ou BsgI clivam o plasmídeo, eles produzem uma saliência TA a partir do códon de parada no local XbaI que é compatível com todos os nossos plasmídeos de marcação de peptídeo cortados com os mesmos locais. Os locais BseRI e BsgI são não palíndrômicos e clivam um número definido de bases de seu local de ligação.

Sempre que clonamos um gene em nosso sítio de clonagem múltipla, sempre posicionamos o códon de início e de parada nas mesmas posições no MCS. Se o início e o fim dos genes não forem compatíveis com NcoI e XbaI, estendemos a sequência para os locais externos mais próximos, mas mantemos as localizações dos códons de início e parada consistentes.


Métodos

Cultura parasita

Neste estudo, B. gibsoni A cepa Oita [17] foi cultivada em vitro em placas de cultura de 24 poços (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) a 37 ° C em CO umidificado2 (5%) e O2 (5%) incubadora (BIO-LABO, Tóquio, Japão). O parasita foi cultivado em 10% de eritrócitos caninos suspensos em RPMI-1640 suplementado com 20% de soro canino.

Avaliação de B. gibsoni sensibilidade para WR99210

Babesia gibsoni era culto em vitro em placas de cultura de 96 poços com 100 μl de meio RPMI-1640 contendo 10% de eritrócitos caninos suplementados com 20% de soro de cão e diferentes concentrações de WR99210 (0,1, 0,5, 1, 5, 10 e 100 nM). Para cada concentração de fármaco, os parasitas foram cultivados em poços triplicados e o meio de cultura foi substituído diariamente. A parasitemia foi calculada no dia 3 examinando 3.000 eritrócitos de um esfregaço de sangue preparado e corado com solução de Giemsa.

Construções de plasmídeo

O diagrama esquemático do plasmídeo usado neste estudo (pBS-EGRADE) é mostrado na Fig. 1a. O gene repórter e os cassetes do gene de seleção de drogas foram separados a fim de conduzir gfp e hdhfr com Bg 5′-ef-1α (IG-B) e Bg 5′-actina promotores, respectivamente. Bg 5′-ef-1α (IG-B) e Bg 3′-ef-1α foram usados ​​como locais de recombinação clonados a montante e a jusante do gfp e hdhfr genes, respectivamente. Todos os pares de iniciadores de PCR usados ​​para a construção do plasmídeo estão listados na Tabela 1 e os locais de restrição estão sublinhados. O plasmídeo construído foi purificado usando o kit Qiagen® Plasmid Maxi (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante e foi confirmado por sequenciação antes da transfecção. A sequência do plasmídeo pBS-EGRADE foi depositada na base de dados GenBank com o número de acesso MG913246.

Diagrama esquemático do construto de plasmídeo que expressa GFP (pBS-EGRADE) e imagens de microscopia de fluorescência de GFP que expressa de forma estável B. gibsoni. uma Construto de plasmídeo de pBS-EGRADE mostrando os locais de recombinação para integração em ef-1α locus por recombinação homóloga de cruzamento duplo. O local de restrição para linearização (Kpn I) é mostrado. b Imagens de microscopia de fluorescência de expressão de GFP estável B. gibsoni. O painel mesclado mostra a sobreposição de fluorescência de GFP e Hoechst (núcleos do parasita). O núcleo do parasita foi corado com Hoechst 33342

Transfecção de parasitas

Babesia gibsonihemácias infectadas (iRBCs) foram pré-tratadas conforme descrito anteriormente [13]. A transfecção foi conduzida usando 20 μg de plasmídeo pBS-EGRADE linearizado. As misturas de plasmídeo-iRBCs foram transfectadas usando tampão Lonza SF e o programa FA113 do dispositivo Amaxa 4D Nucleofector ™ (Lonza, Colônia, Alemanha) e imediatamente transferidas para uma cultura pré-aquecida contendo 10% de RBCs frescos. Para evitar o rápido em vitro envelhecimento dos eritrócitos caninos, os parasitas transfectados foram subcultivados todas as semanas e suplementados com eritrócitos frescos. Para selecionar parasitas transgênicos que expressam GFP, WR99210 10 nM foi adicionado ao meio de cultura dois dias após a transfecção. Após 4 semanas de seleção da droga, a população do parasita foi clonada em uma placa de cultura de 96 poços usando diluição limitante, conforme descrito anteriormente [16].

Caracterização de PCR de expressão de GFP B. gibsoni

Três conjuntos de primers (Tabela 1) foram usados ​​para confirmar a integração de pBS-EGRADE em B. gibsoni ef-1α locus. O par de iniciadores Integ-F e GFP-R foi usado para amplificar um fragmento de DNA de 1,6 kb para confirmar a recombinação 5 '. O par de iniciadores hDHFR-F e Integ-R foi usado para amplificar um fragmento de DNA de 2,0 kb para examinar a recombinação 3 ', enquanto o par de iniciadores GFP-F e hDHFR-R foi usado para amplificar um fragmento de DNA de 4,1 kb para detectar a região de inserção. Os fragmentos de DNA amplificados foram confirmados por sequenciamento.

Análise Southern blot

Dois microgramas de DNA genômico do tipo selvagem (WT) e do genoma integrado (GI) B. gibsoni foram digeridos durante a noite com 20 unidades de Sca eu e Sph I. Os produtos da digestão foram separados por eletroforese em gel de agarose, transferidos para membrana Hybond N + (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), em seguida, hibridizados com sondas marcadas usando um Kit AlkPhos Direct (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) de acordo com o fabricante instruções. Duas sondas correspondentes ao quadro de leitura aberto completo (ORF) de gfp e o comprimento de 0,4 kb de Bg 3′-ef-1α fragmento, respectivamente. Os pares de primer usados ​​para amplificar as sondas estão listados na Tabela 1. O sinal da sonda foi detectado usando um reagente de detecção estrela CDP (GE Healthcare).

Curvas de crescimento

Parasitas WT e GI foram continuamente cultivados de aproximadamente 0,5% de parasitemia por subculturas a cada 3 dias por duas gerações. A parasitemia foi monitorada diariamente examinando 3.000 hemácias com coloração de Giemsa.


Com nova ferramenta para biologia sintética, pesquisadores usam bactérias para desenvolver fotos

Pesquisadores da Universidade de Friburgo e ETH Zurique / Suíça desenvolveram uma nova ferramenta optogenética e demonstraram sua eficácia com uma bacteriografia do pôster do filme Blade Runner (1982). Crédito: Universität Freiburg / Barbara Di Ventura. Original: Warner Bros. Pictures

Assim como a levedura serve nas padarias como ajudante unicelular, a bactéria Escherischia coli é obrigatória em todos os laboratórios de biotecnologia. Uma equipe liderada pela Profa. Dra. Barbara Di Ventura, professora de pesquisa de sinalização biológica na Universidade de Freiburg, desenvolveu uma nova ferramenta chamada optogenética que simplifica um método padrão em biotecnologia: em vez de alimentar as bactérias com açúcar como comumente feito , os pesquisadores agora podem simplesmente lançar luz sobre eles. Di Ventura, Prof. Dr. Mustafa Hani Khammash da ETH Zurique / Suíça e suas equipes, os primeiros autores Edoardo Romano e Dr. Armin Baumschlager, publicaram seus resultados em Nature Chemical Biology.

"Chamamos o novo sistema de BLADE - dímeros AraC indutíveis por luz azul em Escherichia coli", explica Romano. Os cientistas controlam a expressão de um gene desejado na bactéria E. coli usando o promotor PBAD, que faz parte da rede genética que regula o metabolismo do açúcar arabinose nas bactérias. Isso permite que eles produzam proteínas seletivamente e estudem os processos de sinalização nas bactérias. "Esta nova construção guiada por luz pode substituir o sistema de expressão do gene arabinose amplamente difundido, facilitando a adoção da optogenética entre microbiologistas", explica Di Ventura, que é membro do Clusters de Excelência CIBSS - Centro de Estudos Integrativos de Sinalização Biológica e BIOSS —Centro de Estudos de Sinalização Biológica.

A optogenética usa proteínas que respondem à luz para regular as funções celulares. “O BLADE é destinado ao uso em biologia sintética, microbiologia e biotecnologia. Mostramos que nossa ferramenta pode ser usada de forma direcionada, que é rápida e reversível”, comenta Di Ventura. Para demonstrar com que precisão o BLADE responde à luz, Di Ventura e sua equipe fizeram bacteriografias: imagens criadas a partir de culturas bacterianas. BLADE consiste em uma proteína sensível à luz e um fator de transcrição: uma proteína que se liga a uma sequência específica do DNA encontrada na chamada região promotora de um gene e controla se o gene correspondente é lido pela maquinaria celular. Os pesquisadores controlaram com BLADE a expressão do gene que codifica uma proteína fluorescente para criar as bacteriografias.

Os cientistas de Freiburg iluminaram o gramado bacteriano por meio de uma fotomáscara colada na tampa das placas de Petri. As bactérias apresentaram fluorescência no ponto em que foram iluminadas, porque o BLADE foi ativado: As imagens foram criadas em um microscópio de fluorescência. Em outro experimento, os pesquisadores usaram o BLADE para regular genes que tornam as células de E. coli mais longas, mais grossas e em forma de bastonete. Foi até possível reverter as mudanças: as células voltaram à forma original após quatro horas sem luz. Dessa forma, o sistema pode ser usado para estudar muitos outros genes - até mesmo genes que não são de E. coli.


Fundo

Carrapatos e doenças transmitidas por carrapatos (TBDs) têm grande impacto na produção de alimentos e na saúde pública. A babesiose bovina é reconhecida como uma das mais importantes TBD em termos de perdas econômicas em todo o mundo [1]. A babesiose bovina pode ser em parte controlada com vacinas vivas atenuadas, mas essas vacinas são difíceis de produzir e distribuir, têm riscos de segurança e uma vida útil limitada [2]. A existência de inúmeras lacunas de pesquisa sobre as relações parasita-hospedeiro limita as opções para o desenvolvimento de métodos aprimorados de controle. Novas ferramentas de pesquisa são necessárias para preencher essas lacunas de conhecimento e apoiar o desenvolvimento de novos métodos de controle Babesia parasitas e seus vetores [3]. Babesia bovis e B. bigemina são os principais parasitas responsáveis ​​pela babesiose bovina em termos de distribuição parasitária global, enquanto Babesia divergens é prevalente principalmente no continente europeu [1].

Em geral B. bovis é considerado o mais virulento Babesia parasita, enquanto, B. bigemina causa doença hemolítica aguda [4]. Apesar de B. bovis genoma e sistemas de transfecção foram desenvolvidos há vários anos [5, 6], o genoma para B. bigemina permanece incompleto e desmontado (http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/protozoa/babesia-bigemina.html), e edição de genes e sistemas de transfecção para B. bigemina permanecem indisponíveis. Transfectado atenuado Babesia parasitas são candidatos ideais para a entrega de antígenos de vacina anti-carrapato ou outros agentes anti-TBD [7]. Considerando que B. bigemina tem uma gama mais ampla de vetores de carrapatos do que B. bovis, Incluindo Rhipicephalus (Boophilus) microplus [8], B. annulatus [9] e B. decoloratus [10, 11] esse parasita também deve ser considerado como um candidato eficiente para o desenvolvimento de abordagens de vacinas duplas parasita-vetor.

Sistemas de edição e transfecção de genes, além de um genoma completo, são necessários para avançar nossa compreensão da biologia molecular de B. bigemina parasitas e para um melhor desenvolvimento de vacinas. Uma limitação atual para o desenvolvimento de tais sistemas de análise de genes é a falta de B. bigemina promotores e um método para introduzir DNA estranho em B. bigemina. Os promotores que controlam a expressão do fator de alongamento 1-alfa (ef-1α) genes em parasitas apicomplexos são geralmente considerados fortes promotores constitutivos [12, 13]. No B. bovis a ef-1α inclui um arranjo de dois genes head to head idênticos separados por uma região de 1,4 kb contendo dois promotores aparentemente distintos [12, 13]. Portanto, uma abordagem racional para a identificação de B. bigemina promotores consiste em procurar a presença de um arranjo estrutural e funcional semelhante para o ef-1α locus neste parasita.

Dada a atual indisponibilidade de um sistema genético para melhor caracterizar a base molecular para B. bigemina virulência e para facilitar o desenvolvimento de vacinas, propusemos definir promotores e um método para introduzir DNA estranho no parasita. Neste estudo, descrevemos o ef-1α locus de B. bigemina, e testou a atividade de ef-1α promotores. Os dados gerados neste estudo podem servir como base para o desenvolvimento futuro de edição de genes urgentemente necessária e sistemas de transfecção estáveis ​​para B. bigemina.


Caracterização funcional de fragmentos de deleção de comprimento total e 5 ′ de Citrus sinensis- promotores constitutivos derivados em Nicotiana Benthamiana

Fragmentos de comprimento total e 5 'de deleção de três promotores gênicos expressos constitutivamente identificados a partir do Citrus sinensis L. genoma (ciclofilina (CsCYP), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase C2 (CsGAPC2) e fator de alongamento 1-alfa (CsEF1)) foram avaliados quanto à sua capacidade de expressar o uidUm gene em tecidos de folha, caule e raiz de transgênicos N. benthamiana plantas. De acordo com os ensaios fluorométricos GUS, a atividade do promotor CsGAPC2 foi significativamente reduzida nas folhas quando a sequência entre as posições - 1090 e - 497 foi removida, enquanto a atividade permaneceu inalterada nas raízes. A atividade do promotor CsCYP não foi afetada pelas diferentes deleções, e mesmo o menor fragmento avaliado foi suficiente para manter a expressão do uidUm gene em N. benthamiana folhas e raízes. Fragmentos do promotor truncado de CsEF1 conferiram maior atividade GUS nas folhas em comparação com o promotor de comprimento total, enquanto a atividade GUS não foi afetada nas raízes. A remoção do intron na 5 ′ UTR do promotor CsEF1 reduziu a expressão gênica nas raízes, embora não tenha causado redução no nível de expressão gênica nas folhas. Estes resultados indicam que qualquer uma das três deleções do promotor CsCYP pode ser utilizada para a expressão de genes eficiente. Além disso, o promotor CsGAPC2 de comprimento total e dois dos fragmentos do promotor CsEF1 truncado foram suficientes para uidUma expressão gênica.

Esta é uma prévia do conteúdo da assinatura, acesso através de sua instituição.


Assista o vídeo: Promoters (Julho 2022).


Comentários:

  1. Tabor

    Bem, como poderia ser? Estou procurando como esclarecer este tópico.

  2. Gumaa

    tudo pode ser =))))))

  3. Atherton

    SIM, um bem variante

  4. Roger

    Considero, que você está enganado. Vamos discutir isso. Escreva para mim em PM, vamos nos comunicar.

  5. Nemausus

    Concedido, isso terá uma ideia diferente apenas pela maneira



Escreve uma mensagem