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Como exatamente os nucléolos são feitos de NORs?

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Eu li que os nucléolos são feitos de DNA, RNA e regiões organizadoras do nucléolo. Não entendo muito bem como isso acontece com os NORs. Não existe um envelope delimitando o nucléolo do resto do conteúdo do núcleo? As NORs de diferentes cromossomos se unem? Quer dizer, eles não estão se separando do resto do cromossomo e se agregando livremente ...


Não, não há membrana que separa o nucléolo do resto do núcleo. O nucléolo é um agregado de todos os tipos de moléculas envolvidas na montagem do ribossomo, como: rRNA precursor e maduro, RNAs nucleolares pequenos, enzimas de processamento de rRNA, proteínas ribossômicas e ribossomos parcialmente montados (mas sem ribossomos totalmente funcionais)

Além de todas essas proteínas e RNA, existem de fato regiões do cromossomo chamadas regiões organizadoras do nucléolo (RONs) presentes no nucléolo. Essas NORs estão localizadas perto das pontas do curto p região do cromossomo 13, 14, 15, 21 e 22. Durante a interfase, essas regiões se descondensam devido a proteínas como a nucleolina e, portanto, estão abertas para transcrição. Muitas das proteínas que mencionei são necessárias para se formar ou se apresentar na agregação que é o nucléolo.


Como exatamente os nucléolos são feitos de NORs? - Biologia

O nucléolo é uma estrutura subnuclear proeminente que não é ligada por uma membrana e reside dentro da matriz nuclear. Embora se saiba que existe desde o século XVIII, a função primária do nucléolo não foi descoberta até a década de 1960. Agora foi determinado que os nucléolos fabricam as subunidades que se combinam para formar os ribossomos, as fábricas produtoras de proteínas da célula. Consequentemente, o tamanho dos nucléolos depende dos requisitos ribossomais do tipo de célula em que são encontrados. Em células que produzem grandes quantidades de proteínas e, portanto, exigem um número significativo de ribossomos, o tamanho do nucléolo é considerável, às vezes ocupando até 25% do volume total do núcleo.

Através do microscópio, o nucléolo aparece como uma grande mancha escura dentro do núcleo (veja a Figura 2). As células eucarióticas geralmente contêm um único nucléolo, mas vários também são possíveis. O número exato de nucléolos é fixado entre membros da mesma espécie. Cada célula diplóide do corpo humano apresenta apenas um nucléolo, embora, imediatamente após a divisão celular, dez nucléolos minúsculos apareçam antes de se aglutinarem em um único nucléolo grande. Isso ocorre porque os nucléolos são formados em certos locais dos cromossomos geralmente chamados de regiões organizadoras do nucléolo (NORs), e duas cópias de cinco cromossomos humanos diferentes contêm NORs. O DNA encontrado nas NORs cromossômicas codifica os genes do RNA ribossômico (rRNA). No início da mitose, o único nucléolo presente em uma célula humana desaparece e, após o processo, pode-se observar a formação do novo nucléolo, que é criado a partir das dez estruturas semelhantes a nucléolos menores que se desenvolvem a partir das RONs.

O nucléolo é composto por componentes granulares e fibrilares, além de uma matriz mal definida, além de DNA. O material granular consiste em subunidades ribossômicas que já foram formadas, mas ainda não amadureceram e estão esperando para serem exportadas para o citoplasma. A parte fibrilar filiforme de um nucléolo é predominantemente composta de moléculas de rRNA e proteínas associadas que se juntaram para formar fibrilas. Ainda não foi determinado exatamente como os vários componentes do nucléolo são mantidos juntos e organizados.

Ilustrado na Figura 2 está uma imagem digital de fluorescência de uma célula de fibroblasto de embrião de camundongo suíço corada com sondas fluorescentes direcionadas ao núcleo (azul), rede de mitocôndrias (vermelho), complexo de Golgi (verde) e nucléolos (magenta) para demonstrar a proximidade dessas estruturas . Os nucléolos dessa célula foram direcionados com um anticorpo para fibrilarina, uma pequena ribonucleoproteína nuclear (SnRNP) envolvida no processamento do RNA ribossômico e centralizada dentro da suborganela. A fibrilarina tem uma sequência de aminoácidos bem conservada que permite que a proteína sirva como um excelente marcador para nucléolos em uma ampla variedade de espécies.

Nos últimos anos, os cientistas têm investigado diligentemente uma possível conexão entre o nucléolo e a senescência celular (envelhecimento). A maioria das evidências para tal ligação até agora veio de estudos com células de levedura, alguns dos quais sugerem que o dano cumulativo aos genes do RNA ribossômico e a fragmentação do nucléolo podem ser centrais para o processo de envelhecimento. O suporte para a teoria também veio da pesquisa genética focada na síndrome de Werner, uma doença hereditária caracterizada pelo envelhecimento prematuro, mas estudos adicionais são necessários para compreender mais precisamente qualquer possível papel que o nucléolo desempenha na senescência.


Conteúdo

O nucléolo foi identificado por microscopia de campo claro durante a década de 1830. [6] Pouco se sabia sobre a função do nucléolo até 1964, quando um estudo [7] do nucléolo por John Gurdon e Donald Brown na rã africana com garras Xenopus laevis gerou um interesse crescente na função e estrutura detalhada do nucléolo. Eles descobriram que 25% dos ovos de rã não tinham nucléolo e que esses ovos não eram capazes de viver. Metade dos ovos tinha um nucléolo e 25% tinha dois. Eles concluíram que o nucléolo tinha uma função necessária para a vida. Em 1966, Max L. Birnstiel e colaboradores mostraram por meio de experimentos de hibridização de ácido nucléico que o DNA dentro dos nucléolos codifica para o RNA ribossômico. [8] [9]

Três componentes principais do nucléolo são reconhecidos: o centro fibrilar (FC), o componente fibrilar denso (DFC) e o componente granular (GC). [1] A transcrição do rDNA ocorre no FC. [10] O DFC contém a proteína fibrilarina, [10] que é importante no processamento de rRNA. O GC contém a proteína nucleofosmina, [10] (B23 na imagem externa) que também está envolvida na biogênese do ribossomo.

No entanto, foi proposto que esta organização particular só é observada em eucariotos superiores e que evoluiu de uma organização bipartida com a transição de anamniotas para amniotas. Refletindo o aumento substancial na região intergênica do DNA, um componente fibrilar original teria se separado em FC e DFC. [11]

Outra estrutura identificada em muitos nucléolos (particularmente em plantas) é uma área clara no centro da estrutura conhecida como vacúolo nucleolar. [12] Foi demonstrado que os nucléolos de várias espécies de plantas têm concentrações muito altas de ferro [13] em contraste com os nucléolos de células humanas e animais.

A ultraestrutura do nucléolo pode ser vista através de um microscópio eletrônico, enquanto a organização e dinâmica podem ser estudadas através da marcação de proteínas fluorescentes e recuperação fluorescente após fotodegradação (FRAP). Os anticorpos contra a proteína PAF49 também podem ser usados ​​como um marcador para o nucléolo em experimentos de imunofluorescência. [14]

Embora geralmente apenas um ou dois nucléolos possam ser vistos, uma célula diplóide humana tem dez regiões organizadoras de nucléolos (NORs) e pode ter mais nucléolos. Na maioria das vezes, várias NORs participam de cada nucléolo. [15]

Na biogênese do ribossomo, duas das três RNA polimerases eucarióticas (pol I e ​​III) são necessárias e funcionam de maneira coordenada. Em um estágio inicial, os genes de rRNA são transcritos como uma única unidade dentro do nucléolo pela RNA polimerase I. Para que essa transcrição ocorra, vários fatores associados à pol I e ​​fatores de ação trans específicos do DNA são necessários. Na levedura, os mais importantes são: UAF (fator de ativação a montante), TBP (proteína de ligação TATA-box) e fator de ligação ao núcleo (CBF)) que se ligam a elementos promotores e formam o complexo de pré-iniciação (PIC), que por sua vez é reconhecido por RNA pol. Em humanos, um PIC semelhante é montado com SL1, o fator de seletividade do promotor (composto de TBP e fatores associados a TBP, ou TAFs), fatores de iniciação da transcrição e UBF (fator de ligação a montante). A RNA polimerase I transcreve a maioria dos transcritos de rRNA 28S, 18S e 5.8S), mas a subunidade 5S rRNA (componente da subunidade ribossômica 60S) é transcrita pela RNA polimerase III. [16]

A transcrição do rRNA produz uma longa molécula precursora (45S pré-rRNA) que ainda contém o ITS e o ETS. É necessário processamento adicional para gerar as moléculas de RNA 18S, 5.8S e 28S. Em eucariotos, as enzimas modificadoras de RNA são levadas aos seus respectivos locais de reconhecimento por interação com RNAs guia, que se ligam a essas sequências específicas. Esses RNAs guia pertencem à classe de pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) que são complexados com proteínas e existem como ribonucleoproteínas nucleolares pequenas (snoRNPs). Uma vez que as subunidades de rRNA são processadas, elas estão prontas para serem montadas em subunidades ribossômicas maiores. No entanto, uma molécula de rRNA adicional, o rRNA 5S, também é necessária. Na levedura, a sequência 5S rDNA está localizada no espaçador intergênico e é transcrita no nucléolo por RNA pol.

Em eucariotos superiores e plantas, a situação é mais complexa, pois a sequência de DNA 5S está fora da Região Organizadora do Nucleolo (NOR) e é transcrita pelo RNA pol III no nucleoplasma, após o qual encontra seu caminho para o nucléolo para participar da montagem do ribossomo. Essa montagem não envolve apenas o rRNA, mas também as proteínas ribossomais. Os genes que codificam essas proteínas r são transcritos pela pol II no nucleoplasma por uma via "convencional" de síntese de proteínas (transcrição, processamento de pré-mRNA, exportação nuclear de mRNA maduro e tradução em ribossomos citoplasmáticos). As proteínas r maduras são então importadas para o núcleo e, finalmente, para o nucléolo. A associação e a maturação das proteínas rRNA e r resultam na formação das subunidades 40S (pequena) e 60S (grande) do ribossomo completo. Estes são exportados através dos complexos de poros nucleares para o citoplasma, onde permanecem livres ou se associam ao retículo endoplasmático, formando um retículo endoplasmático rugoso (RER). [17] [18]

Nas células endometriais humanas, às vezes se forma uma rede de canais nucleolares. A origem e função desta rede ainda não foram claramente identificadas. [19]

Além de seu papel na biogênese ribossômica, o nucléolo é conhecido por capturar e imobilizar proteínas, um processo conhecido como detenção nucleolar. As proteínas que são retidas no nucléolo são incapazes de se difundir e interagir com seus parceiros de ligação. Os alvos deste mecanismo regulatório pós-tradução incluem VHL, PML, MDM2, POLD1, RelA, HAND1 e hTERT, entre muitos outros. Sabe-se agora que longos RNAs não codificadores originados de regiões intergênicas do nucléolo são responsáveis ​​por esse fenômeno. [20]


Estrutura do Nucléolo

É a maior organela presente dentro dos limites do núcleo. A complexa organização estrutural do nucléolo evoluiu durante a fase de transição dos seres vivos de anamniotas para amniotas. Os anamniotas são vertebrados que não possuem o âmnio. Outra característica notável desses organismos é que botam ovos na água. Os amniotas são organismos (répteis, pássaros, etc.) que põem ovos e que se adaptaram ao ambiente terrestre.

Fato rápido!

Amnion é uma membrana protetora que envolve o embrião em mamíferos, pássaros e répteis. É composto por um líquido seroso denominado líquido amniótico. Além de proteger o embrião, o fluido é conhecido por fornecer a nutrição necessária.

Nesse processo de adaptação ao ambiente terrestre, a região intergênica do rDNA teve um aumento considerável. A separação do componente fibrilar original ocorreu nesta fase, como resultado, os FC (centros fibrilares) e DFC (componentes fibrilares densos) foram formados.

A estrutura e o funcionamento do nucléolo são mais complexos do que os pesquisadores até hoje entendem. Esforços estão sendo feitos para entender o funcionamento dessa organela celular em um nível molecular. Por fim, pode-se dizer que um estudo aprofundado deve nos ajudar a entender mais sobre as macromoléculas que desempenham as diferentes funções das células.

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Resultados

Os núcleos das células HeLa continham geralmente 2-5 nucléolos, com número médio 4,03 & # x000b10.12 (Kalm & # x000e1rov & # x000e1 et al. 2007). O número de nucléolos foi mais frequentemente diferente nas células-filhas (Fig. 1). Especificamente, em 77% dos casos, as células filhas continham números diferentes de nucléolos. Além disso, comparamos nossos dados com um modelo aleatório. Neste modelo, a aparência dos pares de células-filhas com eu e j nucléolos foi calculado como produto das frequências experimentalmente encontradas das células com eu e j nucléolos. Comparando a incidência de nucléolos em 100 pares de células-filhas, encontramos uma correspondência próxima com o modelo aleatório (fig. 1).

O número de nucléolos nas células-filhas diferia com mais frequência em um (barras cinza). Apenas em 23% dos pares de células, o número de nucléolos era idêntico. As diferenças observadas no número de nucléolos entre as células-filhas corresponderam intimamente àquelas no modelo aleatório (barras pretas).

Em seguida, visualizamos os cromossomos 14 e 15, realizando a hibridização com as sondas marcadas com Cy3 e FITC, em combinação com a imunomarcação de nucléolos usando anticorpo contra fibrilarina. As células HeLa normalmente possuem quatro homólogos do cromossomo 15 e três homólogos do cromossomo 14. Diferentes números desses cromossomos podem ser associados a cada nucléolo (Kalm & # x000e1rov & # x000e1 et al. 2007). Consequentemente, diferentes células podem ter diferentes combinações da associação nucleolar. No caso do cromossomo 15, todos os quatro homólogos são associados a nucléolos (Kalm & # x000e1rov & # x000e1 et al. 2007, Smirnov et al. 2006). Por exemplo, cinco combinações são possíveis em células com quatro nucléolos (Fig. 2). Em uma situação extrema, todos os quatro cromossomos estão associados a um nucléolo. Na outra situação extrema, há um cromossomo associado a cada um dos nucléolos (Fig. 3, A-C). No caso do cromossomo 14, nem todos os homólogos estão associados com nucléolos (Fig. 3, D-F) (Kalm & # x000e1rov & # x000e1 et al. 2007, Smirnov et al. 2006), o que aumenta o número de combinações possíveis para sete (Fig. 2).

Esquema que descreve as relações entre os nucléolos (vermelho) e os cromossomos 14 e 15 (verde) no núcleo da célula (azul): todas as combinações possíveis das associações nucleolares para o caso de células com quatro nucléolos são mostradas. Todos os cromossomos 15 estão associados aos nucléolos, mas alguns cromossomos 14 não estão associados aos nucléolos.

Combinações de posições dos cromossomos 14 e 15 em relação aos nucléolos em comparação com as células-filhas HeLa. Sinal FISH com as sondas específicas para os cromossomos 14 e 15 (B, E verde em C, F) em um par de células-filhas em interfase. A imunocitoquímica com fibrilarina foi usada para visualizar nucléolos (A, D vermelho em C, F). No exemplo escolhido do cromossomo 15 (A, B, C), todos os quatro homólogos estão associados aos nucléolos, penetrando profundamente neles, o que é típico do cromossomo 15 (Kalm & # x000e1rov & # x000e1 et al. 2007). Este caso corresponde à combinação (1, 1, 1, 1) na Fig. 2. No exemplo escolhido do cromossomo 14 (D, E, F), dois cromossomos homólogos são nucléolos associados (setas em F), e um é separado dos nucléolos. Este caso corresponde à combinação (1, 1) na Fig. 2. Barra: 10 e # x003bcm.

Comparando essas combinações nas células-filhas, descobrimos surpreendentemente que em 50% dos pares de células, tanto para o cromossomo 14 quanto para o cromossomo 15, as combinações eram idênticas (Tabela 1). Para avaliar esses dados, usamos um modelo de emparelhamento aleatório no qual o aparecimento dos pares de células-filhas com combinações eu e j foi calculado como produto das frequências encontradas experimentalmente das células com as combinações eu e j. Os pares com combinações idênticas apareceram com frequência significativamente maior no experimento (50%) do que no modelo aleatório (32% para o cromossomo 15 e 25% para o cromossomo 14) (Tabela 1).

Tabela 1

Similaridade da posição dos cromossomos portadores de NOR com relação aos nucléolos nas células filhas. Em 50% dos pares de células, as combinações são idênticas tanto para o cromossomo 14 quanto para o cromossomo 15, o que excede significativamente os valores previstos pelo modelo aleatório

Além disso, no caso do cromossomo 14 observamos uma simetria significativa na distribuição dos cromossomos não associados após a mitose: em 62% dos casos as células-filhas apresentavam igual número desses cromossomos, enquanto o modelo aleatório previa apenas 44%.


DISCUSSÃO

A questão da localização precisa da interfase NOR e, em particular, da expressão de rDNA dentro dos componentes nucleolares tem sido uma questão de debate. Dos quatro componentes do nucléolo (DFC, FC, GC e cromatina), o GC (que contém as partículas pré-ribossomais e nenhum DNA) é o último a se formar em um nucléolo recém-formado, enquanto a cromatina NOR (que contém o genes ribossomais) é o primeiro e também a base do nucléolo. Portanto, a transcrição ocorre dentro de um dos dois componentes nucleolares restantes, DFC e FC, onde ocorre o rDNA. Além disso, o DFC e o FC são os componentes nucleolares corados com prata de forma semelhante às NORs nos cromossomos metafásicos. No entanto, os esforços para localizar os genes de transcrição ribossomal dentro desses dois componentes nucleolares deram origem a resultados contraditórios, alguns dados sugerindo a presença de genes ribossômicos no DFC (Wachtler et al., 1989 Stahl et al., 1991 Jimenez-Garcia et al. , 1993 Hozak, 1995), outros no FC (Derenzini et al., 1982, 1985 Thiry e Thiry-Blaise, 1991) e alguns em ambos os compartimentos (Puvion-Dutilleul et al., 1991 Thiry e Goessens, 1996).

Nossa nova abordagem, que faz uso de uma combinação de várias técnicas ultraestruturais complementares de alta resolução (citoquímica, imunocitoquímica, EFTEM e ESI), permitiu pela primeira vez a visualização e a localização de DNA contendo genes ribossomais em sua forma mais finamente dispersa dentro de um componentes nucleolares. Assim, demonstramos, em primeiro lugar, que o DNA corado especificamente, a imunomarcação para a proteína marcadora DFC fibrilarina e para a RNA polimerase I e o sinal de fósforo obtido por ESI se sobrepõem na mesma área nucleolar. Isso demonstra a presença de DNA dentro do DFC de nucléolos de células P815 de camundongo. Em segundo lugar, o DNA corado geralmente ocorre como nuvens, com um núcleo interno de fibras de DNA obviamente correspondendo ao FC. Isso se desemaranha em sua periferia em fibrilas extremamente finas que se sobrepõem à imunomarcação para fibrilarina (DFC). O complexo FC + DFC, portanto, representa a contraparte de interfase descondensada do NOR.

O DFC contém DNA finamente disperso

Nossa abordagem combinada, baseada na possibilidade de obter diferentes tipos de informação exatamente na mesma área nucleolar, nos permitiu demonstrar de forma inequívoca a presença de fibrilas de DNA finamente dispersas dentro do DFC. A imunomarcação antifibrilarina permite uma localização precisa do DFC, superando os problemas técnicos ligados à etapa de hidrólise da reação do tipo Feulgen, que, ao remover RNA e proteínas, dificulta o reconhecimento dos diferentes componentes nucleolares. Além disso, a observação a 0 eV aumenta o contraste do DNA corado com ósmio-amina, a observação a 250 eV ajuda a visualizar a estrutura fibrilar do DNA e o mapa de fósforo, sobrepondo-se aos dados obtidos na perda de energia de 0 eV, confirma a presença de fibrilas de DNA finamente dispersas no DFC. O sinal de fósforo vem do DNA porque demonstramos que o RNA, a outra fonte importante de sinal de fósforo, é degradado pela hidrólise ácida e perdido. As proteínas, outra possível fonte de sinal de fósforo, são principalmente removidas durante o tratamento com HCl, como atesta a perda evidente de densidade eletrônica dos componentes nucleolares. Além disso, temos evidências diretas de que, quando a hidrólise é realizada em fase de vapor (ou seja, as grades não estão em contato com a solução aquosa de HCl), as proteínas são retidas no nucléolo e os diferentes componentes nucleolares mantêm seu contraste inerente (Biggiogera e Fakan, não publicado )

Nuvens de DNA correspondem ao complexo FC + DFC

Descobrimos que o DNA corado com amina ósmio dentro do nucléolo ocorre como nuvens arredondadas feitas de fibrilas mais finas do que aquelas presentes nos aglomerados de cromatina condensada. Áreas semelhantes de DNA descondensado foram relatadas anteriormente (Derenzini et al., 1982 Derenzini et al., 1987 Derenzini et al., 1993) e interpretadas como DNA altamente disperso dentro do FC, enquanto o DFC foi considerado desprovido de DNA. No entanto, nossa abordagem combinada e altamente sensível mostra que o DNA corado com ósmio-amina descrito por esses autores representou apenas a parte interna mais contrastada da nuvem de DNA revelada no presente trabalho, a parte periférica, localizada no DFC, não era visível ou dificilmente detectável por meio de microscopia eletrônica convencional. Portanto, a nuvem de DNA é formada pelo complexo FC + DFC, que representa a contraparte de interfase descondensada da NOR.

NOR e sites de transcrição

A via de descondensação do DNA da NOR que leva à transcrição de genes passa por três etapas de desenrolamento, representadas pela cromatina intranucleolar, FC e DFC, respectivamente (Fig. 4). De fato, nossos resultados demonstram que a distribuição do DNA dentro das nuvens não é homogênea, sendo o DNA presente no DFC em filamentos mais finos do que os presentes no FC. Isso sugere um grau de desenrolamento, correspondendo a genes ativos. Esta ideia é apoiada pelos seguintes dados. A fibrilarina, um componente do complexo nucleolar U3 snRNP, está envolvida em várias etapas da via de pré-processamento de rRNA e, em particular, em seus eventos iniciais (Kass et al., 1990) ocorre no DFC de forma semelhante à nucleolina e à proteína B23 ( Biggiogera et al., 1989), UBF (Cmarko et al., 2000), e as proteínas ribossomais P1P2 e L7 (Biggiogera et al., 1990), que se associam bastante cedo com o transcrito nascente (Chooi e Leiby, 1981 Ginisty et al., 1998). A presença de RNA polimerase I também foi relatada no DFC (Raska et al., 1995 Cmarko et al., 2000 este estudo). O DFC também é o local de ocorrência de RNA rapidamente marcado após a incorporação de 3H-uridina (Granboulan e Granboulan, 1965 Fakan e Puvion, 1980 Fakan, 1986 Hozak, 1995), bem como após a incorporação de BrUTP (Cmarko et al., 1999 Cmarko et al., 2000), e genes de transcrição foram detectados neste componente nucleolar por hibridização in situ (Wachtler et al., 1989 Stahl et al., 1991). Além disso, se considerarmos que os transcritos e a maquinaria de transcrição constituem uma montagem de densidade relativamente alta e que o DFC é o componente nucleolar mais denso em elétrons, o DFC obviamente corresponde ao local real de transcrição dos genes ribossomais. Em contraste, o FC é formado por DNA que é mais condensado do que o do DFC, mas menos condensado do que o das massas de cromatina perinucleolar ou intranucleolar. Nossa interpretação é apoiada pela análise dos nucléolos dos neurônios durante o ciclo circadiano (Pébusque e Seïte, 1981), demonstrando variações no tamanho do CF. O alargamento deste compartimento durante o período ativo sugere que o DFC é proporcionalmente muito maior e que a nuvem de DNA é mais dispersa. Isso leva à conclusão de que os genes estão em um arranjo muito mais favorável para sua expressão.

Embora o DFC esteja sempre presente em todas as células, os FCs são dificilmente ou não identificáveis ​​em tipos de células raros. Consequentemente, os FCs são muito pequenos ou o DNA contendo genes ribossomais a serem transcritos é liberado diretamente das áreas de cromatina condensada intranucleolar (sempre associadas ao DFC) sem se desenrolar por meio de uma forma intermediária de condensação de DNA correspondente aos FCs.

Em conclusão, a nuvem de DNA corresponde à interfase descondensada NOR e contém o complexo FC + DFC. Portanto, definimos o FC e o DFC como sendo a expressão morfológica de genes de rDNA inativos e ativos, respectivamente.


Conclusões

A transcrição da RNA polimerase I tem sido freqüentemente apresentada como paradigmática para a transcrição nuclear. No que diz respeito aos constituintes, a transcrição de Pol I e ​​Pol II são bastante diferentes. No entanto, em um nível funcional, podem ser encontradas analogias que podem se basear em princípios gerais de organização biológica. A formação de alças de cromatina é uma marca registrada que atua como pré-requisito da transcrição focal nas fábricas de transcrição e nucléolos. Outra propriedade comum é a alta mobilidade de alguns dos constituintes.

Os princípios organizacionais subjacentes da transcrição focal e da organização nuclear em geral são discutidos de forma controversa e variam da fixação a um suporte subjacente, como matriz nuclear ou nucleoesqueleto, à auto-organização e compartimentação com base em princípios bioquímicos e biofísicos estocásticos. O arsenal metodológico para estudar as forças biofísicas é restrito, e novas abordagens são necessárias para revelar se uma dessas possibilidades ou combinações delas ocorre.


INTRODUÇÃO

O núcleo é uma estrutura complexa dentro da qual várias funções e componentes são espacial e temporalmente organizados e interregulados (revisado por Lamond e Earnshaw, 1998, Dreyfuss e Struhl, 1999). Os nucléolos representam o exemplo mais proeminente dessa organização. A principal função do nucléolo é a biogênese do ribossomo (revisado por Busch e Smetana, 1970). Os rRNAs são sintetizados, processados, clivados e montados com proteínas ribossomais no nucléolo antes de serem exportados para o citoplasma. O nucléolo é composto por três constituintes estruturalmente distinguíveis: centros fibrilares, componentes fibrilares densos e componentes granulares, conforme observado por microscopia eletrônica (revisado por Busch e Smetana, 1970 Hadjiolov, 1985). Embora a relação espacial e temporal entre a síntese de rRNA e os três constituintes estruturais deva ser esclarecida, geralmente pensa-se que a transcrição de rDNA ocorre em uma área transitória entre os centros fibrilares e os componentes fibrilares densos e que o processamento de rRNA e montagem de partículas pré-fibossômicas progresso dos componentes fibrilares densos para os componentes granulares circundantes (revisado por Spector et al., 1993 Shaw e Jordan, 1995 Scheer e Hock, 1999). Evidências mais recentes (revisadas por Pederson, 1998 Garcia e Pillus, 1999) sugerem que os nucléolos têm funções adicionais relacionadas ao ciclo celular (Shouet al., 1999 Visintin et al., 1999), envelhecimento celular (Straight et al., 1999), biossíntese de partícula de reconhecimento de sinal (Jacobson e Pederson, 1998), processamento de RNA pequeno, transporte de mRNA (revisado por Pederson, 1998) e metabolismo de p53 (Zhang e Xiong, 1999).

Os mecanismos essenciais da nucleologenesia durante a reforma nucleolar pós-mitótica ou a geração de novo nucleolar na embriogênese inicial não são claros. Estudos de microscopia eletrônica e imunocitoquímica mostram que pelo menos parte da nucleologenese envolve a fusão entre corpos pré-nucleolares (PNBs) e NORs em células pós-mitóticas (Ochs et al., 1985 Jimenez-Garciaet al., 1994 Fomproix et al., 1998). Essa fusão é evitada por tratamento com uma baixa concentração de actinomicina D (ActD) que inibe a transcrição da polimerase I (Pol I) (Ochs et al., 1985). Os PNBs, corpos esféricos de 0,3–2 μm de diâmetro, são compostos de grânulos e fibrilas de RNP densamente compactados (Stevens, 1965). Os PNBs geralmente contêm fatores envolvidos no processamento pré-rRNA, incluindo fibrilarina, nucleolina, B23, proteínas argirofílicas, Nop52, proteína PMScl-100 e U3, U8 e U14 snoRNP (Ochs e Busch, 1984Ochs et al., 1985 Jimenez-Garcia et al., 1994Fomproix e Hernandez-Verdun, 1999 Savino et al., 1999). Antes da telófase, esses complexos são distribuídos ao redor dos cromossomos e difusamente por todo o citoplasma mitótico (Gautieret al., 1992 Azum-Gelade et al., 1994). Como os outros componentes nucleolares, a maquinaria de transcrição de Pol I, incluindo o complexo de polimerase, e os fatores de transcrição específicos de Pol I, como fator de ligação a montante (UBF) e SL1, se ligam a NORs durante a mitose quando a transcrição de rDNA é inativada (Scheer e Rose, 1984 Roussel et al. 1993 Gebrane-Younes et al., 1997). Curiosamente, durante a mitose, a maquinaria de transcrição associa-se apenas às NORs que foram transcritas durante a interfase anterior e serão transcricionalmente ativas no próximo ciclo celular (Roussel et al., 1996). Conseqüentemente, eles foram nomeados NORs competentes.

Foi proposto que a ativação da transcrição do rDNA recruta os fatores de processamento para os locais de transcrição, facilitando a fusão do PNB (revisado por Scheer e Hock, 1999). Nesse contexto, vários estudos têm tentado abordar a relação entre a transcrição do rDNA e a montagem nucleolar. A transcrição do rDNA parece induzir estruturas semelhantes ao nucléolo. Usando um mutante de deleção de rDNA de levedura, Oakes et al. (1998) descobriram que a transcrição de rDNA por Pol I de um plasmídeo induziu múltiplas estruturas pequenas e densas, “mininucléolos”, enquanto a transcrição de rDNA por Pol II formou uma estrutura maior agregada. Inserção de uma repetição de rDNA de transcrição ativa em Drosófila cromossomos politênicos resultaram em mininucléolos densos em torno dos locais de transcrição (Karpen et al., 1988). Esses achados demonstram que a transcrição de rDNA por si só gera estruturas densas que não se assemelham a nucléolos típicos com características estruturais bem organizadas e classicamente definidas. Verheggen et al. (1998) descobriram que durante Xenopus laevis desenvolvimento pré-rRNAs maternos estão presentes em estruturas concentradas de nucleolina com características de nucléolos transcricionalmente competentes. No entanto, a síntese de rRNA não foi detectada com o uso de um método run-on in situ, sugerindo que os nucléolos se formam antes da ativação da transcrição de Pol I. Outro grupo de estudos usou ActD (Ochs et al., 1985) ou inibidor da topoisomerase I do DNA (Weisenberger et al., 1993) ou injeção de anticorpo anti-Pol I (Benavente et al., 1987) para avaliar a regeneração de nucléolos em células de mamíferos. Os resultados desses estudos sugeriram que nucléolos típicos não foram montados quando as células progrediram para G1 em qualquer uma dessas condições. Em vez disso, as micrografias eletrônicas revelaram estruturas redondas contendo elementos fibrilares e granulares densos, ou PNBs alterados (Ochs et al., 1985 Benavente et al., 1987). Esses estudos sugerem que a transcrição do rDNA pode não ser necessária ou suficiente para a montagem de nucléolos típicos. Portanto, a montagem nucleolar deve ser examinada como eventos integrados complexos envolvendo a transcrição do rDNA e outros mecanismos ainda não definidos.

Neste artigo, examinamos a distribuição temporal da transcrição de Pol I e ​​fatores de processamento pré-rRNA, incluindo UBF, nucleolina e fibrilarina, bem como pré-rRNAs ao longo da mitose e no início da interfase. Relatamos pela primeira vez que a nucleologenesia também envolve o recrutamento direto de fatores de processamento e pré-rRNAs para RONs associadas ao fator de transcrição logo no final da mitose. Ao contrário da fusão de PNBs, esse processo é independente da transcrição de Pol I. We also find that pre-rRNAs synthesized in the previous cell cycle participate in the assembly of daughter cell nucleoli, suggesting that these RNAs may play a role in structuring nucleoli.


Domínios nucleares

O núcleo da célula de mamífero é uma organela ligada à membrana que contém a maquinaria essencial para a expressão gênica. Embora os primeiros estudos tenham sugerido que existe pouca organização neste compartimento, estudos mais contemporâneos identificaram um número crescente de domínios especializados ou organelas subnucleares dentro do núcleo (Lamond e Earnshaw, 1998EF7 Spector, 1993EF15). Em alguns casos, esses domínios têm se mostrado estruturas dinâmicas e, além disso, ocorre uma troca rápida de proteínas entre muitos dos domínios e o nucleoplasma (Misteli, 2001EF10). Um grande esforço está atualmente em andamento por vários laboratórios para determinar a (s) função (ões) biológica (s) associada (s) a cada domínio. O pôster anexo apresenta uma visão geral dos domínios nucleares comumente observados. FIG1

O núcleo é delimitado por um envelope nuclear, uma estrutura de membrana dupla, cuja membrana externa é contígua com o retículo endoplasmático rugoso e é frequentemente cravejada de ribossomos. As membranas nucleares interna e externa são fundidas em alguns lugares, formando poros nuclearesque servem no trânsito de materiais entre o núcleo e o citoplasma (Stoffler et al., 1999EF16). Foi demonstrado que o complexo de poros nucleares tem uma subestrutura notável, na qual uma cesta se estende até o nucleoplasma. o lâmina nuclear periférica encontra-se dentro do envelope nuclear e é composto pelas lâminas A / C e B e acredita-se que desempenhe um papel na regulação da estrutura do envelope nuclear e na ancoragem da cromatina interfase na periferia nuclear. Patches internos da proteína lamina também estão presentes no nucleoplasma (Moir et al., 2000EF11). O desenho mostra grande parte do envelope nuclear / lâmina periférica como transparente, de modo que as estruturas internas podem ser observadas mais facilmente.

Dentro do nucleoplasma, os cromossomos são organizados em territórios cromossômicos, e acredita-se que os genes ativos residam em toda a superfície dos territórios pouco compactados (Cremer et al., 2000EF1). Os homólogos não parecem estar emparelhados em núcleos de mamíferos em interfase. Em alguns tipos de células, uma banda deheterocromatina (cromatina inativa) é observada apenas internamente e associada à lâmina nuclear. In addition, varying amounts of heterochromatin are also observed in more internal nuclear regions. PcG bodies containing polycomb group proteins (i.e. RING1, BMI1 and hPc2) have been observed associated with pericentromeric heterochromatin (Saurin et al.,1998EF13). These domains vary in number (two to several hundred), size (0.2-1.5 μm) and protein composition. It is currently unclear whether these domains are storage compartments or are directly involved in silencing.

Pre-mRNA splicing factors are localized in a pattern of 25-50 nuclear speckles as well as being diffusely distributed throughout the nucleoplasm(Spector, 1993EF15). Many of the larger speckles correspond to interchromatin granule clusters (IGCs). These clusters measure 0.8-1.8 μm in diameter and are composed of 20-25-nm diameter particles that appear connected in places. IGCs have been proposed to be involved in the assembly and/or modification of pre-mRNA splicing factors. Nuclear speckles are dynamic structures, and factors are recruited from them to sites of transcription (perichromatin fibrils). Transcription sitesare observed throughout the nucleoplasm, including on the periphery of IGCs,as several thousand foci. In addition to being diffusely distributed, several transcription factors have also been shown to be concentrated in one to three compartments termed OPT (Oct1/PTF/transcription) domínios. These domains are 1.0-1.5 μm in diameter and also contain nascent transcripts as well as other transcription factors, but they contain few, if any, factors involved in RNA processing (Grande et al.,1997EF4 Pombo et al.,1998EF12). The OPT domain appears in G1 phase, when it often resides next to nucleoli, and it disappears during S phase. Its function is unknown.

In many cell types, pre-mRNA splicing factors are also localized in 1-10Cajal bodies, previously called Coiled Bodies (Gall,2000EF3). These dynamic nuclear bodies are 0.2-1.0 μm in diameter and are thought to play a role in snRNP biogenesis and in the trafficking of snRNPs and snoRNPs. Spliceosomal U1, U2,U4/U6 and U5 snRNPs, as well as the U7 snRNP involved in histone 3′-end processing, and U3 and U8 snoRNPs involved in processing of pre-rRNA, all localize to this structure. It has been proposed that these factors move through the Cajal body en route to nuclear speckles (snRNPs) or nucleoli(snoRNPs). In addition, the Cajal body has been shown to associate with histone loci as well as U1, U2 and U3 gene clusters (Matera,1999EF8).

Joias (gemini of Cajal bodies) are found in the nucleoplasm and are coincident with or adjacent to Cajal bodies, depending upon the cell line examined, and they have been characterized by the presence of the survival of motor neurons gene product (SMN) and an associated factor, Gemin2 (Matera,1999EF8). The cytoplasmic pool of SMN and Gemin2 has been implicated in the assembly of snRNPs, and the nuclear pool may play an additional role in snRNP maturation. Interestingly, spinal muscular atrophy, a motor neuron degenerative disease, results from reduced levels of, or a mutation in, the SMN protein.

Several factors specifically involved in the cleavage and polyadenylation steps of pre-mRNA processing (e.g. CstF and CPSF) have a diffuse distribution pattern in the nucleus and in addition are concentrated in 1-4 foci, each 0.3-1.0 μm in diameter, called cleavage bodies (Schul et al.,1996EF14). These structures either overlap with or are localized adjacent to Cajal bodies. The subset of cleavage bodies that do not overlap with Cajal bodies contain newly synthesized RNA.

o Nucléolo is the site of rRNA synthesis, rRNA processing, and assembly of ribosomal subunits (Spector,1993EF15) and is perhaps the most obvious internal nuclear compartment. Most mamalian cells contain 1-5 nucleoli, each 0.5-5.0 μm in diameter. The nucleolus is differentiated into three clearly identifiable regions. The fibrillar centers (shown as green ovals within the nucleolus) are regions that are thought to be the interphase equivalent of nucleolar-organizing regions (NORs) of chromosomes. Human cells contain approximately 250 copies of rDNA located at NORs on five different pairs of chromosomes. Transcription and processing of rRNA is thought to occur within the dense fibrillar component (shown as a blue reticulum), a region that surrounds and in some cases extends between the fibrillar centers. The granular region (shown as green granules) of the nucleolus is made up of pre-ribosomal particles at different stages of maturation, as well as large and small ribosomal subunits.

o perinucleolar compartment (PNC) and the SAM68 nuclear body (Huang, 2000EF5) have been identified as unique structures that are associated with the surface of nucleoli and are thought to play a role in RNA metabolism. They range in size from 0.25-1.0 μm in diameter, and 1-10 are observed per nucleus. The PNC contains a series of small RNAs transcribed by RNA polymerase III and several RNA-binding proteins, including poly-pyrimidine-tract-binding (PTB) protein. SAM68 nuclear bodies contain members of a group of RNA-binding proteins that contain a GSG domain, also called the STAR (signal transduction and activation of RNA) domain, which is a 100-residue sequence highly homologous to the KH domain found in hnRNP K. Although the functions of the PNC and SAM68 nuclear bodies are unknown, both of these structures are predominantly found in cancer cells, and they are rarely observed in primary cells.

PML bodies (Maul et al.,2000EF9) vary in size from 0.3μm to 1.0 μm in diameter, and a typical mammalian nucleus contains 10-30 of these structures. PML bodies have also been called ND10, PODs (PML oncogenic domains) and Kr bodies. In addition to the PML protein, several other proteins, including Sp100, SUMO1, HAUSP and CBP, have been localized to this nuclear domain in addition to being diffusely distributed in the nucleoplasm. PML bodies have been suggested to play a role in aspects of transcriptional regulation and appear to be targets of viral infection. Interestingly, individuals suffering from acute promyelocytic leukemia (APL)have a t(15,17) translocation, in which the the PML gene is fused to the gene that encodes the α-retinoic acid receptor, which results in the production of a fusion protein. Cells from these individuals exhibit a break-up of PML bodies into a large number of smaller domains, which are scattered throughout the nucleoplasm. Treatment with retinoic acid, which results in these individuals going into remission, also results in a reformation of typical PML bodies.

In addition to the above domains generally observed in mammalian nuclei,other domains that are specific to cell type or physiological state have also been reported. For example, GATA-1 nuclear bodies containing GATA transcription factors have been observed in murine haemopoietic cells(Elefanty et al., 1996EF2). However, these domains are not active in transcription. HSF1 foci containing the transcription factor, heat shock factor 1, have been observed in nuclei of cells that have been subjected to heat shock, however these domains do not coincide with HSP70 ou HSP90 transcription sites (Jolly et al., 1997EF6).

The above text provides an expanded legend to the accompanying poster it is not meant to serve as a review of primary research papers, and as such much of the primary literature has not been cited here. Readers are encouraged to access the cited reviews in order to locate the primary research papers on particular nuclear bodies. I thank Jim Duffy for his outstanding artistic skills in developing the cartoon, and the following individuals who provided immunofluorescent images for this poster: Mark Frey and Greg Matera (Cajal body and Gem), Paul Mintz (RNA polymerase II transcription factor, nucleoli,peripheral nuclear lamina, perinucleolar compartment, PML body, nuclear speckles), Ana Pombo (OPT domain), Stéphane Richard (Sam68 nuclear body), Thomas Ried and Evelin Schröck (chromosome territory). In addition, I thank Edith Heard, Greg Matera and members of my laboratory for their insight and useful discussions. Research in my laboratory is funded by NIH/NIGMS 42694-12.


Acknowledgements

The meeting was generously supported by the European Molecular Biology Organization, The Company Of Biologists, Carl Zeiss Ltd and Eppendorf UK Ltd. Special thanks go to J. Hiscox and D. Mathews who did an excellent job of organizing the event, and to A. Whitehouse who was an unofficial organizer. We also thank J. Brown for providing Fig 1 and I. Grummt for providing Fig 2. The L.A.S. group is supported by Cancer Research UK (C20658/A6656) and the Melville Trust. M.T. is supported by the Scottish government.

Glossário

alternate reading frame product of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2a (CDKN2A) locus

nucleolar phosphoprotein also known as nucleophosmin and NPM1

b subunit of U three proteins

nucleolar localized splice variant of Fbw7, which is an F-box protein that acts as a specificity factor for the Skp1–Cul1–F-box (SCF) ubiquitin ligase complex