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4.5: Revisão dos procedimentos de coloração - Biologia

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Para ajudá-lo a revisar os procedimentos de coloração nos Laboratórios 3 e 4, preencha a tabela abaixo com informações sobre esses procedimentos de coloração. Essas informações devem incluir (mas não se limitar a) o seguinte:

  • O que o procedimento de coloração informa sobre a estrutura da célula bacteriana ou os tipos de estruturas produzidas pelas bactérias?
  • O procedimento de coloração é usado para detectar tipos específicos de células? Se sim, quais são eles?
  • Como são os resultados positivos e negativos no final do procedimento?
  • Existe alguma relevância clínica para os resultados do procedimento de coloração?
  • Qualquer outra informação que o ajude a entender o que o procedimento de coloração detecta e como funciona.

Exercício ( PageIndex {1} )

Procedimento de coloraçãoEm formação
Grama
Ziehl-Neelson
Schaeffer-Fulton
Nitrato de prata
Coloração Negativa

Visão geral das técnicas de imunohistoquímica / imunofluorescência multiplex na era da imunoterapia contra o câncer

A imunohistoquímica convencional (IHQ) é uma técnica diagnóstica amplamente utilizada na patologia de tecidos. No entanto, essa técnica está associada a uma série de limitações, incluindo alta variabilidade interobservador e a capacidade de marcar apenas um marcador por seção de tecido. Esta revisão detalha várias técnicas altamente multiplexadas que surgiram para contornar essas restrições, permitindo a detecção simultânea de vários marcadores em uma única seção de tecido e o estudo abrangente da composição celular, função celular e interações célula-célula. Dentre essas técnicas, a imunohistoquímica / imunofluorescência multiplex (mIHC / IF) tem se mostrado particularmente promissora. mIHC / IF fornece coloração multiplex de alto rendimento e análise quantitativa padronizada para estudos de tecidos altamente reprodutíveis, eficientes e econômicos. Esta técnica tem potencial imediato para pesquisa translacional e prática clínica, particularmente na era da imunoterapia contra o câncer.

Palavras-chave: imunofluorescência imunohistoquímica imunoterapia visão geral multiplex.

© 2020 os autores. Cancer Communications publicado por John Wiley & Sons Australia, Ltd. em nome do Sun Yat-sen University Cancer Center.


Coloração de Gram sob Microscópio

A coloração de Gram é provavelmente um dos procedimentos de coloração mais comumente usados ​​no campo da microbiologia. É um dos corantes diferenciais usados ​​para caracterizar bactérias em um de dois grupos: bactérias gram positivas ou bactérias gram negativas.

As bactérias Gram positivas normalmente terão uma afinidade mais forte com o violeta de cristal ao aplicar o iodo de Gram do que a parede celular Gram negativa.

Por ser um mordente, o iodo de Gram forma um complexo com o violeta de cristal na mancha, que se adere mais firmemente à parede celular das bactérias Gram-positivas do que as das Gram-negativas.

Enquanto as bactérias Gram positivas coram com violeta como resultado da presença de uma espessa camada de peptidoglicano nas paredes de suas células, as bactérias Gram negativas coram de vermelho, devido à camada mais fina de peptidoglicano em sua parede celular (uma camada mais espessa de peptidoglicano permite a retenção da mancha, mas uma camada mais fina não).

Técnica

A coloração envolve 3 etapas / processos principais que incluem:

o Coloração com violeta cristal (um corante solúvel em água)

o Descoloração (usando etanol / acetona)

o Contracoloração (usando Safranin)

Devido às diferenças na espessura da camada de peptidoglicano nas paredes celulares dessas bactérias, as bactérias gram positivas reterão a mancha violeta de cristal após o processo de descoloração com álcool etílico / acetona.

Depois de tingir a amostra com violeta de cristal, álcool etílico é usado para descolorir a amostra. Ele atinge seu objetivo desidratando a camada de peptidoglicano, estreitando-a e diminuindo-a. Ao fazer isso, o violeta cristal grande não consegue penetrar na camada rígida de peptidoglicano e, portanto, fica preso na parede celular das bactérias gram-positivas.

Por outro lado, a membrana externa das células gram negativas não pode reter o complexo de iodo violeta cristal e, portanto, a cor é perdida.

A safranina é uma coloração mais clara em comparação com o violeta cristal e, portanto, interrompe a coloração roxa nas células gram positivas.

Teoria

Em uma solução aquosa, o violeta cristal se dissocia em íons de CV + e CV-. Esses íons penetram nas paredes e membranas de células gram positivas e negativas.

CV + irá interagir com os componentes carregados negativamente das células bacterianas e assumir a coloração roxa. Ao adicionar iodo, os cátions de iodo (I - ou I 3 -) interagem com CV +, o que resulta na formação de complexos maiores de CVI no citoplasma e nas camadas externas da célula.

Ao adicionar o agente descolorante (etanol), ele interage com os lipídios da membrana tanto do Gram positivo como do Gram negativo positivo e do Gram negativo.

Isso resulta na perda da membrana externa, que por sua vez deixa a camada de peptidoglicano exposta. Para as células Gram negativas, o etanol faz com que as paredes vazem e, portanto, elas não possam reter os grandes complexos de CV-L durante a descoloração.

Em alguns dos processos de coloração usando coloração de Gram, um padrão de variáveis ​​de Gram é obtido, que é uma mistura de rosa e roxo.

Alguns generas, como Arthrobacter, Actinomyces e Corynebacterium têm uma parede celular que é particularmente sensível à quebra durante a divisão celular.

Isso resulta na coloração de Gram negativos das células Gram positivas.

Por outro lado, em culturas de Clostridium e Bacillus, a espessura reduzida do peptidoglicano durante o crescimento coincide com um aumento do número de células que, por sua vez, se coram como Gram negativas.

Preparativos

1. A coloração primária (reagentes de cristal violeta para coloração)

o 2 gramas de violeta cristal (certificado de 90 por cento do conteúdo de corante)

o 20ml de etanol (95 por cento vol / vol)

o 0,8 gramas de oxalato de amônio,

o 80ml de água destilada,

Misture A e B para obter o reagente de coloração com violeta cristal e armazene por 24 horas.

2. M ordant (gramas de iodo)

o gramas de iodeto de potássio,

o 300ml de água destilada,

Usando um almofariz, iodo e iodeto de potássio são moídos, enquanto se adiciona água lentamente com trituração contínua até que todo o iodo esteja completamente dissolvido. (Armazene em uma garrafa âmbar)

3. Agente descolorante

o Etanol, 95 por cento (vol / vol)

No entanto, acetona ou acetona 1: 1 com etanol,

4. Contracoloração (safranina)

o 10ml da solução estoque (2,5 gramas de Safranina O e 100ml de etanol a 95 por cento)

o 90ml de água destilada

Procedimento

É importante notar que a espessura do esfregaço da amostra na lâmina é uma consideração importante durante a preparação da amostra. O esfregaço não deve ser muito fino ou fino.

Bactérias - espalhar a amostra na lâmina usando uma agulha de inoculação. Isso também pode ser feito através da introdução de uma gota de solução salina na lâmina, seguida pela amostra e, em seguida, misturando.

Isso deve ser deixado para secar ao ar antes da fixação por calor, passando cuidadosamente a lâmina através do bico de Bunsen (evite queimar a amostra).

Actinomicetes - o mesmo que as bactérias, mas tentando obter uma porção da colônia na lâmina enquanto ela ainda está intacta, isso pode ser feito usando um bisturi.

Procedimento de coloração

o Inundar a lâmina com reagente de coloração violeta de cristal por cerca de 1 minuto,

o Lave a lâmina usando um jato suave e indireto de água da torneira por cerca de 2 segundos, lave a lâmina com um mordente (iodo de Gram) e espere um minuto,

o Lave a lâmina novamente em um jato suave e indireto de água da torneira por cerca de 2 segundos,

o Inundar a lâmina com o agente descolorante e esperar 15 segundos. Isso também pode ser feito adicionando gota a gota ao slide até que o agente descolorante sendo executado nos slides seja transparente,

o Inundar a lâmina usando safranina contracolorada (e esperar por cerca de um minuto (30 segundos a 1 minuto)

o Lave a lâmina usando um jato suave e indireto de água da torneira até um ponto onde a cor apareça no efluente e, em seguida, seque o papel absorvente,

o Adicione uma gota de óleo de imersão na amostra corada e observe ao microscópio

A coloração de Gram ajuda a caracterizar as bactérias como gram positivas ou gram negativas, permitindo que os entusiastas / profissionais da microscopia verifiquem a parede e a membrana de uma célula bacteriana que, por sua vez, influencia várias facetas de sua patogenicidade e nível de virulência.


Nota: Antes de executar o gel, certifique-se de que o gel, o aparelho de gel e as amostras estão prontos.

  1. Para a montagem, retire os géis da moldura de fundição e fixe-os no aparelho de gel (certifique-se de que a placa curta fica sempre virada para dentro e se tiver apenas um gel para correr use a placa simulada que está disponível para equilibrar).
  2. Quando as placas estiverem presas, coloque-as no cassete e trave-o.
  3. Coloque-os no tanque de corrida de gel.
  4. Encha a câmara interna do tanque com tampão (agora é fácil retirar o pente, pois está lubrificado).
  5. Retire o pente CUIDADOSAMENTE (sem quebrar o poço).
    [Agora o gel está pronto para carregar as amostras]
  6. Enxágüe a ponta de carregamento algumas vezes com água destilada. (Certifique-se de que toda a água seja derramada antes de carregar as amostras.)
  7. Insira a ponta de carregamento a alguns mm do fundo do poço e coloque as amostras no poço. Enxágüe a seringa com água destilada após carregá-la algumas vezes.
  8. Conecte a fonte de alimentação colocando a tampa (certifique-se de que a conexão esteja da maneira correta, ou seja, preto - preto e vermelho - vermelho). Defina a tensão para até 180 V e deixe funcionar por 1 hora (não deixe a frente do corante sair do gel).

Procedimentos gerais de coloração e segmentação para imagens e análises de alto conteúdo

A microscopia de fluorescência quantitativa automatizada, também conhecida como imagem de alto conteúdo (HCI), é uma abordagem analítica em rápido crescimento em biologia celular. Como a análise de imagem automatizada depende fortemente da demarcação robusta de células e regiões subcelulares, métodos confiáveis ​​para rotular células são um componente crítico do fluxo de trabalho de HCI. A marcação de células para segmentação de imagem é tipicamente realizada com sondas fluorescentes que se ligam ao DNA para demarcação de células com base no núcleo ou com aquelas que reagem com proteínas para análise de imagem com base na coloração de células inteiras. Esses reagentes, junto com as configurações do instrumento e do software, desempenham um papel importante no sucesso da segmentação de células em uma população para análise de imagem automatizada e quantitativa. Neste capítulo, descrevemos os procedimentos padrão para rotulagem e segmentação de imagens em amostras de células vivas e fixas. O capítulo também fornecerá diretrizes de solução de problemas para alguns dos problemas comuns associados a esses aspectos de HCI.

Palavras-chave: CellMask CellTracker Imagens de alto conteúdo Triagem de alto conteúdo Segmentação nuclear Segmentação.


Assista o vídeo: Procedimento coloração em Hematoxilina e Eosina (Agosto 2022).