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10.8: Algas Verdes - Precursores de Plantas Terrestres - Biologia

10.8: Algas Verdes - Precursores de Plantas Terrestres - Biologia


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Estreptófitos

Até recentemente, todos os eucariotos fotossintéticos eram considerados membros do reino Plantae. Isso ocorre porque, além de sua capacidade de capturar a energia da luz e fixar o CO2, eles carecem de muitos traços estruturais e bioquímicos que distinguem plantas de protistas. As algas verdes contêm os mesmos carotenóides e clorofila uma e b como plantas terrestres, enquanto outras algas têm diferentes pigmentos acessórios e tipos de moléculas de clorofila, além da clorofila uma. Consequentemente, as plantas terrestres e as algas verdes intimamente relacionadas fazem agora parte de um novo grupo monofilético denominado Streptophyta.

As algas verdes restantes, que pertencem a um grupo denominado Chlorophyta, incluem mais de 7.000 espécies diferentes que vivem em água doce ou salobra, na água do mar ou em manchas de neve. Algumas algas verdes sobrevivem até no solo, desde que seja coberto por uma fina película de umidade na qual possam viver. As secas periódicas fornecem uma vantagem seletiva para as algas que podem sobreviver ao estresse hídrico. Algumas algas verdes podem já ser familiares, em particular Spirogyra e desmids. Suas células contêm cloroplastos que exibem uma variedade estonteante de formas, e suas paredes celulares contêm celulose, assim como as plantas terrestres. Algumas algas verdes são células únicas, como Clorela e Chlamydomonas, o que aumenta a ambigüidade da classificação de algas verdes, porque as plantas são multicelulares. Outras algas, como Ulva (comumente chamada de alface-do-mar), forma colônias (Figura 1).

Reprodução de Algas Verdes

As algas verdes se reproduzem assexuadamente, por fragmentação ou dispersão de esporos, ou sexualmente, pela produção de gametas que se fundem durante a fertilização. Em um organismo unicelular, como Chlamydomonas, não há mitose após a fertilização. No multicelular Ulva, um esporófito cresce por mitose após a fertilização (e, portanto, exibe alternância de gerações). Ambos Chlamydomonas e Ulva produzir gametas flagelados.

Charales

Os carófitos incluem várias ordens diferentes de algas que foram sugeridas como parentes mais próximos das plantas terrestres: os Charales, os Zygnematales e os Coleochaetales. Os Charales remontam a 420 milhões de anos. Eles vivem em uma variedade de habitats de água doce e variam em tamanho de alguns milímetros a um metro de comprimento. O gênero representativo é Chara (Figura 25.8), frequentemente chamada de muskgrass ou skunkweed devido ao seu cheiro desagradável. Células grandes formam o talo: o principal caule da alga. Ramificações que surgem dos nós são feitas de células menores. Estruturas reprodutivas masculinas e femininas são encontradas nos nódulos, e os espermatozoides têm flagelos. Embora Chara se parece superficialmente com algumas plantas terrestres, a principal diferença é que o caule não tem tecido de suporte. No entanto, os Charales exibem uma série de características que são significativas para a adaptação à vida terrestre. Eles produzem os compostos lignina e esporopolenina, e formam plasmodesmas que conectam o citoplasma de células adjacentes. Embora o ciclo de vida dos Charales seja haplôntico (a forma principal é haplóide e os zigotos diplóides são formados, mas têm uma existência breve), o ovo e, mais tarde, o zigoto, formam-se em uma câmara protegida na planta-mãe haplóide.

Os Coleochaetes são formas multicelulares ramificadas ou disclike. Eles podem produzir sexualmente e assexuadamente, mas o ciclo de vida é basicamente haplôntico. A extensa análise recente da sequência de DNA de carófitos indica que os Zygnematales estão mais intimamente relacionados aos embriófitos do que os Charales ou os Coleochaetales. Os Zygnematales incluem o gênero familiar Spirogyra, bem como os desmids. Conforme as técnicas de análise de DNA melhoram e novas informações sobre genômica comparativa surgem, as conexões filogenéticas entre os carófitos e as plantas terrestres continuarão a ser examinadas para produzir uma solução satisfatória para o mistério da origem das plantas terrestres.


Plantas I

Nas briófitas, os gametófitos são a fase maior e mais evidente do ciclo de vida.

O gametófito é haplóide e produz gametas haplóides por mitose.

Os nutrientes são transferidos dos pais para o embrião por meio de células de transferência da placenta.

As células diplóides chamadas esporócitos sofrem meiose para gerar esporos haplóides.

Os gametângios femininos, chamados arquegônios, produzem óvulos e são o local da fertilização.

Os rizóides ancoram os gametófitos ao substrato.

Sphagnum, ou "musgo de turfa", forma extensos depósitos de material orgânico parcialmente decomposto conhecido como turfa.

O floema consiste em células vivas e distribui açúcares, aminoácidos e outros produtos orgânicos.

Eles permitem que as plantas vasculares absorvam água e nutrientes do solo.

As folhas são categorizadas por dois tipos:
Microfilos, folhas com uma única nervura.
Megafilos, folhas com sistema vascular altamente ramificado.


Fundo

Os esteróis são componentes vitais de todas as células eucarióticas [1]. Em plantas superiores, eles desempenham um papel estrutural na viabilidade celular, embriogênese, formação de padrões, divisão celular, biogênese do cloroplasto e modulação da atividade e distribuição de proteínas ligadas à membrana, como enzimas e receptores [2, 3]. Além disso, os esteróis são precursores de muitas moléculas de sinalização que regulam o crescimento e o desenvolvimento em plantas e animais, como hormônios de muda de insetos ecdiesteróides [4], hormônios esteróides de mamíferos [5] e hormônios vegetais de brassinosteróides (BR) [6].

Os esteróis pertencem a uma classe de isoprenóides derivados do isopentenil pirofosfato (IPP), um precursor universal dos isoprenóides. Em animais e fungos, a via do ácido mevalônico citoplasmático (MVA) é a única via para a biossíntese de IPP, o bloco de construção do lanosterol, que é então metabolizado em colesterol em animais e ergosterol em fungos [7]. Em plantas superiores, a IPP pode ser derivada por meio da via MVA ou da via de 1-desoxi xilulose 5-fosfato plastidial ou fosfato de metileritritol (MEP), apesar da primeira ser o principal contribuinte para a biossíntese de esterol [8, 9]. No Arabidopsis, mutantes biossintéticos de esterol podem ser classificados em dois grupos distintos: mutantes independentes de BR, que são defeituosos em genes na via de cicloartenol a 24-metilenelofenol [10], e mutantes dependentes de BR, que são defeituosos em genes na última parte da via biossintética do esterol (do 24-metilenelofenol ao campesterol, que é considerado o precursor dos BRs) [11]. Além de servir como um precursor de BR, os esteróis parecem desempenhar funções de sinalização distintas durante o desenvolvimento da planta, uma vez que fenótipos de esteróis biossintéticos mutantes não podem ser resgatados pela adição de BR exógeno [12].

A co-regulação da síntese de esteróis e produção de ácidos graxos (AF) é essencial para manter o equilíbrio da biossíntese versus turnover das membranas durante o crescimento celular [13]. Em animais, os esteróis e os FAs são regulados de forma coordenada por um sistema de feedback mediado por uma família conservada de fatores de transcrição chamados proteínas de ligação do elemento regulador de esterol (SREBPs), que controla uma cascata de enzimas biossintéticas para colesterol endógeno, FA, triacilglicerol (TAG) e fosfolípido [14, 15]. SREBP ativado se liga a elementos de resposta de esterol nas regiões promotoras e / ou potenciadoras de genes alvo e induz a transcrição de pelo menos 30 genes de síntese de colesterol e lipídios (particularmente aqueles que codificam enzimas limitantes de taxa, tais como hidroxi-metil-glutaril-CoA redutase, HMGR e tipo I FA sintase, FAS) [16]. A manipulação desta cascata regulatória em camundongos transgênicos resultou em aumentos de 6 e 22 vezes no conteúdo de colesterol e de TAG, respectivamente, e conseqüentemente em fígados gordurosos maciços [17].

As microalgas são matéria-prima promissora para a produção sustentável e escalonável de biocombustíveis [18], no entanto, poucas cepas de microalgas encontradas na natureza são dotadas da ampla gama de características exigidas por um esquema de produção em larga escala e economicamente competitivo [19]. Portanto, é urgente identificar moléculas e mecanismos que regulam o crescimento, o desenvolvimento e as respostas ao estresse de microalgas para melhorar a cepa. Esteróis em microalgas apresentam enorme diversidade devido ao alto grau de heterogeneidade filogenética, o grande número de gêneros e a longa distância evolutiva entre muitos deles [20, 21]. Há muito tempo foi demonstrado que a composição dos esteróis nas microalgas varia de acordo com as mudanças no estágio de crescimento, espectro de luz ou temperatura, sugerindo papéis importantes, embora amplamente desconhecidos, dos esteróis [22]. Portanto, a manipulação da biossíntese e regulação de esteróis oferece potencial para a engenharia de produção de lipídios. A exploração do mecanismo regulador da lipogênese dependente de esterol em microalgas pode fornecer novas estratégias e alvos para aumentar a produção de lipídios em microalgas. No entanto, pouco se sabe sobre os papéis, biossíntese e regulação de esteróis em microalgas e, em particular, se e como o metabolismo de esterol e AF é co-regulado.

Nanocloropsis spp. são um gênero de microalgas fotossintéticas unicelulares pertencentes aos heterocontes. Eles são amplamente distribuídos no ambiente marinho, bem como em águas doces e salgadas. Essas algas são de interesse industrial porque crescem rapidamente e podem sintetizar grandes quantidades de TAG e ácidos graxos poliinsaturados de alto valor (por exemplo, ácido eicosapentaenóico) [23]. Os genomas de várias espécies de oleaginosas Nanocloropsis spp. foram sequenciados e anotados [23–27]. Empregando uma microalga oleaginosa industrial N. oceanica IMET1 como modelo, este estudo teve como objetivo determinar a composição de esterol e a via biossintética em microalgas, investigar o papel da biossíntese de esterol na fotossíntese e crescimento, estudar a influência do suprimento de luz e nitrogênio e investigar os efeitos dos níveis de esterol. na acumulação de FA. Nossas descobertas expandem a compreensão da função do esterol em microalgas e devem auxiliar a engenharia genética ou de processo racional para a produção baseada em microalgas de biocombustíveis ou outros bioprodutos de valor agregado.


Estrutura e mecanismo da enzima vegetal evolutivamente única chalcona isomerase

A chalcona isomerase (CHI) catalisa a ciclização intramolecular da chalcona sintetizada pela chalcona sintetase (CHS) em (2S) -naringenina, um composto essencial na biossíntese de pigmentos antocianina, indutores de Rhizobium genes de nodulação e fitoalexinas antimicrobianas. A estrutura de cristal de resolução de 1,85 Å de alfafa CHI em complexo com (2S) -naringenina revela uma nova dobra em sanduíche β de face aberta. Atualmente, proteínas com sequências primárias homólogas são encontradas apenas em plantas superiores. A topologia da fenda do sítio ativo define a estereoquímica da reação de ciclização. A estrutura e a análise mutacional sugerem um mecanismo no qual a complementaridade da forma da fenda de ligação bloqueia o substrato em uma conformação restrita que permite que a reação prossiga com uma constante de taxa de segunda ordem que se aproxima do limite de difusão controlada. Essa estrutura levanta questões sobre a história evolutiva dessa enzima vegetal estruturalmente única.


2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Condições de cultura de algas

P. tricornutum (CCMP2561), obtido da coleção de cultura do Centro Nacional de Cultura de Fitoplâncton Marinho Provasoli-Guillard, Laboratório Bigelow para Ciências do Oceano, foi mantido e cultivado em meio F / 2 contendo 20 g / L de sal marinho. A cepa foi denotada como Pt1 com um morfotipo fusiforme (De Martino et al., 2007). Resumidamente, 10 ml de meio F / 2 líquido foram inoculados com células de placas de ágar e a alga foi cultivada aerobicamente em frascos de 50 ml a 23 ° C por 6 dias (agitação manual duas vezes por dia) iluminados com luz contínua de 30 µE m - 2 s −1 (luz de tubo fluorescente branco frio, a partir do topo). As células de algas foram então inoculadas a 10% (v / v) em frascos de 250 ml para crescimento com agitação orbital a 150 rpm em um agitador orbital (Zhichu) e iluminação constante de 30 µE m −2 s −1. Células de algas cultivadas até a fase exponencial tardia foram usadas como sementes para experimentos.

Para o tratamento da privação de nitrogênio (ND), as sementes foram colhidas, lavadas duas vezes com meio F / 2 sem nitrogênio e ressuspensas neste meio. As células ressuspensas em meio F / 2 (repleto de nitrogênio, NR) foram usadas como controle. Ambos tinham um número inicial de células de 1,5 × 10 6 ml −1 e foram cultivados por 4 dias com agitação orbital a 150 rpm e iluminação constante de 30 µE m −2 s −1. Para a comparação entre o tipo selvagem (WT) e as cepas transgênicas de P. tricornutum, as células foram inoculadas com um número de células inicial de 5 × 10 5 ml −1 e deixadas crescer por 12 dias com agitação orbital a 150 rpm e iluminação constante de 30 µE m −2 s −1.

2.2 Clonagem e análise in silico de P. tricornutum DGATs

Para obter a sequência de codificação de comprimento total de PtDGAT1, suas regiões não traduzidas foram primeiro determinadas por amplificação rápida 5 'e 3' das extremidades de cDNA (RACE) -PCR usando o kit SMARTer RACE 5 '/ 3' (TaKaRa). Em seguida, pares de primers foram usados ​​para amplificar a sequência de codificação de comprimento total, que foi verificada por sequenciamento e depositada no NCBI GenBank (número de acesso MN061782). As sequências de PtDGAT2A Através dos PtDGAT2D e PtDGAT3 foram recuperados do NCBI GenBank (JX469835, JQ837823, JX469836, JX469837 e XM_002184438).

O alinhamento de sequência de polipeptídeos DGAT de vários organismos foi conduzido usando ClustalX2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) e a árvore filogenética foi gerada usando MEGA6 (Tamura et al., 2013). As hélices transmembrana de PtDGATs foram previstas usando TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).

2.3 Isolamento de RNA e PCR quantitativo em tempo real

A extração de RNA total (de cerca de 10 7 células de algas) e a remoção de DNA contaminado foram realizadas usando o kit de extração de RNA de plantas (TaKaRa). Após a síntese do cDNA, a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foi conduzida em um 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) com SYBR ® Premix Ex Taq ™ II (TaKaRa), seguindo nossos procedimentos descritos anteriormente (Wei et al. ., 2017). As sequências de primer usadas para qPCR estão listadas na Tabela S1. O nível de expressão de mRNA de PtDGAT os genes foram normalizados usando o gene da actina como controle interno.

2.4 Complementação funcional de PtDGATs na levedura deficiente em TAG

Os seis PtDGAT os genes foram amplificados por PCR usando cDNA como molde e clonados no vetor de expressão de levedura pYES2-CT (Invitrogen), usando o kit de clonagem In Fusion Advantage PCR (TaKaRa). Os iniciadores de PCR para a clonagem estão listados na Tabela S1. Os plasmídeos recombinantes, uma vez confirmados por sequenciamento, foram cada um introduzidos na cepa mutante quádrupla deficiente em TAG H1246 de Saccharomyces cerevisiae (Sandager et al., 2002). O vetor vazio (EV) pYES2-CT foi usado como controle negativo. Os transformantes de levedura, após verificação por PCR de Colônia, foram cultivados em meio SD / -Ura contendo 2% (p / v) de galactose para induzir a expressão do transgene. Para o experimento de ácido graxo livre, ácido linoléico (C18: 2), ácido α-linolênico (C18: 3n3) e ácido eicosapentaenóico (C20: 5n3) foram alimentados a culturas de levedura por indução de galactose a uma concentração de 100 µM, como descrito por Mao et al. (2019). Após 2 dias de cultivo, as culturas de levedura foram colhidas para análise de lipídios e coloração fluorescente.

2.5 Ensaio in vitro de PtDGATs

A indução da expressão heteróloga de PtDGAT genes em H1246 e a preparação de microssomas dessas cepas de levedura contendo PtDGATs foram conduzidos de acordo com nossos procedimentos descritos anteriormente (Liu et al., 2017). As frações microssômicas preparadas foram cada uma ressuspensas no tampão de armazenamento (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, glicerol a 10%) para ensaio in vitro subsequente.

O ensaio DGAT in vitro foi realizado em um sistema de reação de 200 µl, que consiste em 20 µg de proteína microssomal, 250 µM de ambos os substratos acil-CoA e DAG, e 10 mM de MgCl2 em tampão de fosfato de potássio (Liu et al., 2017). DAG (16: 1/16: 1) foi usado como o aceitador de acila, enquanto 16: 0-CoA, 16: 1-CoA e C20: 5-CoA foram usados ​​como o doador de acila, todos foram adquiridos na Larodan Fine Chemicals.

2.6 Superexpressão de PtDGATs em P. tricornutum

As sequências de codificação de PtDGAT1, PtDGAT2A Através dos PtDGAT2D e PtDGAT3 cada um foi subclonado no P. tricornutum vetor de expressão peGFP (Zhang & Hu, 2014), usando o kit de clonagem In Fusion Advantage PCR (TaKaRa). Os iniciadores de PCR para a clonagem estão listados na Tabela S1. A transformação de P. tricornutum via eletroporação seguiu nossos protocolos descritos anteriormente (Zhang & Hu, 2014). Transformantes putativos selecionados em meio sólido F / 2 contendo 75 μg / ml de zeocina foram verificados por PCR genômico. Em seguida, qPCR foi realizada para determinar o nível de expressão dos transgenes nos transformantes selecionados. Duas cepas com os níveis de expressão mais altos para cada transgene foram escolhidas para outros experimentos.

2.7 Análises de microscopia fluorescente e confocal

Para a observação de lipídios neutros em P. tricornutum e células de levedura, foram primeiro coradas com fluorescência BODIPY ™ 505/515 (Invitrogen) com uma concentração de trabalho de 1 µg / ml por 10 min em temperatura ambiente e, em seguida, visualizadas em um Microscópio de Fluorescência Olympus BX51 (Olympus) com excitação em 488 nm e emissão entre 505 e 530 nm. Para localização subcelular de PtDGATs, as cepas de algas transgênicas correspondentes foram visualizadas em um microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP8. A fluorescência de GFP foi observada com excitação em 488 nm e emissão em 500–525 nm, e autofluorescência de clorofila foi observada com excitação em 488 nm e emissão em 650–750 nm. Para observar o núcleo das células de algas, elas foram coradas com Hoechst 33342 (Invitrogen) a uma concentração de 5 µM por 30 min em temperatura ambiente e depois visualizadas com excitação em 405 nm e emissão em 425-475 nm.

2.8 Métodos analíticos

Contagem de células usando hemocitômetro sob microscópio de luz e determinação gravimétrica do peso seco para P. tricornutum seguiu nossos procedimentos descritos anteriormente (Liu et al., 2019). O rendimento quântico máximo de PSII, Fv/Fm ou FmFo/Fm, foi medido em uma fluorometria modulada por amplitude de pulso (PAM) (Water-PAM, Walz), usando célula de algas adaptada ao escuro de 2 horas (Liu et al., 2019): Fo foi registrado sob uma luz fraca (& lt10 μmol m −2 s −1, com pico em 650 nm) e Fm estava sob um pulso de saturação (0,8 s) de luz vermelha (3.000 μmol m −2 s −1, com pico em 660 nm). Conteúdo de proteína em P. tricornutum as células foram determinadas de acordo com Meijer e Wijffels (1998), usando amostras de algas liofilizadas. Conteúdo de carboidratos em P. tricornutum as células foram determinadas pelo método colorimétrico (Renaud et al., 1999), após hidrólise das amostras de algas liofilizadas com 4 M H2TÃO4.

Lipídios de levedura e P. tricornutum as células foram extraídas com clorofórmio-metanol (2: 1, v / v) conforme descrito anteriormente por Mao et al. (2019). Para análise de cromatografia em camada fina (TLC), os lipídios extraídos foram separados em uma placa de sílica gel 60 TLC (Merck) usando uma mistura de hexano / éter terc-butilmetílico / ácido acético (80/20/2, por vol) como o fase móvel (Liu et al., 2016). Após a separação, o TAG na placa de TLC foi visualizado com vapor de iodo, recuperado e transesterificado com ácido sulfúrico 1,5% em metanol a 85 ° C durante 2,5 horas. Lípidos totais de P. tricornutum e as culturas de levedura e os produtos de reação dos ensaios DGAT in vitro foram transesterificados diretamente.

Ésteres metílicos de ácidos graxos preparados a partir da transesterificação de lipídios foram analisados ​​usando um cromatógrafo de gás capilar Agilent 7890 equipado com um detector de espectrometria de massa 5975 C e uma coluna capilar HP-88 (60 m × 0,25 mm Agilent Technologies), seguindo nossos procedimentos descritos anteriormente (Liu et al., 2016).


Procedimentos experimentais

Material vegetal e condições de crescimento

Plantas mutantes e transgênicas de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) estavam no fundo de tipo selvagem Col-0. Sementes de Arabidopsis foram semeadas em composto, estratificadas por 3 dias a 4 ° C e cultivadas a 20 ° C, sob CO ambiente2 (ca. 400 μmol / mol), a 70% de umidade relativa e abaixo de 100 μmol fótons / m 2 / s em ciclos de 12 h de luz / 12 h de escuridão, salvo indicação em contrário.

Para análises de linhagens transgênicas, a inserção homozigótica ou linhas segregantes de tipo selvagem (T3) foram comparadas. Onde segregantes de tipo selvagem não estavam disponíveis, as linhas de inserção homozigóticas foram comparadas com plantas Col-0 de estoques de sementes da mesma idade geradas em condições semelhantes. Plantas de tabaco (Nicotiana Benthamiana L.) foram cultivadas sob condições de estufa (mínimo 20 ° C, luz natural suplementada para fornecer pelo menos 12 horas de luz). As proteínas marcadas com Vênus foram expressas na cepa cMJ030 de Chlamydomonas de tipo selvagem (CC-4533) (Zhang et al., 2014). As células foram mantidas em baixa luz constante (

10 μmol fótons / m 2 / s) em RT em 1,5% (w / v) placas de ágar contendo Tris-acetato-fosfato (TAP) (Kropat et al., 2011). Para a imagem, as células foram cultivadas em meio líquido TAP a uma concentração de 10 6 células / mL, sedimentadas por centrifugação (1000 g, 4 min), ressuspenso em meio mínimo Tris-fosfato (T-P) (Kropat et al., 2011) e cultivado por 24 h em CO ambiente2 antes da imagem.

Clonagem e expressão de componentes CCM em Chlamydomonas

As estruturas de leitura aberta (ORFs) dos genes de Chlamydomonas foram expressas em estrutura com Vênus do PsaD promotor usando o vetor pLM005. ORFs foram amplificados a partir de DNA genômico usando polimerase Phusion Hotstart II (Thermo Fisher Scientific, www.thermofisher.com) com os respectivos oligos na Tabela S1. O vetor pLM005 cortado com HpaI e os produtos de PCR foram purificados em gel e montados por montagem Gibson (Gibson et al., 2009). Devido ao grande comprimento do gene de HLA3, foi clonado em dois fragmentos e depois montado no vetor pLM005 por montagem Gibson. O vetor pLM005 contém o gene AphVIII para resistência à paromomicina em Chlamydomonas e resistência à ampicilina para seleção bacteriana. Todas as junções de construção foram verificadas por sequenciamento de Sanger. Construtos foram transformados em Chlamydomonas por eletroporação como em Zhang et al. (2014). Resumidamente, 250 μL de 2 × 10 8 células / mL foram transformados com 14,5 ng / kbp de plasmídeo cortado com EcoRV a 16 ° C. As células foram espalhadas em placas de ágar TAP de 86 mL contendo paromomicina (20 μg / mL) e mantidas em baixa luminosidade (

10 μmol fótons / m 2 / s) até que as colônias fossem

2–3 mm de diâmetro. As placas foram selecionadas para colônias fluorescentes usando um scanner de fluorescência Typhoon TRIO (GE Healthcare, www.gelifesciences.com) com comprimentos de onda de excitação / emissão 532 nm / 520–555 nm para Vênus e 633 nm / 630–670 nm para autofluorescência de clorofila.

Clonagem e expressão de componentes CCM em tabaco e Arabidopsis

Os genes foram clonados a partir de cDNA derivado de Chlamydomonas (cepa CC-4886, Chlamydomonas Resource Center). Os iniciadores foram projetados a partir de sequências disponíveis no Phytozome v10.2 (Chlamydomonas reinhardtii v5.5 [Augustus u11.6], http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii) (consulte a Tabela S1 para detalhes do oligo). Sequências de genes para LCIA e HLA3 foram otimizados por códons para expressão em plantas superiores e sintetizados de novo (DNA2.0, CA, EUA) (Figura S7), em seguida clonado em vetores de entrada do Gateway (kit pCR ® 8 / GW / TOPO ® TA Cloning ®) usando Platinum ® Taq DNA Polymerase High Fidelity de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen ™ Life Technologies, www.lifetechnologies.com) e posteriormente clonado nos vetores binários de destino pK7FWG2,0 (Karimi et al., 2002) ou pGWB5 (Nakagawa et al., 2009). A montagem de Gibson foi usada para gerar fusões gênicas de peptídeos de trânsito. Os vetores binários foram transformados em Agrobacterium tumefaciens (AGL1) para a expressão gênica transitória em folhas de tabaco (Schöb et al., 1997) ou inserção estável em plantas de Arabidopsis por imersão floral (Clough e Bent, 1998). Estudos de co-expressão foram realizados com o vetor WAVE131 do conjunto de marcadores de 'onda' (Geldner et al., 2009) e o vetor mt-rb (Nelson et al., 2007) para a localização da membrana plasmática e mitocôndria, respectivamente.

Extração de DNA, PCR e análise de proteínas

Para a triagem de linhas transgênicas de Arabidopsis, o DNA genômico foi extraído de rosetas maduras não florescentes de plantas T1, conforme descrito em Li e Chory (Li e Chory, 1998). Os PCRs foram realizados como em McCormick e Kruger (2015). Sempre que possível, a localização das inserções de genes foi confirmada por TAIL PCR, conforme descrito por Liu et al. (1995). As linhas de inserção homozigóticas foram identificadas na geração T2 por PCR ou por razões de segregação de plântulas em placas de meio Murashige e Skoog (MS) contendo canamicina (0,5x).

Os níveis relativos das proteínas LCIA: GFP e HLA3: GFP nas folhas foram confirmados por immunoblot. Aproximadamente 10 μg de proteína de rosetas inteiras de 28 d de idade (100 mg de peso fresco) foram fracionados por SDS-PAGE em um gel de acrilamida: bisacrilamida (40: 1) de 10% (p / v) (40: 1) transferido para membrana de PVDF, sondado com camundongo IgG anti-GFP2a na diluição de 1: 1.000 (Santa Cruz, http://www.scbt.com/) e visualizado usando um IgG de cabra anti-camundongo conjugado com HRP2a na diluição de 1:50 000. A atividade HRP foi detectada usando Supersignal Ultra (Pierce, www.piercenet.com) de acordo com as instruções do fabricante.

Expressão de oócitos e ensaios de captação de bicarbonato

Sequências de genes sintetizados para maturo LCIA (mLCIA) ou HLA3 sem um códon de parada foram clonados no vetor de expressão Vivid Colors ™ pcDNA ™ 6.2 / EmGFP (Invitrogen ™ Life Technologies) para gerar fusões mLCIA- ou HLA3-GFP. Para LCIA, o peptídeo de sequência de trânsito N-terminal (73 aa) foi removido e substituído pela sequência ‘GACATG’ para adicionar uma sequência Kozak e um novo códon de início. Para HLA3, 'GAC' foi adicionado imediatamente a montante do códon de início. Para gerar vetores equivalentes sem uma etiqueta fluorescente, a montagem Gibson foi usada para adicionar um códon de parada a mLCIA ou HLA3 e remover a sequência GFP (720 bp). Os plasmídeos foram linearizados por AvrII ou StuI (Roche, www.roche.co.uk) e o mRNA capeado foi sintetizado usando o kit de transcrição mMESSAGE mMACHINE ® T7 (Ambion ® Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. O mRNA de LCIA ou HLA3 maduro foi expresso em oócitos, conforme descrito por Feng et al. (2013). Oócitos de Xenopus foram injetados com 50 nL de mRNA (1 μg / μL) ou água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) como controle. Os ensaios de captação de bicarbonato e imagem confocal foram realizados 3 dias após a injeção em um protocolo adaptado de Mariscal et al. (2006). Os oócitos foram incubados em meio MBS fresco (88 m m NaCl, 1 m m KCl, 2,4 m m NaHCO3, 0,71 m m CaCl2, 0,82 m m MgSO4 e 15 m m m HEPES, pH 7,4), contendo 0,12 m m NaHCO3 (1,85 GBq / mol NaH 14CO3) Após 10 min, os oócitos foram lavados três vezes com MBS gelado e lisados ​​em 200 μL de SDS (10% [p / v]), e a radioatividade retida em oócitos individuais foi medida.

Quantificação de clorofila

A clorofila foi extraída dos discos de folhas em pó em 80% (v / v) de acetona gelada e Tris-HCl 10 m m, e a concentração foi medida de acordo com Porra et al. ( 1989 ).

Medição de parâmetros fotossintéticos

As taxas de troca gasosa foram determinadas usando um analisador de gás infravermelho portátil LI-6400 (LI-COR Biosciences, http://www.licor.com/) na sexta ou sétima folha de 35 a 45 d de idade madura, sem floração rosetas cultivadas em vasos grandes para gerar área foliar suficiente para medições de troca gasosa (Flexas et al., 2007). A resposta do CO fotossintético líquido2 assimilaçãoUMA) para CO subestomático2 concentração (Ceu) foi medido variando o CO externo2 concentração de 0 a 1000 μmol / mol sob uma radiação fotossintética ativa constante de 1500 μmol fótons / m 2 / s (fornecida por uma fonte de luz vermelho-azul ligada à câmara foliar). Os dados de troca de gás foram corrigidos para CO2 difusão como em Bellasio et al. (2015). A temperatura foliar e a umidade relativa da câmara foram mantidas em 21 ° C e 70%, respectivamente. Para calcular a taxa de carboxilação máxima (Vc, max), fluxo máximo de transporte de elétrons (Jmax) e condutância do mesofilo (gm), os dados A / Ci foram ajustados ao C3 modelo de fotossíntese (Farquhar et al., 1980) com modificações para incluir estimativas para gm conforme descrito por Ethier e Livingston (2004).

Microscopia confocal de varredura a laser

Um microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems) com uma lente objetiva de imersão em água (HCX IRAPO 25,0x0,95) foi usado para imagens de folhas e oócitos. Os comprimentos de onda de excitação / emissão foram 488 nm / 500–530 nm para GFP, 543 nm / 590–620 nm para mCherry e 488 nm / 680–750 nm para autofluorescência de clorofila. As imagens foram adquiridas usando o software Leica LAS AF (http://www.leica-microsystems.com/). Antes de obter imagens de proteínas marcadas com Vênus em Chlamydomonas, 15 μL de células foram adicionados a um poço de uma placa óptica de 96 poços (Brooks Life Science Systems, http://www.brooks.com) e cobertos com 150 μL de 1,5% agarose de baixo ponto de fusão contendo TP (

35 ° C). Para a coloração de mitocôndrias, CCP1: Vênus- e CCP2: As linhas que expressam Vênus foram cultivadas em meio líquido T-P com paromomicina (2 μg / mL) a uma concentração de 2–4 × 10 6 células / mL. As culturas foram incubadas com MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher Scientific) até uma concentração final de 1 μm por 10 min e, em seguida, manchadas em uma lâmina revestida de polilisina para geração de imagens. As células foram fotografadas usando um microscópio confocal adaptado personalizado (Leica DMI6000) com configurações em 514 nm / 532-555 nm para Vênus, 561 nm / 573-637 nm para coloração por Mitotracker Red CMXRos e 561 nm / 665-705 nm para autofluorescência de clorofila . As imagens foram analisadas usando o software Fiji (http://fiji.sc/Fiji).

Análise estatística

As variações na resposta entre os genótipos foram avaliadas por análise de variância (ANOVA) ou de Student t-testes seguidos pelo teste post hoc de diferença significativa honesta (HSD) de Tukey (SPSS Statistics 18, http://www.ibm.com/). Diferenças para as quais P & lt 0,05 são considerados significativos.


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Conclusões

Here, we identified 92 COMT genes from blueberry and 425 COMT genes from 15 other species. According to phylogenetic analysis of COMTs, we divided the COMTs into two groups, which indicated the existence of two ancestor genes. DSD and WGD were revealed to be the major forces of blueberry evolution. The Ka/Ks ratios of the gene duplication patterns for the COMTs from the four plant species were less than 1, indicating that the COMTs have experienced strong purifying selection. According to the qRT-PCR results for 22 VcCOMTs, VcCOMT40, VcCOMT92 were highly expressed and may play important roles in the synthesis of lignin of blueberry fruit. The results of this study will build foundations for breeding blueberry cultivars with higher fruit firmness and longer shelf life.


We acknowledge funding of this research project by the Research Council of Norway (RCN) and the University of Hamburg (Hamburg, Germany). We are grateful to Prof. C. Benning (Michigan State University, East Lansing, United States) for providing the expression vector pNoc ox Venus. We also would like to thank Elke Wölken (Department of Aquatic Ecophysiology and Phycology, University of Hamburg) for analyses of immunogold-labeled N. oceanica transformants by transmission electron microscopy.

aa, amino acid ALNS, allantoin synthase ASW, artificial sea water At, Arabidopsis thaliana CaMV, cauliflower mosaic virus DC, decarboxylase DECR, 2,4-dienoyl-CoA reductase DHNS, 1,4-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA synthase dpt, days post transformation EMB8, embryogenesis-associated protein 8 EPA, eicosapentaenoic acid EYFP/GFP, enhanced yellow/green fluorescent protein HIT, histidine triad family protein HIUase, 5-hydroxyisourate hydrolase IndA, indigoidine synthase A MDH, malate dehydrogenase MLS, malate synthase Ng, Nannochloropsis gaditana OHCU, 2-oxo-4-hydroxy-4-carboxy-5-ureidoimidazoline PEX, peroxin PfkB, 6-phosphofructokinase PGL3, 6-phosphogluconolactonase 3 PKT, peroxisomal 3-ketoacyl thiolase PTS1/2, peroxisomal targeting signal type 1/2 PUFA, polyunsaturated fatty acid PUKI, pseudouridine kinase PUMY, pseudouridine monophosphate glycosylase TEM, transmission electron microscopy.


Resultados

Proteome profile changes in P. patens under ABA treatment

Changes in the proteome profile between control and ABA treated plants suggested that exogenous ABA could trigger one or more responses in P. patens. In order to ensure statistically results, the experiments were carried out in triplicate. After CBB R-250 staining, more than 1,300 protein spots could be detected for each sample. Representative gels from control and ABA-treated plants and proteins showing altered abundance are presented in Figure ​ Figure1. 1 Two-dimensional images were analyzed using ImageMaster™ 2D Platinum software. The volume percentage of each spot was estimated and compared across the gels. In the samples following ABA treatment, we repeatedly analyzed 89 protein spots, whose relative abundance was at least 1.5-fold different from the control. The proteins associated with 65 of these protein spots were subsequently identified using LC-MS/MS. Among them, 13 protein spots (D1-D13) were down-regulated, 52 protein spots (U1-U52) were up-regulated by ABA treatment including four protein spots (U22, U24, U40, U43) which were only present in the ABA-treated samples (Figure ​ (Figure1). 1 ). Quantitative analysis indicated that the abundance of these proteins changed [see Additional File 1: Supplemental Table S1] in response to ABA treatment (Figure ​ (Figure2) 2 ) suggesting that different physiological and biochemical processes are modified following ABA treatment.


Assista o vídeo: Algas pardas. Feofíceas (Julho 2022).


Comentários:

  1. Tauktilar

    O que em particular você gostaria de dizer?

  2. Obadiah

    A situação absurda acabou

  3. Olamide

    Inequivocamente, a resposta rápida :)

  4. Ziyan

    Na minha opinião, isso é óbvio. Você já tentou pesquisar google.com?

  5. Byrtel

    Desculpa, que não posso participar agora da discussão - não há tempo livre. Mas vou voltar - vou necessariamente escrever que penso nessa pergunta.



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