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PCR e PCR em grande escala

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Realizei PCR com 50 μL, que mostrou uma banda clara na eletroforese em gel. Em seguida, realizei PCR em grande escala com 3650 μL, que mostrou uma banda obscura na eletroforese em gel. Qual pode ser a razão para isso? Poderia ser perda de plasmídeo mesmo que haja uma banda, apenas uma muito obscura? Deve-se mencionar que o único PCR foi realizado no verão, e o em grande escala foi realizado agora


Fiz a grande escala em um tubo falcon e, em seguida, movi a mistura para tubos de PCR, cada um contendo 50 μL, de modo que as condições de PCR devem ser as mesmas da amplificação de PCR única

Se todas as concentrações de reagentes e condições de ciclo forem iguais, suspeito que você não misturou suficientemente sua reação de grande volume antes de dispensar alíquotas de 50 μL.

Deve-se mencionar que o único PCR foi realizado no verão, e o em grande escala foi realizado agora

Se você estivesse usando os mesmos estoques de polimerase e primer para as reações de pequeno e grande volume, os estoques foram armazenados adequadamente nesse ínterim? DNA polimerases recombinantes em tampões de glicerol têm vida útil de meses a anos, dependendo das especificações do fornecedor e das condições de armazenamento, embora você deva esperar alguma diminuição da atividade após vários meses.


Avaliação comparativa de um kit comercial e dois ensaios de PCR desenvolvidos em laboratório para diagnóstico molecular de toxoplasmose congênita

A toxoplasmose é uma infecção mundial que pode causar doenças graves e é considerada um grave problema de saúde na França. A detecção do parasita por métodos moleculares é fundamental para o diagnóstico da doença. A extrema diversidade de métodos e desempenhos dos ensaios de PCR de Toxoplasma torna o uso de kits comerciais de PCR uma alternativa atraente, pois oferecem uma chance de padronização. Comparamos o desempenho de três métodos moleculares para a detecção de DNA de Toxoplasma gondii em líquido amniótico: um método comercial usando nested PCR e dois métodos desenvolvidos em laboratório, um usando PCR convencional e outro em tempo real. Esta avaliação foi baseada em um ensaio de diluição serial de DNA de T. gondii, três amostras de líquido amniótico enriquecidas com T. gondii em diferentes concentrações e uma coorte clínica de 33 amostras de líquido amniótico. O ensaio de diluição em série do DNA de T. gondii mostrou uma sensibilidade muito menor para o kit comercial do que para os métodos desenvolvidos em laboratório. Além disso, dos 12 casos comprovados de toxoplasmose congênita, 91,7% foram detectados pelos testes desenvolvidos em laboratório, enquanto apenas 50% foram detectados pelo kit comercial. A falta de sensibilidade do método, em parte devido à presença de inibidores de PCR, foi a principal desvantagem do método comercial. Este estudo enfatiza que os kits comerciais de diagnóstico de PCR não apresentam desempenho melhor do que métodos cuidadosamente otimizados desenvolvidos em laboratório. Há uma necessidade de avaliação completa de tais kits por grupos proficientes, bem como de padrões de desempenho em que os kits comerciais podem ser testados para melhorar a confiança naqueles selecionados por profissionais de saúde.


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A PCR Biosystems desenvolve e fabrica kits e reagentes de PCR para pesquisas e diagnósticos de biologia molecular. Após mais de 20 anos de experiência na indústria, os cofundadores Mark Stevens e Alex Wilson lançaram a empresa em 2012 com o objetivo de fazer as coisas de forma diferente. O foco tem sido a criação de reagentes de PCR de alto desempenho que simplificam a pesquisa dos clientes e componentes de precisão para apoiar os parceiros no desenvolvimento de seus ensaios diagnósticos.

Agora, nove anos depois, a PCR Biosystems tem um portfólio de reagentes projetados usando ensaios proprietários e tecnologia de tela inteligente, cobrindo um amplo espectro de aplicações de PCR. É importante ressaltar que a PCR Biosystems também opera sob um sistema de gestão de qualidade com certificação ISO 13485: 2016, o que significa que os produtos e processos atendem aos padrões internacionais para a fabricação de componentes de dispositivos médicos.

Durante a pandemia, os holofotes se voltaram muito para o PCR. Conte-nos sobre seu novo produto qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect, como foi seu lançamento e para que pode ser usado.

Alex: “QPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect foi lançado no início da pandemia, especificamente para oferecer suporte a testes de alto rendimento para SARS-CoV-2 (o vírus responsável pelo COVID-19). Este produto é um kit 4x RT-qPCR de alta concentração projetado para detecção rápida e precisa de sequências de RNA virais. Tudo o que é necessário é a adição de primers e sondas específicas, junto com o extrato do swab e água. Um benefício importante para os usuários é a capacidade de adicionar mais amostra às suas reações para aumentar a sensibilidade analítica, mesmo ao trabalhar com reações de pequeno volume.

Ao desenvolver qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect, pretendemos oferecer aos pesquisadores e fabricantes de kits de diagnóstico flexibilidade no desenvolvimento de seus ensaios e confiança máxima na qualidade e precisão dos resultados gerados. ”

De que outra forma a PCR Biosystems ajudou a apoiar a luta contra o COVID-19?

Alex: “Como você pode imaginar, a demanda por reagentes rápidos e confiáveis ​​disparou com a gravidade da crise. Além do qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect, nosso portfólio pré-pandêmico já incluía uma gama de produtos que poderiam ser usados ​​para o teste COVID-19, e imediatamente aumentamos a produção desses reagentes essenciais.

Para apoiar os testes em grande escala, introduzimos tamanhos de embalagens a granel de nossos principais produtos, garantindo consistência, conveniência e valor para testes de alto rendimento de amostras clínicas. Além disso, validamos nosso intervalo qPCRBIO Probe 1-Step para a detecção qualitativa de ácido nucleico SARS-CoV-2 usando as sequências de primer-sonda recomendadas por Charité, Berlin e CDC (genes RdRp, E e N). Apoiar os clientes com experiência técnica no desenvolvimento de ensaios e aumento de escala foi outro foco importante de nossa equipe ao longo do ano passado.

No meio da pandemia, começamos a fornecer nosso Riboshield & # x2122 RNase Inhibitor sob medida como um produto independente. Este reagente protege o RNA e pode estabilizar alvos de RNA, como SARS-CoV-2 em amostras, garantindo resultados diagnósticos confiáveis.

Mais recentemente, lançamos IsoFast & # x2122 Bst 1-Step Mix, fornecendo um método alternativo ao PCR para a amplificação e análise de RNA viral. Por meio de suas capacidades de deslocamento de fita de ácido nucleico, a polimerase Bst elimina a necessidade da etapa de desnaturação em alta temperatura associada às enzimas Taq tradicionais. Isso permite que o resultado seja mais rápido e facilita a detecção de baixo custo no campo, sem equipamento de termociclagem especializado. ”

Embora muitas cadeias de abastecimento tenham sido interrompidas devido à pandemia, como a PCR Biosystems continuou a expandir e otimizar as operações para garantir o abastecimento contínuo?

Alex: “Desde o início da pandemia, temos o compromisso de garantir que pesquisadores e organizações em todos os mercados possam acessar os produtos e serviços de PCR de que precisam. Ser ágil e rápido para responder tem sido fundamental para nossa capacidade de atender a todos os pedidos de reagentes recebidos durante esse período - algo do qual estou incrivelmente orgulhoso.

Graças ao nosso planejamento de contingência, implementamos imediatamente o trabalho por turnos para produção, montagem e atendimento de pedidos e tínhamos três equipes destacadas trabalhando sete dias por semana, com duas equipes comerciais totalmente treinadas na reserva para fornecer suporte operacional.

Aumentamos maciçamente a fabricação de reagentes RT-qPCR e direcionamos nossos clientes para formatos a granel, reconhecendo a escassez iminente de material plástico. Ter um excelente relacionamento com os fornecedores tem sido fundamental, e a ampliação não só do nosso negócio, mas também de nossos fornecedores críticos, uma etapa essencial nesse processo.

Com nossas instalações de fabricação expandidas, grandes reservas de estoque, capacidade de expansão e um grande aumento em nossa equipe de especialistas em PCR, fomos capazes de cumprir nosso compromisso de fornecimento ininterrupto de reagentes e estamos bem posicionados para lidar com qualquer aumento futuro da demanda. ”

O que o futuro reserva para a PCR Biosystems?

Alex: “Somos ambiciosos com nossos planos futuros - investindo maciçamente em nossas atividades de pesquisa e desenvolvimento e impulsionando uma grande linha de desenvolvimento de produtos. A visão de longo prazo, tanto para a pandemia atual como depois, é facilitar o acesso fácil a reagentes diagnósticos e moleculares que ofereçam estabilidade e confiabilidade, especialmente para aplicações em pontos de atendimento. Para esse fim, estamos lançando em breve uma linha de reagentes de PCR Lyo-Ready. Esses produtos podem ser liofilizados - um processo de secagem até a forma sólida, tornando o transporte e o armazenamento mais fáceis, aumentando a vida útil do produto e permitindo maior flexibilidade no volume da amostra.

Também continuaremos a expandir nossas parcerias de distribuição e colaborações de diagnóstico à medida que avançamos em 2021 e além. Na corrida pelos reagentes de teste COVID-19, sabemos que algumas regiões foram menos capazes de garantir os materiais necessários de seus fornecedores. Temos nos beneficiado muito de uma rede de distribuidores altamente experiente, apoiando os clientes em suas necessidades de reagentes em 39 países. Nosso compromisso em fornecer aos sistemas globais de saúde os produtos e conhecimentos necessários permanecerá sempre forte no futuro da PCR Biosystems. ”

Para obter mais informações, entre em contato com a sede do Reino Unido em + 44 (0) 20 3930 8101, e-mail [email protected] ou visite www.pcrbio.com

Observação: este é um perfil comercial

© 2019. Este trabalho está licenciado sob um Licença CC BY 4.0.


Experimentos baseados em investigação para introdução em larga escala de PCR e digestão de enzimas de restrição

Endereço para correspondência: Department of Chemistry, Xavier University of Louisiana, 1 Drexel. Dr., New Orleans, LA 70125, EUA. E-mail: [email protected] [email protected] .Pesquise mais artigos deste autor

Departamento de Química, Xavier University of Louisiana, 1 Drexel. Dr., New Orleans, Louisiana, 70125

KEJ e TJW contribuíram igualmente para este trabalho.

Endereço para correspondência: Department of Chemistry, Xavier University of Louisiana, 1 Drexel. Dr., New Orleans, LA 70125, EUA. E-mail: [email protected] [email protected] .Pesquise mais artigos deste autor

Departamento de Química, Xavier University of Louisiana, 1 Drexel. Dr., New Orleans, Louisiana, 70125

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Departamento de Química, Xavier University of Louisiana, 1 Drexel. Dr., New Orleans, Louisiana, 70125

KEJ e TJW contribuíram igualmente para este trabalho.

Endereço para correspondência: Department of Chemistry, Xavier University of Louisiana, 1 Drexel. Dr., New Orleans, LA 70125, EUA. E-mail: [email protected] [email protected] .Pesquise mais artigos deste autor

Resumo

A reação em cadeia da polimerase e a digestão com endonuclease de restrição são técnicas importantes que devem ser incluídas em todos os currículos dos laboratórios de Bioquímica e Biologia Molecular. Essas técnicas são frequentemente ensinadas em um nível avançado, exigindo muitas horas do aluno e do corpo docente. Aqui, apresentamos dois experimentos baseados em investigação que são projetados para cursos introdutórios de laboratório e combinam as duas técnicas. Em ambas as abordagens, os alunos devem determinar a identidade de uma sequência de DNA desconhecida, seja uma sequência de gene ou uma sequência de primer, com base em uma combinação de tamanho do produto de PCR e padrão de digestão de restrição. O projeto experimental é flexível e pode ser adaptado com base no tempo e nos recursos disponíveis de preparação do instrutor, e ambas as abordagens podem acomodar um grande número de alunos. Implementamos esses experimentos em nossos cursos com um total combinado de 584 alunos e uma taxa de sucesso de 85%. No geral, os alunos demonstraram um aumento em sua compreensão dos tópicos experimentais, capacidade de interpretar os dados resultantes e proficiência em habilidades laboratoriais gerais. © 2015 pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular, 43: 441–448, 2015.

Informações adicionais de suporte podem ser encontradas na versão online deste artigo.

Observação: O editor não é responsável pelo conteúdo ou funcionalidade de qualquer informação de suporte fornecida pelos autores. Quaisquer dúvidas (que não sejam de conteúdo ausente) devem ser direcionadas ao autor correspondente do artigo.


Validação de PCR em grande escala em tempo real em medições de expressão gênica de dois microarrays comerciais de oligonucleotídeos longos

Fundo: Os microarranjos de DNA estão se tornando rapidamente uma ferramenta fundamental na pesquisa genômica e biomédica baseada em descobertas. No entanto, a confiabilidade dos resultados do microarray está sendo desafiada devido à existência de diferentes tecnologias e métodos não padronizados de análise e interpretação de dados. Na ausência de um "padrão ouro" / "método de referência" para as medições de expressão gênica, os estudos que avaliam e comparam o desempenho de várias plataformas de microarray frequentemente produziram conclusões subjetivas e conflitantes. Para resolver esse problema, conduzimos um experimento de PCR em tempo real baseado em Ensaio de Expressão Gênica TaqMan em grande escala e usamos esse conjunto de dados como referência para avaliar o desempenho de duas plataformas comerciais representativas de microarray.

Resultados: Neste estudo, analisamos os perfis de expressão gênica de três tecidos humanos: cérebro, pulmão, fígado e uma amostra de referência humana universal (UHR) usando duas plataformas comerciais representativas de microarray de oligonucleotídeos longos: (1) Applied Biosystems Human Genome Survey Microarrays (com base na detecção de uma única cor) (2) Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays (com base na detecção de duas cores). 1.375 genes representados por ambas as plataformas de microarray e abrangendo uma ampla faixa dinâmica em níveis de expressão gênica, foram selecionados para validação de PCR em tempo real baseada no ensaio de expressão gênica TaqMan. Para cada plataforma, quatro réplicas técnicas foram realizadas nas mesmas amostras de RNA total de acordo com os protocolos padrão de cada fabricante. Para matrizes Agilent, a hibridização comparativa foi realizada usando a incorporação de Cy5 para cérebro / pulmão / RNA do fígado e Cy3 para UHR RNA (referência comum). Usando o conjunto de dados de PCR em tempo real baseado no Ensaio de Expressão Gênica TaqMan como o conjunto de referência, o desempenho das duas plataformas de microarray foi avaliado com foco nos seguintes critérios: (1) Sensibilidade e precisão na detecção de expressão (2) Correlação de alteração de dobra com dados de PCR em tempo real em tecidos de pares, bem como em perfis de expressão gênica determinados em todos os tecidos (3) Sensibilidade e precisão na detecção de expressão diferencial.

Conclusão: Nosso estudo fornece um dos maiores conjuntos de dados de "referência" de medições de expressão gênica usando a tecnologia de PCR em tempo real baseada no TaqMan Gene Expression Assay. Este conjunto de dados nos permitiu usar uma tecnologia alternativa de expressão gênica para avaliar o desempenho de diferentes plataformas de microarray. Concluímos que os microarrays são de fato ferramentas de descoberta inestimáveis ​​com confiabilidade aceitável para a triagem da expressão gênica em todo o genoma, embora a validação de supostas mudanças na expressão gênica permaneça aconselhável. Nosso estudo também caracteriza as limitações dos microarranjos, o entendimento dessas limitações permitirá que os pesquisadores avaliem os resultados dos microarranjos de maneira mais eficaz e apropriada de maneira mais cautelosa e apropriada.


Reagentes e enzimas de PCR

Aprenda sobre a história do PCR, considerações de configuração, importância da escolha da DNA polimerase, métodos e aplicações comuns e solução de problemas.


Agradecimentos

Agradecemos A. Boehm por fornecer informações e suporte de laboratório em Stanford R. Martone e L. Sassoubre por conversas úteis sobre o projeto experimental Ofelia C. Romero-Maraccini, M. Mattioli e D. Lee pelo suporte técnico O. Shelton, J. Samhouri , G. Williams, S. Hennessey, A. Stier, B. Feist e P. Levin por discussões analíticas relacionadas e suporte de campo R. Morris e V. Armbrust por insights e suporte laboratorial na UW e no Helen R. Whiteley Center em Friday Harbor Laboratories por apoiar o workshop de redação que avançou substancialmente este produto. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da David and Lucile Packard Foundation.


Como uma polimerase de alta fidelidade garante que a base correta seja inserida?

DNA polimerases de alta fidelidade têm várias salvaguardas para proteger contra erros cometidos e propagados durante a cópia de DNA. Tais enzimas têm uma preferência de ligação significativa para o trifosfato de nucleosídeo correto versus incorreto durante a polimerização. Se um nucleotídeo incorreto se liga ao sítio ativo da polimerase, a incorporação é retardada devido à arquitetura subótima do complexo do sítio ativo. Esse intervalo de tempo aumenta a oportunidade do nucleotídeo incorreto se dissociar antes da progressão da polimerase, permitindo assim que o processo seja reiniciado, com um trifosfato de nucleosídeo correto (1,2). Se um nucleotídeo incorreto for inserido, a revisão de DNA polimerases terá uma linha extra de defesa (Figura 1). A perturbação causada pelas bases pareadas incorretamente é detectada e a polimerase move a extremidade 3 & aguda da cadeia de DNA em crescimento para um domínio de exonuclease 3 & aguda & rarr5 & aguda de revisão. Nesse local, o nucleotídeo incorreto é removido pela atividade de exonuclease 3 & aguda & rarr5 & aguda, após o que a cadeia é movida de volta para o domínio da polimerase, onde a polimerização pode continuar.


Referências

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Assista o vídeo: PCR Polymerase Chain Reaction (Agosto 2022).