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Perguntas sobre Cohesin - o que o domínio ATPase faz e quaisquer PDBs sugeridos para examinar?

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Tenho lido sobre cohesin recentemente e estou confuso sobre as interações da subunidade principal. Eu li alguns artigos e também encontrei esta bela figura do wiki que demonstra o cerne da minha pergunta (nota: SMC aqui corresponde a Cohesin, ou estou enganado? Tenho quase certeza de que está correto, ou muito correto ):

Lendo ao redor, estou ciente de que geralmente a subunidade principal é uma ATPase, mas a partir deste diagrama (e do "uso" típico de Cohesin na manutenção do TAD), não tenho certeza do que exatamente é o motivo ATPase tão útil para , parece que o ATP está "colando" os dois domínios principais, mas isso parece o oposto do que a ATPase normalmente faria, ou seja, catalisar ATP -> ADP. Isso me faz pensar que estou apenas entendendo algo errado e me perguntando qual é a função do motivo Walker A / B ATPase.

Além disso, estou me perguntando se há algum arquivo PDB legal que mostre um loop de cohesin, ou então são geralmente os mais instrutivos sobre Cohesin. Pesquisei alguns, mas gostaria de obter conselhos mais informados sobre algumas boas estruturas e talvez por que são legais.


Prakash Arumugam, Stephan Gruber, Koichi Tanaka, Christian H. Haering, Karl Mechtler, Kim Nasmyth, "ATP Hydrolysis Is Required for Cohesin's Association with Chromosomes", Current Biology, Volume 13, Issue 22, 2003,

no

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982203008042

A conclusão deles é:

"Conclusões: os complexos de coesina cujas cabeças foram conectadas por Scc1 devem hidrolisar ATP para se associar de forma estável aos cromossomos. Se a associação cromossômica for mediada pelo aprisionamento topológico do DNA dentro do anel da coesina, então a hidrólise do ATP pode ser responsável pela criação de uma porta através da qual O DNA pode entrar. Sugerimos que a hidrólise do ATP conduza a desconexão temporária de Scc1 das cabeças Smc que são necessárias para o aprisionamento do DNA e que esse processo é promovido por Scc2 / 4. "


Regulação unidirecional do F1FONanomotor -ATP sintase pela proteína inibidora de catraca ζ de Paracoccus denitrificans e α-proteobactérias relacionadas ☆

O mecanismo dos três inibidores naturais (ε, ζ e IF1) de F bacteriano e mitocondrial1FO-ATPases são revisadas.

Os três inibidores estruturalmente diferentes bloqueiam F1Rotação -ATPase ligando-se ao mesmo α catalíticoDPβDPΥ interface.

Os terminais N de α-proteobacterial ζ e IF mitocondrial1 mudança de intrinsecamente desordenada para α-hélice após F1 obrigatório.

ζ funciona como uma catraca unidirecional bloqueando apenas a rotação no sentido anti-horário para favorecer o giro da ATP sintase no sentido horário.

Os papéis de ε, ζ e IF1 são sugeridos como catracas unidirecionais para melhorar a bioenergética de células e / ou organismos.


Replicação SV40

Depois, escolhi um tema para o meu trabalho de diploma. Como eu estava longe de T & # x000fcbingen, estava menos familiarizado com a pesquisa lá. Pouco antes de começar um projeto para otimizar em vitro condições de crescimento de tripanossomos, conheci Hans Probst. Senti-me atraído por seu tópico, o estudo da replicação do DNA viral. O grupo de Probst descobriu que o início da replicação celular parava se os níveis de oxigênio no meio de crescimento caíssem abaixo de um certo limite. O metabolismo celular não foi afetado, mas o oxigênio reativo no sítio ativo da ribonucleotídeo redutase foi perdido. Este efeito também interrompeu o início da replicação do vírus símio 40 (SV40) em células infectadas. O desenrolamento da origem de replicação foi impedido, mas o mecanismo subjacente era misterioso (Riedinger et al, 1999). Para facilitar a análise molecular, minha tarefa era ver se um efeito da tensão de oxigênio ou dos pools de desoxinucleotídeos no disparo da origem poderia ser reproduzido em vitro, usando o poderoso SV40 em vitro reação de replicação. Os experimentos para reconstituir as reações de replicação do DNA em um tubo Eppendorf foram empolgantes, mas infelizmente a replicação do SV40 prosseguiu muito bem em condições anaeróbicas e uma ampla gama de níveis de desoxinucleotídeos. Enquanto fazia esses experimentos, li a literatura sobre SV40 em vitro replicação e as publicações de Peter Bullock, Jerard Hurwitz e Bruce Stillman deixaram uma grande impressão em mim (Murakami et al, 1992 Denis e Bullock, 1993 Waga e Stillman, 1994). Ficou claro que eu queria fazer mais dessas reações de replicação e estudar os mecanismos moleculares envolvidos. Portanto, o próximo passo lógico foi encontrar um projeto de doutorado na área.

Tomei coragem de escrever a esses três laboratórios, sem realmente esperar uma resposta. Surpreendentemente, todos os três responderam, cartas no correio na época, pessoalmente assinadas. Peter e Jerry tinham espaço e a decisão entre os dois não foi difícil. Se eu fosse para os Estados Unidos, gostaria de ir para Nova York, onde o laboratório de Jerry ficava no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Mas aí veio um novo obstáculo. Seria bom, escreveu Jerry, se eu encontrasse uma bolsa para me apoiar. Então comecei a investigar o que eram bolsas e como se poderia obter uma. O Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD) ofereceu financiamento para projetos de doutorado no exterior. Candidatei-me e escrevi como & # x02018plano de pesquisa 'como estava animado para trabalhar em um dos muitos projetos interessantes que estavam em andamento no laboratório de Jerry. Claro que o pedido foi rejeitado.

Enquanto isso, eu estava trabalhando como assistente de pesquisa, primeiro com Pascal Haffter no Instituto Max Planck de Biologia do Desenvolvimento em T & # x000fcbingen comparando peixe-zebra sem cauda alelos que surgiram na tela T & # x000fcbingen (Odenthal et al, 1996), e depois com Josef Johannes no Instituto de Biologia Celular e Imunologia da Universidade de Stuttgart. Já tendo combinado uma data de início com Jerry, temia informá-lo da rejeição. A maneira mais rápida era enviar um fax da copiadora do campus e prometi me inscrever novamente para a próxima rodada de bolsas em 6 meses. Decepcionado e sem ideias melhores, continuei com telas da biblioteca de fagos para pescar UTRs 5 & # x02032 regulatórias potenciais de genes de interesse para o instituto de Stuttgart (Klein et al, 1998). O que eu não percebi foi que no mesmo dia que Jerry recebeu o fax, ele respondeu que eu deveria ir imediatamente, pois ele cobriria meu estipêndio até que uma bolsa chegasse. Jerry enviou esta mensagem por fax de retorno, para a copiadora do campus. Apenas 2 meses depois, recebi uma cópia do fax pelo correio, através de um dos meus árbitros de Munique, Walter Neupert, que foi contactado por Jerry e que o encaminhou para o meu endereço residencial em Bad Windsheim. De lá, meu pai finalmente enviou a carta para mim em Stuttgart. Em poucos dias, fiz as malas, comprei uma passagem de avião para Nova York e cheguei ao laboratório de Jerry.


Resultados

TOP2B interage com CTCF e o complexo de coesina

Em primeiro lugar, pretendemos caracterizar uma rede de interação proteína-proteína TOP2B. Topoisomerases são proteínas grandes e relativamente insolúveis [30] que apresentam desafios para a purificação de afinidade clássica. Para contornar esses problemas, empregamos BioID, uma abordagem de mapeamento de interação in vivo em que uma proteína isca de interesse é fundida a uma enzima biotina ligase modificada (BirA *) que leva à biotinilação covalente de proteínas em estreita proximidade com as proteínas expressas (Fig. . 1a). As proteínas biotiniladas podem ser recuperadas sob condições de lise e lavagem de alto rigor (detergentes, sal, cisalhamento de DNA) que normalmente não seriam compatíveis com a purificação nativa (Fig. 1a). BioID também fornece maior sensibilidade sobre purificações padrão, permitindo a recuperação de ambos os parceiros de interação física direta da proteína de interesse, bem como suas proteínas vicinais em células vivas e foi usado anteriormente para detectar novos complexos associados à cromatina [31, 32]).

TOP2B interactome. uma Visão geral do método BioID [31, 32]. Em BioID, mutado Escherichia coli biotina proteína ligase BirA * é fundida com a proteína de interesse (isca) resultando em biotinilação in vivo de proteínas proximais e interagentes da proteína isca. Após a lise celular, as proteínas biotiniladas são capturadas pela estreptavidina e identificadas por espectrometria de massa. b Parceiros de interação de alta confiança de TOP2B (n = 25, FDR ≤5%) são visualizados como uma rede exibindo as contagens espectrais médias de uma determinada proteína de presa. Proteínas de interação TOP2B conhecidas são mostradas em negrito. Proteínas do complexo de coesina (RAD21, NIPBL, PDS5A, PDS5B, STAG1, STAG2, SMC1A) e CTCF são indicadas. c Visualização da rede do mapa de enriquecimento de processos biológicos estatisticamente super-representados no interactome TOP2B (FDR q & lt0.05). Os nós na rede representam processos e caminhos enriquecidos que são agrupados de acordo com os temas funcionais predominantes. O tamanho do nó é proporcional ao número total de genes em cada conjunto de genes. Genes correspondentes a proteínas que interagem são mostrados

Realizamos BioID em células HeLa com uma proteína isca TOP2B marcada com uma etiqueta BirA * -FLAG N-terminal (n = 6). Os experimentos de controle envolveram células parentais (sem BirA *), uma BirA * -FLAG fundida com a proteína fluorescente verde (GFP-isca) e uma etiqueta BirA * -FLAG fundida com um sinal de localização nuclear (NLS-isca) (ver “Métodos” ) A espectrometria de massa revelou 737 proteínas com pelo menos dois peptídeos exclusivos para a isca TOP2B (arquivo adicional 1). Detectamos 25 parceiros de interação de alta confiança para TOP2B (taxa de descoberta falsa SAINT Bayesiana (FDR) ≤5%) Fig. 1b, Arquivo adicional 1).

Apoiando a sensibilidade do método BioID, recuperamos vários parceiros de interação conhecidos anteriormente de TOP2B: TOP2A forma heterodímeros ativos com TOP2B em células HeLa [33] TOP1 forma o complexo de síntese de DNA com TOP2B durante a replicação de DNA [34] CTCF foi anteriormente mostrado para interagir com TOP2B em linhas de células de câncer de mama humano [35] e ZNF451, um co-repressor transcricional Smad3 / 4 [36] que foi previamente co-purificado com TOP2B usando espectrometria de massa de purificação de afinidade em tandem [37]. Embora não tenhamos detectado interações significativas com HMGB1 (FDR = 17%) implicado na regulação da transcrição mediada por TOP2B [22], identificamos um grupo canônico de alta mobilidade (HMG) membro da família HMGA1 e uma proteína semelhante a HMG HDGF [38], bem como 19 novas proteínas de interação TOP2B adicionais (FDR ≤5% Fig. 1b). TOP2B é conhecido por se localizar no nucléolo [39] e nossos experimentos BioID revelaram novas interações de TOP2B com proteínas nucleolares conhecidas envolvidas na regulação do gene rDNA (DDX18, DDX31, SDAD1, RRP15). Também entre as novas interações TOP2B estavam várias subunidades de coesina (RAD21, STAG1, STAG2, SMC1A) e proteínas associadas à coesina (NIPBL, PDS5A, PDS5B Fig. 1b, c, Arquivo adicional 1). A especificidade do CTCF e enriquecimentos de coesina em TOP2B sobre os controles foram confirmados pela repetição da rotulagem de biotina e experimentos de captura seguidos por western blot usando anticorpos contra RAD21 e CTCF (arquivo adicional 2: Figura S1).

TOP2B está ligado a pontos críticos de controle do genoma

Para investigar se as interações físicas de TOP2B também são refletidas no nível genômico, traçamos o perfil de ocupação de DNA de TOP2B em células primárias de fígado de camundongo usando imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento de DNA (ChIP-seq). O fígado de camundongo é um tecido de expressão de TOP2B ideal para nossos experimentos in vivo, pois fornece uma fonte abundante e relativamente homogênea de células que não se dividem e é um modelo usado ativamente para a regulação de genes de mamíferos com uma grande variedade de conjuntos de dados genômicos funcionais disponíveis [40- 42] (Arquivo Adicional 2: Tabela S1 e Arquivo Adicional 3).

Como esperado, encontramos um enriquecimento da ligação de TOP2B nas regiões promotoras do gene (p & lt10-16, Fig. 2a) [20-22, 25, 43] e em genes altamente expressos (Fig. 2b). A ligação de TOP2B também coincidiu com marcas de histona de transcrição ativa (H3K4me3, H3K9ac) e potencializadores (H3K27ac, H3K4me1), bem como locais de ligação de fatores de transcrição específicos do fígado (TFs) FOXA1, ONECUT1, HNF1A, HNF4A e CEBPA (q & lt 10-3, Fig. 2c-e) [40, 41]. Apoiando a rede de interação de proteína proximal obtida a partir de células humanas, TOP2B co-localizado com sítios de ligação ChIP-seq para CTCF e subunidades de coesina RAD21, STAG1 e STAG2 no fígado de camundongo [40] (Fig. 2e).

Anotação genômica de sítios de ligação de TOP2B em fígado de camundongo. uma Distribuição em todo o genoma de sítios de ligação TOP2B em comparação com a distribuição geral de regiões genômicas de camundongo. As regiões promotoras foram definidas como 3 kb a montante do local de início da transcrição (TSS) a jusante é definido como 3 kb a partir do local de término da transcrição (TES). b Agregar densidade de leitura de ChIP-seq de fígado TOP2B (eixo x) através de genes expressos no fígado separados em categorias de alta, média e baixa expressão (eixo y) A densidade de leitura ChIP-seq é mostrada como leituras por milhão de leituras mapeadas (RPM). c Visualização do navegador do genoma para trilhas de sinal ChIP-seq para TOP2B e uma variedade de TFs enriquecidos com fígado, membros do complexo de coesina e modificações de histonas (eixo y, RPM). d Fração de picos para vários fatores que se sobrepõem aos picos TOP2B (barras vermelhas) (p valores & lt10 –16). e Agrupamento hierárquico de intensidades de ligação em todo o genoma (leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM)) para TOP2B e uma variedade de fatores. A intensidade da cor representa os coeficientes de correlação de Pearson em pares. linhas vermelhas indicam os grupos principais: regiões ativamente transcritas (ou seja, H3K36me3, H3K79me2), regiões arquitetônicas do genoma (ou seja, RAD21), intensificadores (ou seja, ONECUT1) e promotores (ou seja, H3K4me3). f TOP2B localiza-se em loci de rDNA no fígado de camundongo. o Painel superior mostra um representação esquemática de uma única repetição de rDNA de camundongo em relação ao local de início da transcrição da repetição de rDNA (eixo x baseado no GenBank BK000964). As contagens de leitura de seq de ChIP normalizadas de TOP2B, CTCF, RAD21, STAG1, STAG2 e H3K4me3 são mostradas no eixo y. Rastreamento de mapeamento de rDNA de Zentner GE et al. [78] é plotado como um mapa de calor abaixo das faixas do genoma com Preto representando bases que são 100% mapeáveis. O TSS é rotulado com um seta. As regiões de codificação 18S, 5.8S e 28S são mostradas como retângulos grandes. O espaçador transcrito externo (ETS), espaçador transcrito interno (ITS), promotor espaçador (SP), elemento de controle a montante (UCE) e elemento promotor de núcleo (CPE), são mostrados como retângulos estreitos. O espaçador intergênico (IGS) é mostrado como um linha fina

Para procurar evidências de interação de TOP2B em loci de rDNA, alinhamos os dados de TOP2B ChIP-seq a uma única repetição de rDNA de camundongo. Observamos uma localização clara de TOP2B na região do promotor do espaçador, bem como ao longo do comprimento da região transcrita do rDNA. No promotor espaçador, também detectamos uma sobreposição substancial de TOP2B, CTCF e membros do complexo de coesina (Fig. 2f).

Dada sua ampla correlação com várias marcas epigenéticas ativamente reguladas e locais de ligação de TF, perguntamos se a ocupação de TOP2B em promotores de genes, potencializadores e locais de CTCF geralmente reflete sua preferência de ligação por cromatina aberta. Usando dados de hipersensibilidade (DHS) de fígado de camundongo profundamente sequenciados [44], encontramos uma forte correlação da ligação de TOP2B e perfis de sinal de DHS (Spearman ρ = 0.8, p & lt10 –16 Fig. 3a, Arquivo adicional 2: Tabela S2). Essa correlação do sinal de DHS e TOP2B ChIP-seq foi mais forte do que a observada para qualquer um dos 20 fatores testados (Arquivo adicional 2: Tabela S2).

TOP2B interage preferencialmente com a cromatina aberta. uma Correlação das densidades de sinal de sequenciação de hipersensibilidade de TOP2B ChIP-seq e DNase I através do cromossomo 19 de camundongo (Spearman rho = 0,86). A densidade do gene e o conteúdo de GC também são mostrados. b Os perfis de ocupação do nucleossomo para todos os picos TOP2B e CTCF (Todos) centrados na cúpula do pico são mostrados para proximal (≤1 kb de TSS, linhas vermelhas) e picos distais (& gt1 kb de TSS, linhas azuis) Perfis para picos TOP2B que não se sobrepõem aos picos CTCF (sem CTCF), picos CTCF que não se sobrepõem aos picos TOP2B (sem TOP2B), picos TOP2B e CTCF que não se sobrepõem aos picos RAD21 (sem RAD21). c Descoberta de motivo de novo usando todos os picos TOP2B (50 bp a montante / a jusante da cimeira) e picos TOP2B que não se sobrepõem aos picos CTCF. d Visualização do navegador do genoma de exemplos de regiões ligadas ao CTCF que mostram tendência específica de alelo para o genoma C57BL / 6J (painel esquerdo) e genoma A / J (painel direito) (eixo y, número de leituras alélicas). e Correlação de frequências de alelos C57BL / 6J para CTCF (eixo x) versus TOP2B (eixo y) em regiões coocupadas TOP2B / CTCF. f TOP2B (azul) e CTCF (vermelho) Frequências de alelos C57BL / 6J (azul) nas regiões coocupadas TOP2B / CTCF, categorizadas com base na preferência de ligação alélica CTCF (consulte “Métodos”). C57 & gt A / J indica locais com preferência de CTCF para o alelo C57BL / 6J, A / J & gt C57 indica preferência para o alelo A / J e C57

A / J indica locais sem viés específico de alélico significativo. As frequências alélicas TOP2B para os locais de ligação CTCF enriquecidos com C57BL / 6J e A / J foram significativamente diferentes das frequências alélicas TOP2B em C57

Categoria A / J (p & lt10 -6 teste unilateral da soma de postos de Wilcoxon)

Consistente com sua preferência por regiões DHS, descobrimos que a ocupação de TOP2B é enriquecida em regiões livres de nucleossomos delineadas por experimentos MNase-seq realizados em fígado de camundongo [45]. Especificamente, o posicionamento do nucleossomo em relação aos picos TOP2B encontrados nos promotores proximais (& lt1 kb do TSS mais próximo) é semelhante ao que observamos para vários TFs (Fig. 3b, Arquivo adicional 2: Figura S2). Em cúpulas distais de ligação TOP2B (& gt1 kb do TSS mais próximo), encontramos um padrão de ocupação de nucleossomo periódico que se assemelhava muito aos perfis de nucleossomo em torno das cúpulas CTCF e RAD21 (Fig. 3b, Arquivo adicional 2: Figura S2). Como o CTCF influencia fortemente o posicionamento do nucleossomo [46, 47], analisamos o posicionamento do nucleossomo em torno dos picos distais do pico do CTCF que não se sobrepõem aos picos TOP2B. A amplitude da ocupação periódica do nucleossomo em torno desses locais CTCF não TOP2B foi claramente reduzida, sugerindo que a ocupação TOP2B é uma característica bioquímica dos locais de ligação do CTCF que mostram um forte posicionamento nucleossômico (Fig. 3b).

A ocupação do DNA TOP2B é influenciada pela ligação ao TF

Em seguida, caracterizamos as propriedades de sequência de regiões ligadas a TOP2B usando a descoberta de motivo de novo (consulte "Métodos"). O motivo mais abundante recuperado se assemelhava muito ao motivo CTCF e foi identificado em

17% dos sítios de ligação TOP2B (Fig. 3c, Arquivo adicional 4).Dois estudos recentes também identificaram um enriquecimento de motivos CTCF em sítios de ligação TOP2B em neurônios de camundongo [23] e em células MCF7 humanas [48] demonstrando que motivos CTCF são uma característica comum das regiões ocupadas por TOP2B em vários tecidos. Além disso, repetimos a descoberta do motivo de novo após excluir os locais de ligação conjunta de TOP2B e CTCF. Também recuperamos motivos semelhantes aos fatores de tecido enriquecido HNF4A e CEBPA, bem como ESR1 que foi relatado anteriormente como sendo enriquecido em dados MCF7 TOP2B ChIP-seq [48]. Esses dados mostram coletivamente que os motivos dos TFs enriquecidos com tecido também são uma característica comum da ligação TOP2B (Fig. 3c, Arquivo adicional 4).

Para obter um insight sobre se as mudanças na sequência específica de TF se correlacionam com a ligação de TOP2B, analisamos a ligação específica de alelo de CTCF, HNF4A e TOP2B obtida a partir de experimentos ChIP-seq em fígados de camundongos F1 (C57BL6 / J fêmea × A / J masculino) (Fig. 3d). Descobrimos que a proporção de leituras de CHIP-seq TOP2B específicas de alelo (mostrada como frequência do alelo C57BL6 / J) se correlaciona com a proporção de leituras de ChIP-seq de CTCF específicas de alelo (r = 0.403, p & lt10 -16) (Fig. 3e). Identificamos 495 locais co-ligados de CTCF / TOP2B com viés específico de alelo significativo de leituras de CTCF (binomial p valor & lt0,05, consulte “Métodos” para obter detalhes) (Fig. 3f). Nestes locais, TOP2B e CTCF mostraram preferência para o mesmo alelo e as razões alélicas de leituras de CTCF e TOP2B ChIP-seq foram significativamente distorcidas em comparação com locais CTCF / TOP2B sem ligação CTCF específica de alelo (p & lt10-16, teste unilateral da soma de postos de Wilcoxon Fig. 3f). Da mesma forma, a especificidade do alelo de TOP2B e HNF4A também foi correlacionada em locais ligados a HNF4A / TOP2B (r = 0.546, p & lt10 –16) (Arquivo adicional 2: Figura S3). Em resumo, embora TOP2B tenha sido sugerido anteriormente ter um motivo de ligação ao DNA [49], em vez disso, propomos um modelo onde TOP2B interage com o DNA que está ativamente ligado por uma variedade de TFs específicos de sequência sem a necessidade de sequências de reconhecimento de motivo específicas.

TOP2B co-localiza com sítios de ligação CTCF / coesina evolutivamente conservados

Para investigar se os locais de CTCF e coesina ocupados por TOP2B possuem características bioquímicas e evolutivas únicas, primeiro exploramos a co-ocupação genômica dessas proteínas. TOP2B foi encontrado em aproximadamente metade dos sites CTCF / RAD21 (20.251 sites triplos TOP2B, CTCF e RAD21 versus 20.057 sites duplos CTCF / RAD21 (Fig. 4a). Em contraste, identificamos apenas 393 sites TOP2B / CTCF, indicando que TOP2B / As interações CTCF ocorrem quase exclusivamente no contexto de ocupação de coesina.

Características genômicas da ligação combinatória de TOP2B, CTCF e RAD21. uma A sobreposição das regiões de ligação TOP2B, CTCF e RAD21 ChIP-seq define sete categorias diferentes de picos. b Comparação de leituras de CTCF, RAD21 e TOP2B ChIP-seq (RPKM) para cada uma das categorias definidas em (uma) Outliers (& gt95º percentil) não são mostrados. c Análise de pan-tecido de ligação de CTCF para locais triplos (Preto), sites duplos (cinza escuro), e sites apenas CTCF (Branco). d Restrição de sequência de DNA de triplo (Preto), Duplo (verde), e sites apenas CTCF (amarelo) conforme determinado pela pontuação média do GERP (eixo y) Os picos de CTCF foram orientados com base na direção do motivo CTCF (é mostrada a orientação rica em G). e Comparação entre espécies de rato triplo (n = 20.381), duplo (n = 20.049), e sites apenas CTCF (n = 8301) com picos de CTCF ChIP-seq mapeados em humanos, macacos, ratos e cães. Gráficos de barras empilhadas mostram a proporção de picos com base no grau de conservação (apenas camundongo, apenas camundongo e rato e camundongo mais um não roedor (além de roedores)). f Conservação de triplo de camundongo (n = 1329), duplo (n = 6582), e singleton (n = 2957) locais CTCF que contêm elementos B2 SINE específicos de roedores

A fim de obter informações sobre as propriedades funcionais transmitidas direta ou indiretamente pela ocupação de TOP2B em locais de CTCF / coesina, comparamos várias características genômicas entre TOP2B / CTCF / RAD21 "locais triplos" e "locais duplos" de CTCF / RAD21. Os locais triplos têm sinal de CTCF e RAD21 ChIP significativamente mais alto em comparação com os locais duplos CTCF / RAD21 (alteração de dobra & gt2, teste de soma de classificação de Wilcoxon unilateral, p & lt10 -16 Fig. 4b). Os locais triplos também são mais propensos a serem ocupados por CTCF em vários tecidos. Por exemplo, 68% dos locais triplos se sobrepõem aos locais de ligação de CTCF compartilhados em sete ou mais tecidos [41], em contraste com apenas 37% dos locais duplos de CTCF / RAD21 (p & lt10 -16, teste exato de Fisher unilateral Fig. 4c).

A conservação evolutiva de regiões reguladoras de genes é freqüentemente usada como um substituto para a importância funcional. Perguntamos se os locais CTCF classificados como locais triplos em camundongos eram mais conservados evolutivamente do que os locais duplos CTCF / RAD21. Usando o perfil de taxa evolutiva genômica (GERP) [50] para medir a restrição de DNA, descobrimos que os locais triplos eram mais conservados do que os locais duplos do CTCF / RAD21 (Fig. 4d). Confirmamos que o pico de restrição de DNA sobre a região a montante do motivo central CTCF corresponde ao motivo CTCF a montante previamente descrito [42, 51]. Descobrimos que o motivo upstream está presente em uma minoria (

13%) de nossos picos de CTCF, o que é consistente com os resultados relatados anteriormente [42, 51]. Observamos que o “núcleo + motivo CTCF a montante"Contendo locais triplos tem um aumento claro na restrição de DNA na localização do motivo a montante em comparação com o"Motivo central CTCF apenas”Sites triplos (arquivo adicional 2: Figura S4a). Também observamos que os locais de ligação de HNF4A que co-ocorrem com os locais de ligação de TOP2B mostram maior sinal de ChIP-seq e restrição de DNA do que locais sem ligação de TOP2B (arquivo adicional 2: Figura S4b-d).

Em seguida, perguntamos se a ligação de TOP2B em sítios de ligação de CTCF / RAD21 corresponde a sítios de CTCF ortólogos compartilhados usando dados de CTCF ChIP-seq previamente verificados para tecido de fígado humano, macaco, rato e cão [42]. Descobrimos que 45% dos picos de CTCF em locais triplos foram compartilhados em pelo menos uma espécie não roedora (consulte "Métodos") em contraste com 21% dos locais duplos de CTCF / RAD21 (teste exato de Fisher, p & lt10 –16 Fig. 4e Arquivo adicional 2: Tabela S3). Além disso, também descobrimos que os locais co-ligados de HNF4A / TOP2B de camundongo são mais propensos a serem compartilhados em uma espécie não roedora em comparação com locais apenas de HNF4A (26% e 11%, respectivamente, teste exato de Fisher, p & lt10 –16 Arquivo adicional 2: Tabela S4 Arquivo adicional 2: Figura S4e).

Uma vez que as sequências B2 SINE (Short Interspersed Element) transponíveis específicas de roedores são uma fonte de sítios de ligação CTCF específicos de linhagem em genomas de roedores [42, 52], perguntamos se a ligação TOP2B é enriquecida para eventos de ligação CTCF recentemente evoluídos derivados de elementos B2 que têm foi fixado na linhagem do roedor. Na verdade, descobrimos que os locais CTCF derivados de SINE B2 que ocorrem no contexto de locais triplos eram mais propensos a serem compartilhados entre camundongos e ratos (42%) em comparação com locais duplos de CTCF / RAD21 (26%) (teste exato de Fisher, p & lt10 -16 Fig. 4f Arquivo adicional 2: Tabela S3). Assim, a ocupação genômica TOP2B parece ser uma característica distintiva de eventos de ligação TF funcionalmente relevantes.

TOP2B e RAD21 são espacialmente organizados em torno dos picos CTCF

O CTCF se liga a um motivo de DNA assimétrico com atividades dependentes de orientação [40, 53-56]. Para investigar a ligação de TOP2B e RAD21 em relação ao CTCF, caracterizamos a ordem relativa dos sítios de ligação de TOP2B, CTCF e RAD21 ChIP-seq em uma região de ± 100 bp em torno do motivo CTCF. Os picos de pico foram usados ​​como proxies para os locais de ligação e as distâncias genômicas entre os locais de ligação e o centro do motivo CTCF foram calculadas, corrigindo a orientação do motivo (Fig. 5a). Descobrimos que TOP2B e RAD21 foram espacialmente organizados em lados opostos do motivo de ligação CTCF rico em G. O TOP2B foi posicionado a 5 ′ do motivo, com a distância mediana ao centro do motivo sendo 15 bp, e o RAD21 foi posicionado a 3 ′ do centro do motivo, com uma distância mediana de 12 bp. Esta organização espacial foi aparente na maioria dos sites triplos (53,6%, p & lt10 -16, teste exato de Fisher) (Fig. 5b Fig. 5c). Esta ordem também é verdadeira ao examinar a ligação de outras subunidades do complexo de coesina, STAG1 e STAG2 (arquivo adicional 2: Figura S5a, b). Além disso, o motivo de YY1 [57], um cofator estabelecido de CTCF [58], e uma de nossas proteínas de interação TOP2B significativas (Fig. 1b) foi encontrado 3 ′ do motivo CTCF rico em G (arquivo adicional 2: Figura S5c). Em contraste, nenhum desvio de orientação significativo foi aparente na ligação de TOP2B e RAD21 em torno do motivo de ligação de HNF4A (arquivo adicional 2: Figura S5d).

A ligação TOP2B, CTCF e RAD21 é organizada espacialmente. uma Distribuição de cúpulas de pico TOP2B, CTCF e RAD21 ChIP-seq em relação ao centro do motivo central CTCF (flecha Negra) Distribuições antes de (deixou) e depois (direito) ordenando os picos CTCF de acordo com a orientação do motivo CTCF são mostrados e são significativamente diferentes (p valor & lt10 –16). b Número de locais triplos com diferentes ordens de ligação TOP2B / CTCF / RAD21 em relação ao centro do motivo CTCF. As contagens são mostradas antes e depois de contabilizar a orientação do motivo CTCF. c Rastreamentos do navegador do genoma mostrando o sinal ChIP-seq de TOP2B, CTCF e RAD21 em duas regiões de exemplo nos cromossomos 16 e 3. O faixa superior mostra a localização do motivo central CTCF, com a direção indicada por setas brancas. Barras pretas acima das trilhas de sinal de seq do ChIP indicam os locais de pico com o linhas amarelas mostrando a localização dos picos do pico. d Visão geral do ChIP-exo. Após a imunoprecipitação da cromatina da cromatina reticulada e sonicada, o tratamento com exonuclease lambda digere seletivamente a fita 5'-fosforilada do dsDNA. A digestão resultante deixa pegadas específicas da cadeia da proteína ligada (denominada TF no desenho). O sequenciamento de DNA desses fragmentos ChIP-exo pode revelar a fronteira de onde o DNA foi protegido pela proteína ligada. Os resultados ChIP-exo podem ser visualizados contando os acúmulos das extremidades 5 ′ das leituras de sequência de DNA (rotulamos a fita direta azul e a fita reversa vermelho). e Perfis de sinal de proteção ChIP-exo para experimentos CTCF, RAD21 e TOP2B ChIP-exo e DNase-seq (DGF). Números médios de 5 ′ nucleotídeos de leituras ChIP-exo (azul: vertente para a frente vermelho: fita reversa) são plotados separadamente para sites CTCF triplos, duplos e singleton em cada par de bases (+/– 50 bp) em relação ao centro do motivo central de CTCF. O número de regiões usadas para gerar cada gráfico é rotulado no canto superior direito. A posição relativa do motivo central CTCF é mostrada

Para determinar a organização espacial precisa de locais triplos, realizamos experimentos ChIP-exo [59] para TOP2B, CTCF e RAD21 em células de fígado de camundongo (Fig. 5d, e). O ChIP-exo recuperou a maioria dos picos de CTCF identificados com ChIP-seq (76%) (Arquivo adicional 2: Figura S6a). ChIP-exo para TOP2B e RAD21 recuperou menos regiões de pico do que foi obtido por ChIP-seq (16% e 17%, respectivamente (Arquivo adicional 2: Figura S6a)), como seria esperado para fatores que não se ligam a motivos de DNA específicos . É importante ressaltar que a maioria dos picos identificados de TOP2B e RAD21 ChIP-exo se sobrepuseram aos picos de CTCF ChIP-exo (82% e 92%, respectivamente) (Arquivo adicional 2: Figura S6b).

A fim de obter informações sobre o sinal de proteção de exonuclease de TOP2B e RAD21 em relação ao motivo CTCF na resolução de par de base única, traçamos um número médio de 5 ′ nucleotídeos de leituras ChIP-exo alinhadas a cada par de bases em torno de motivos CTCF orientados (Fig . 5e). Analisamos sinais ChIP-exo separadamente em locais duplos CTCF / RAD21 e locais apenas CTCF. Devido à correlação que observamos para a ligação de TOP2B e o sinal de hipersensibilidade à DNase I, também traçamos o sinal da DNase I do fígado de camundongo [41] ao lado de nossos dados ChIP-exo. Recapitulamos padrões de proteção de exo-nuclease conhecidos para CTCF [51]. Também detectamos padrões distintos para TOP2B e RAD21. Em relação aos locais triplos, os locais duplos RAD21 / CTCF e locais apenas CTCF mostraram menos sinal de proteção de exo-nuclease e menos sinal de hipersensibilidade à DNase I. É importante ressaltar que os perfis de proteção CTCF ChIP-exo podem ser vistos em nossos perfis de proteção TOP2B ChIP-exo e RAD21 ChIP-exo. Estes resultados indicam que, semelhante ao que foi relatado para CTCF e interações de coesina [60], TOP2B pode se ligar diretamente com DNA e também fazer ligações cruzadas com CTCF ligado a DNA.

Nosso sinal de proteção ChIP-exo confirmou ainda a ligação específica de orientação de RAD21 e TOP2B em relação ao CTCF (Fig. 5e). Especificamente, o ChIP-exo para RAD21 mostrou proteção de exonuclease nas posições +13 a +26 (13-26 bp a jusante) do centro do motivo central CTCF (Fig. 5e). TOP2B ChIP-exo revelou um sinal de proteção dentro das posições –13 a –27 (13–27 bp a montante) do centro do motivo central CTCF. Este sinal de proteção ChIP-exo TOP2B foi observado principalmente na fita reversa diretamente adjacente ao local de clivagem de DNase I relatado anteriormente, localizado em –12 a –13 do centro do motivo central CTCF que ocorre na fita positiva (Fig. 5e [61 ]). Isso levanta a possibilidade de que a ligação de CTCF promova interações específicas da fita de DNA para as enzimas TOP2B e DNase I.

Uma vez que o sinal de proteção TOP2B ChIP-exo se sobrepõe à localização do motivo CTCF upstream, que pode ser vinculado por dedos de zinco CTCF 9-11 [51], perguntamos se a presença do motivo upstream CTCF resultaria em um CHIP- TOP2B distinto sinal de proteção exo. Descobrimos que o motivo upstream está presente em uma minoria (

13%) de nossos picos de CTCF, o que é consistente com os resultados relatados anteriormente [42, 51]. Nosso perfil CTCF ChIP-exo dentro do “núcleo mais o motivo CTCF a montante”Picos mostraram o aumento relatado anteriormente no sinal de proteção ChIP-exo nas posições –16 (fita reversa) e –25 (fita direta) [51] (Arquivo adicional 2: Figura S7). Também observamos a diminuição relatada anteriormente no sinal de DNase I na posição -17 [61]. Curiosamente, descobrimos que o sinal de proteção TOP2B ChIP-exo que observamos usando todos os picos de CTCF (entre as posições –13 e –27) foi menos pronunciado dentro do “núcleo mais o motivo CTCF a montante”Picos (arquivo adicional 2: Figura S7). Uma exceção notável foi o aumento específico nos sinais na posição –16 (fita reversa) e na posição –25 (fita direta), ambas as quais correspondem ao sinal de proteção CTCF aprimorado observado quando o motivo a montante está presente. No geral, esta análise confirma a associação próxima entre TOP2B e CTCF e levanta a possibilidade de que as interações TOP2B-DNA sejam afetadas pela ligação dos dedos de zinco CTCF 9-11 ao motivo CTCF a montante.

Sítios triplos são enriquecidos nas bordas do domínio cromossômico

As proteínas CTCF e coesina são os principais componentes arquitetônicos do genoma que ancoram as interações de longo alcance que estruturam os domínios cromossômicos [62-64]. Comparações de várias espécies da estrutura cromossômica identificaram um enriquecimento de sítios de ligação de CTCF evolutivamente conservados nas bordas do domínio cromossômico [56]. Dada a nossa observação de que TOP2B co-localiza com CTCF e coesina em uma orientação específica, perguntamos se os locais triplos são enriquecidos nos limites dos domínios cromossômicos específicos da orientação.

Usando conjuntos de dados Hi-C de fígado de camundongo publicados recentemente [56], estudamos perfis de isolamento de contato [62] centralizados em locais triplos e os comparamos com locais duplos de CTCF / RAD21. Os locais triplos foram significativamente associados aos limites do domínio cromossômico em grande escala em comparação com os locais CTCF / RAD21 que não tinham ligação a TOP2B (Fig. 6a). Medimos o isolamento de contato médio em locais triplos de acordo com os dados Hi-C e observamos um forte esgotamento dos contatos nesses locais em múltiplas escalas genômicas, apoiando ainda mais sua localização entre dois loops de grande escala (Fig. 6b). De acordo com nossas descobertas nos sites triplos TOP2B / CTCF / RAD21 dos experimentos ChIP-seq e ChIP-exo, os locais triplos mostraram um nível mais alto de isolamento de contato em comparação com locais duplos, embora os padrões de isolamento de contato para locais triplos e duplos fossem semelhantes .

Relação entre sites TOP2B / CTCF / RAD21 e estrutura Hi-C. uma Os locais co-ligados TOP2B, CTCF e RAD21 localizam-se nas bordas do domínio cromossômico. Trilhas ChIP-seq para TOP2B, CTCF e RAD21, bem como sítios de ligação classificados como co-ocupados para todas as três proteínas são mostrados ao lado de uma matriz Hi-C de interações intracromossômicas do fígado de camundongo em uma região de exemplo no cromossomo 1 (painel esquerdo) A posição relativa em todo o genoma dos locais triplos TOP2B / CTCF / RAD21 (azul) e locais duplos CTCF / RAD21 (vermelho) em domínios Hi-C de mouse (painel direito). b Perfis médios de isolamento de contato de locais CTCF / RAD21 com (painéis superiores) e sem (painéis inferiores) TOP2B em dados Hi-C do mouse. Os perfis também são mostrados após a separação com base na orientação do motivo CTCF no genoma (últimas duas colunas, o motivo CTCF é mostrado acima da coluna correspondente). c Os locais de ligação classificados como co-ocupados para TOP2B / CTCF / RAD21 são mostrados após a separação com base na orientação do motivo CTCF (orientação rica em G, "- fita", azul claro Orientação rica em C, “+ vertente,” azul escuro) em relação a um exemplo de região Hi-C no cromossomo 12 (painel esquerdo) Análise de todo o genoma de locais co-ocupados, separados com base na orientação do motivo CTCF e sua posição relativa dentro dos domínios (painel direito) Perfis ChIP-exo centrados em motivos CTCF em locais próximos às fronteiras do domínio (dentro de 10% do tamanho total do domínio) também são mostrados

Consistente com outros relatórios [54, 56], encontramos um forte enriquecimento da ligação de CTCF à orientação do motivo rico em G no limite 5 'dos ​​domínios e uma abundância correspondente de ligação do CTCF à orientação do motivo rico em C no 3' limite (Fig. 6c). Junto com nossos dados ChIP-seq e Chip-exo, isso aponta para organizações sequenciais opostas de sites TOP2B-CTCF-RAD21 nas duas bordas dos domínios cromossômicos com TOP2B posicionado externo e coesina interna ao loop de domínio, que pode estar envolvida no formação e manutenção de estruturas de cromatina em grande escala. Dada a localização proeminente da ligação de TOP2B em locais de limite de domínio CTCF / coesina, propomos que, semelhante à sua função conhecida em promotores de genes, TOP2B também ajuda a resolver restrições topológicas em torno dos principais blocos de construção arquitetônicos do genoma.

As proteínas TOP2 facilitam o superenrolamento nos locais de ligação do CTCF

Para testar a possibilidade de que as proteínas TOP2 estejam envolvidas no superenrolamento em sítios CTCF, reanalisamos os dados do domínio de superenrolamento de Naughton et al. [65]. Naughton et al. usaram a incorporação de TMP biotinilado (bTMP) no DNA de células epiteliais de pigmento da retina humana para mostrar que o superenrolamento de todo o cromossomo, e mais especificamente o superenrolamento em TSS, requer a atividade da RNA polimerase II, bem como das proteínas topoisomerase I e II [65].Depois de recapitular esses resultados no TSS (arquivo adicional 2: Figura S8), perguntamos se o superenrolamento em locais CTCF também requeria a polimerase II de RNA e as proteínas TOP2. Na verdade, descobrimos que o superenrolamento de DNA em locais CTCF foi: (1) perdido após o tratamento com o inibidor de RNA polimerase II alfa-amanitina (Fig. 7a) (2) é reduzido na presença de TOP2 (ICRF-193) ou TOP1 ( inibidores da campotecina) (Fig. 7b) e (3) não são afetados pela inibição da topoisomerase quando a transcrição é inibida simultaneamente (Fig. 7c). Em contraste, nenhum padrão específico de superenrolamento foi observado em intervalos genômicos selecionados aleatoriamente (Fig. 7, linhas tracejadas). Embora os venenos de TOP2 afetem TOP2B e TOP2A, esta análise, junto com a associação próxima de TOP2B com CTCF, levanta a possibilidade de que TOP2B pode facilitar a remodelação de superenrolamento de DNA em locais de CTCF.

Superenrolamento de DNA em torno dos locais de ligação do CTCF. uma Comparação do superenovelamento do DNA em torno dos locais de ligação do CTCF em células epiteliais pigmentares da retina humana não tratadas (RPE-1), após 5 h de inibição da RNA polimerase com alfa-amanitina e após 2 h de recuperação da inibição. b Alterações no superenrolamento do DNA após 5 horas de tratamento com o inibidor de TOP2 ICRF-193 ou o inibidor de TOP1 camptotecina em comparação com células RPE-1 não tratadas. c Superenrolamento de DNA em torno dos locais CTCF após inibição simultânea da transcrição e topoisomerases em células RPE-1. A direção do motivo CTCF é indicada pelo seta. O sinal em intervalos genômicos gerados aleatoriamente é mostrado como linhas tracejadas e comparado com o sinal observado (Linhas sólidas), tudo p os valores são & lt10 –16 (teste de Kolmogorov – Smirnov). Os dados e métodos usados ​​para gerar esta análise original foram publicados anteriormente por Naughton et al. [65]


Condensinas e coesinas no contexto genômico de cis-tethering

Condensinas na compactação do cromossomo durante a mitose

Historicamente, as características definidoras das células mitóticas incluíam compactação cromossômica seguida pela segregação dos cromossomos em células-filhas recém-formadas. O papel da condensina na compactação da cromatina e a resolução da cromátide irmã estão bem estabelecidos (revisado em Kakui e Uhlmann, 2018 Kinoshita e Hirano, 2017 Kalitsis et al., 2017), mas estudos mais recentes distinguem entre as atividades da condensina I e II. Para avaliar as mudanças na arquitetura do cromossomo à medida que as células progridem da interfase tardia para a mitose, um estudo recente manipulou o regulador do ciclo celular quinase dependente de ciclina 1 (CDK1) em linfoblastos de galinha DT40 células para produzir um G altamente sincronizado2 estado do ciclo celular (Gibcus et al., 2018). Após a liberação da parada de interfase tardia, Hi-C (sequenciamento de alto rendimento) e modelagem baseada em computador revelaram que as estruturas típicas do genoma da interfase desapareceram rapidamente (ver 'coesinas na arquitetura nuclear durante a interfase' abaixo). Em seu lugar, o DNA formou uma estrutura helicoidal central, a partir da qual apareceram grandes voltas regularmente espaçadas (Fig. 3). No final da prófase, o andaime helicoidal tornou-se mais comprimido e as alças de DNA aumentaram de tamanho (Gibcus et al., 2018). Condensina I é excluída dos cromossomos até a prometáfase após a quebra do envelope nuclear (Walther et al., 2018), um achado que está em forte concordância com estudos anteriores (Hirota et al., 2004 Ono et al., 2004, 2017 Gerlich et al. , 2006). Assim, a condensina II é o driver predominante da compactação inicial descrita acima que ocorre durante a prófase. Durante a prometáfase, loops menores (40-60 kb de tamanho) se formam, aninhados dentro da matriz helicoidal de loops maiores (200-400 kb de tamanho) (Gibcus et al., 2018) (Fig. 3). Imagens de depleção de emissão estimulada por super-resolução (STED) em células prometáfase HeLa confirmaram que a condensina II está restrita ao eixo longitudinal central dos braços do cromossomo, enquanto a condensina I ocupa um volume mais distal e significativamente mais amplo do cromossomo (Walther et al., 2018 ) A depleção individual da condensina II ou condensina I resultou na perda direcionada das respectivas alças, consistente com um modelo de que a condensina II promove a formação de alças de andaime iniciais, enquanto a condensina I promove a formação de alças aninhadas subsequentes (Gibcus et al., 2018). Mesmo que a coesina e a condensina sejam representadas individualmente na levedura, a distribuição espacial é mantida em que as coesinas formam um barril que envolve as condensinas alinhadas ao longo do eixo do fuso (ver Bloom, 2014).

A compactação cromossômica regulada pelo ciclo celular por recrutamento sequencial de condensinas II e I promove a formação de loops aninhados. As cromátides irmãs replicadas são unidas por coesinas (vermelho). Durante a prófase, a condensina II (azul) se liga ao DNA e expulsa loops. Após a quebra do envelope nuclear (NEB), a condensina I (verde) se liga ao DNA em loop e forma novos loops que são aninhados dentro dos loops gerados pela condensina II. À medida que as células progridem para a prometáfase tardia, a extrusão da alça de DNA e a compressão da estrutura helicoidal continuam. Não é mostrado o papel da coesina na geração ciscom base na compactação, que também promove a condensação dos cromossomos.

A compactação cromossômica regulada pelo ciclo celular por recrutamento sequencial de condensinas II e I promove a formação de loops aninhados. As cromátides irmãs replicadas são unidas por coesinas (vermelho). Durante a prófase, a condensina II (azul) se liga ao DNA e expulsa loops. Após a quebra do envelope nuclear (NEB), a condensina I (verde) se liga ao DNA em loop e forma novos loops que são aninhados dentro dos loops gerados pela condensina II. À medida que as células progridem para a prometáfase tardia, a extrusão da alça de DNA e a compressão da estrutura helicoidal continuam. Não é mostrado o papel da coesina na geração ciscom base na compactação, que também promove a condensação dos cromossomos.

Coesinas na arquitetura nuclear durante a interfase

Embora as coesinas sejam normalmente discutidas em relação ao seu papel no trans- amarração necessária para a segregação cromátide irmã durante a mitose (revisado em Rudra e Skibbens, 2013 Jeppsson et al., 2014 Marston, 2014 Morales e Losada, 2018), estudos pioneiros em leveduras e Drosófila estabeleceu dois papéis adicionais para coesinas. O primeiro é que as coesinas suportam cisDNA baseado em looping, de modo que as mutações da coesina produzem defeitos dramáticos de condensação cromossômica (Guacci et al., 1997). A segunda é que as coesinas (e reguladores de coesina) são necessários para a regulação da transcrição e facilitam (via DNA looping) a comunicação entre os elementos reguladores distais do DNA, como potenciadores e promotores (Rollins et al., 1999). Juntos, esses estudos formam a base dos modelos atuais nos quais as coesinas geram estruturas de cromatina de ordem superior que são críticas para a regulação da transcrição. Não surpreendentemente, as vias da coesina são críticas para o desenvolvimento humano e as mutações podem ter efeitos devastadores. A síndrome de Robert (RBS) e a síndrome Cornelia de Lange (CdLS) são dois transtornos de desenvolvimento baseados na coesina que exibem um conjunto de defeitos de desenvolvimento sobrepostos que incluem fenda palatina, microcefalia, redução profunda de membros, sindactilia e, frequentemente, comprometimento cognitivo agudo (Krantz et al., 2004 Tonkin et al., 2004 Gillis et al., 2004 Schüle et al., 2005 Musio et al., 2006 Deardorff et al., 2007 Deardorff et al., 2012a, b Vega et al., 2005). Dada a gama de tecidos afetados pela mutação da coesina e o efeito em todo o genoma que as coesinas exercem na transcrição do gene (ver abaixo), deve-se antecipar que o número de doenças relacionadas à coesina ou coesinopatias (mais recentemente chamadas de transcriptomopatias e que incluem ribossomopatias) aumentará significativamente ao longo do tempo (Wendt et al., 2008 Xu et al., 2014 Yuan et al., 2015 Skibbens et al., 2013 Banerji et al., 2017a).

Associando domínios e compartimentos topologicamente

As coesinas organizam o genoma da interfase equilibrando a formação dinâmica de dois estados opostos, denominados domínios de associação topológica (TADs) e compartimentos, que são o yin e o yang arquitetônicos da regulação da transcrição. Aqui, eu defino um TAD como uma alça de DNA de até uma megabase de DNA e na qual a base da alça está associada ao repressor de transcrição de ligação CCCTC isolante (CTCF) e coesina (Fig. 4). É tentador especular que a base do TAD isola o DNA em loop e não em loop da transcrição e dos fatores de remodelação da cromatina que migram ao longo do DNA. Em termos de biologia do genoma, o termo compartimento é definido de forma restrita: os compartimentos não são amarrados, mas os domínios de autointeração de estados de cromatina transcricionalmente ativos (domínios abertos ou A) ou reprimidos (domínios fechados ou B) podem conter 5 a 50 megabases de DNA (Lieberman-Aiden et al., 2009 Schwarzer et al., 2017 Gassler et al., 2017 Rao et al., 2017 Haarhuis et al., 2017 Plys e Kingston, 2018). A coalescência do DNA genômico em compartimentos provavelmente ocorre por meio do agrupamento de domínios de baixa complexidade e / ou intrinsecamente desordenados em proteínas de ligação ao DNA que se automontam em fases líquido-líquido semelhantes a gotículas de óleo que se agregam na superfície da água. Esta é uma analogia um pouco extrema, no entanto, em que os compartimentos de DNA autoformado são muito mais miscíveis e dinâmicos em suas associações (Fig. 4). O agrupamento também pode ser conduzido por modificações que exibem propriedades semelhantes que ocorrem em histonas e fatores de transcrição (Schwarzer et al., 2017 Rao et al., 2017 Haarhuis et al., 2017 Plys e Kingston, 2018). Os compartimentos são dinâmicos e móveis, mas podem ficar ancorados, portanto, os compartimentos B reprimidos aparecem mais periféricos no núcleo e podem interagir com a lâmina nuclear, enquanto os compartimentos A ativos são posicionados mais centralmente (Hansen et al., 2018 Lieberman-Aiden et al., 2009).

Papéis opostos para a coesina na regulação da transcrição. (A) TADs são grandes loops de DNA que são definidos pela persistência de coesina (vermelho) e CTCF (triângulo azul) na base do loop. A extrusão da alça de DNA mediada pela coesina ocorre até que a coesão encontre isoladores CTCF ao longo do genoma. O CTCF liga-se a motivos de DNA de forma assimétrica, de modo que as alças TAD são tipicamente flanqueadas por locais convergentes de CTCF. Observe que as coesinas podem conectar TADs (dentro e através dos cromossomos) para definir ou isolar sequências de remodeladores de cromatina ou fatores de transcrição que se movem ao longo do DNA. (B) Os compartimentos são regiões untethered de DNA (isto é, ligação de coesina reduzida) que coalescem através de agrupamento de proteínas contendo domínio de baixa complexidade (intrinsecamente desordenado) e agregação de fatores (tais como histona e complexos de transcrição) que apresentam modificações semelhantes. Os compartimentos são divididos em estados A (induzido, verde) e B (reprimido, vermelho). A coesina promove a formação de TAD, mas as alças restritas que ela forma antagonizam a formação de compartimentos - portanto, a predominância de TADs e compartimentos depende em grande parte da deposição ou liberação de coesina. (C) As coesinas também regulam os efeitos específicos do gene na transcrição. É mostrado aqui um modelo especulativo através do qual o looping de DNA dependente de coesina (em uma escala muito menor do que os loops TAD) traz em aposição estreita o intensificador (E) e o promotor (P) para um gene específico para promover a transcrição (topo). Neste cenário, um isolador (I) é deslocado do promotor no loop de DNA extrudado. A liberação de coesina resulta na perda da proximidade entre o intensificador e o promotor e a inibição da transcrição (parte inferior).

Papéis opostos para a coesina na regulação da transcrição. (A) TADs são grandes loops de DNA que são definidos pela persistência de coesina (vermelho) e CTCF (triângulo azul) na base do loop. A extrusão da alça de DNA mediada pela coesina ocorre até que a coesão encontre isoladores CTCF ao longo do genoma. O CTCF liga-se a motivos de DNA de forma assimétrica, de modo que as alças TAD são tipicamente flanqueadas por locais convergentes de CTCF. Observe que as coesinas podem conectar TADs (dentro e entre os cromossomos) para definir ou isolar as sequências de remodeladores da cromatina ou fatores de transcrição que se movem ao longo do DNA. (B) Os compartimentos são regiões untethered de DNA (isto é, ligação de coesina reduzida) que coalescem através de agrupamento de proteínas contendo domínio de baixa complexidade (intrinsecamente desordenado) e agregação de fatores (tais como histona e complexos de transcrição) que apresentam modificações semelhantes. Os compartimentos são divididos em estados A (induzido, verde) e B (reprimido, vermelho). A coesina promove a formação de TAD, mas as alças restritas que ela forma antagonizam a formação de compartimentos - portanto, a predominância de TADs e compartimentos depende em grande parte da deposição ou liberação de coesina. (C) As coesinas também regulam os efeitos específicos do gene na transcrição. É mostrado aqui um modelo especulativo através do qual looping de DNA dependente de coesina (em uma escala muito menor do que loops TAD) traz em aposição estreita o intensificador (E) e promotor (P) para um gene específico para promover a transcrição (topo). Neste cenário, um isolador (I) é deslocado do promotor no loop de DNA extrudado. A liberação de coesina resulta na perda da proximidade entre o intensificador e o promotor e a inibição da transcrição (parte inferior).

Coesinas promovem TADs, mas antagonizam compartimentos

O peixe-zebra é um sistema modelo excepcionalmente útil para vincular estudos de transcrição e desenvolvimento baseados em coesina (Kawauchi et al., 2016 Muto e Schilling, 2017 Banerji et al., 2017a). Um estágio chave no desenvolvimento é a transição do controle da transcrição materno para o zigótico (também denominado ZGA de ativação do genoma zigótico). Embriões com níveis reduzidos de coesina (RAD21) retêm níveis elevados de mRNAs maternos, sugerindo que a coesina é crítica para a renovação do mRNA materno e subsequente expressão de mRNAs zigóticos (Rosa e Brivanlou, 2017 Meier et al., 2018). Em embriões que contêm níveis de coesina de tipo selvagem, ChIP-seq revelou um extenso aumento no número de sítios de DNA decorados com coesina pós-ZGA - especialmente em potenciadores e / ou promotores que carregam modificações de histonas indicativas de genes ativados (Bogdanovic et al ., 2012 Meier et al., 2018). Se as coesinas regulam a transcrição gene por gene, seria de se esperar que os genes identificados por meio de níveis alterados de mRNA fossem os mesmos genes que exibem ligação de coesina a seus intensificadores e / ou promotores. Na verdade, vários estudos documentam a regulação da transcrição específica do gene dependente da coesina (Rollins et al., 2004 Stedman et al., 2008 Rhodes et al., 2010 Gimigliano et al., 2012 Yan et al., 2013 Banerji et al., 2016, 2017b Tsai et al., 2018). No peixe-zebra pós-ZGA, no entanto, apenas metade dos genes que exibem níveis alterados de mRNA após a depleção de coesina correspondiam a loci de genes que normalmente eram ligados pela coesina (Meier et al., 2018). Assim, as coesinas influenciam a transcrição por meio de vários mecanismos, que incluem a regulação específica do gene, bem como efeitos mais globais - os últimos provavelmente baseados no TAD e na formação do compartimento (Fig. 4).

Análises precoces de ChIP-seq em leveduras revelaram que a densidade e distribuição de coesina ao longo do DNA se correlacionam com o tamanho da alça do DNA (Guacci et al., 1997 Blat e Kleckner, 1999 Hartman et al., 2000 Glynn et al., 2004). Os resultados obtidos a partir de uma ampla gama de sistemas modelo definem um papel ativo para a coesina na formação de TAD. Mesmo no estágio de uma célula de zigotos de camundongo, a arquitetura nuclear de interfase contém TADs (Gassler et al., 2017). O nocaute baseado em Cre do gene que codifica para a subunidade de coesina RAD21 interrompeu os TADs em embriões de camundongo (Gassler et al., 2017). A depleção de RAD21 de células HeLa ou células de carcinoma colorretal humano aboliu de forma semelhante os TADs durante a interfase (Wutz et al., 2017, Rao et al., 2017). Mais importante, RAD21 a re-expressão resultou em uma rápida remontagem de TADs, especialmente perto de super potenciadores, que contêm uma alta densidade de potenciadores, fatores de transcrição, ativando modificações de histona, coesinas e CTCF (Rao et al., 2017 Huang et al., 2018 Plys e Kingston, 2018).

O que define a duração do loop em um TAD? Loops de DNA podem se formar através da oligomerização ou captura de coesinas que decoram segmentos individuais em uma molécula de DNA. Uma noção interessante é que isso pode promover a transcrição específica do gene. Um cenário mais provável, no entanto, é que as coesinas extrudam loops de DNA - um modelo baseado em parte em observações de extrusão por complexos de condensina e um papel para ATP em loops baseados em coesina (Lawrimore et al., 2017 Ganji et al., 2018 Vian et al., 2018). Os comprimentos do loop, portanto, aparecem epigeneticamente definidos por pausas que ocorrem durante a extrusão do loop (Fig. 4). As pausas surgem por meio de interações de coesina com CTCF: as coesinas se ligam e colocalizam com CTCF na base de TADs (Stedman et al., 2008 Wendt et al., 2008 Rubio et al., 2008 Parelho et al., 2008 Rao et al., 2014 , 2017 Dixon et al., 2012 Wutz et al., 2017 Huang et al., 2018) e a coesina não migra em vitro DNA passado decorado com CTCF (Davidson et al., 2016). Em apoio ao modelo de que o CTCF define o comprimento do loop de DNA dentro dos TADs, a degradação do CTCF não abole os TADs, mas altera os comprimentos do loop de TAD (Wutz et al., 2017). Curiosamente, a natureza dinâmica dos TADs durante a interfase contrasta fortemente com a coesão estável e independente de CTCF que ocorre entre as cromátides irmãs durante a mitose (revisado em Rudra e Skibbens, 2013 Jeppsson et al., 2014 Marston, 2014 Morales e Losada, 2018). Os mecanismos através dos quais a coesina é direcionada para estes regulados exclusivamente cis- e trans-tetherings continua a ser um enigma intrigante.

Se as coesinas são realmente necessárias para a formação de TAD, então a inativação dos reguladores de coesina deve impactar de forma semelhante a formação de TAD. NIPBL em células de metazoário (e seus homólogos Scc2 em levedura e Nipped B em moscas) é crítico para a deposição de coesina no DNA (Rollins et al., 1999, 2004 Ciosk et al., 2000 Tonkin et al., 2004 Krantz et al., 2004). Na verdade, a depleção de NIPBL resultou na redução da ligação da coesina ao DNA e na perda de TADs em todo o genoma (Schwarzer et al., 2017). Conseqüentemente, aumentar a residência de coesina deve ter o efeito oposto. WAPL em células de metazoários (e o homólogo de levedura Rad61) promove a dissociação da coesina do DNA, de modo que a depleção ou mutação de WAPL resulta em níveis aumentados de ligação da coesina ao DNA (Kueng et al., 2006 Gandhi et al., 2006). Nocaute baseado em CRISPR de WAPL em linhas de células leucêmicas humanas haplóides e em zigotos de camundongos resultou em maior residência de coesinas no DNA e detecção mais robusta de TADs que incluíram loops de DNA mais longos e interações aumentadas entre TADs adjacentes (Haarhuis et al., 2017 Gassler et al., 2017). Curiosamente, as células esgotadas de WAPL proliferaram normalmente (Haarhuis et al., 2017). Uma interpretação dessa observação é que os programas de desenvolvimento (considerados como responsáveis ​​pelo RBS e CdLS) podem ser mais sensíveis a mudanças na transcrição do que células isoladas.

Embora as coesinas sejam críticas para a formação de TAD, essas estruturas em loop restritas antagonizam a formação de compartimentos. Por exemplo, a depleção de RAD21 em zigotos de camundongos e células colorretais humanas leva a maiores volumes de compartimento que compreendem uma porção maior do núcleo (Gassler et al., 2017 Rao et al., 2017). (Fig. 4). Reduzindo os níveis de coesina ligada à cromatina por meio da depleção de MAU2 (um parceiro de ligação de NIPBL que promove a deposição de coesina no DNA) resulta de forma semelhante em volumes de compartimento aumentados (Ciosk et al., 2000 Seitan et al., 2006 Haarhuis et al., 2017). O oposto é observado ao aumentar a residência de coesina por meio do esgotamento de WAPL - intensidades de sinal, indicativas de compartimentação genômica, são reduzidas (Haarhuis et al., 2017 Wutz et al., 2017 Gassler et al., 2017). Tomados em conjunto, esses achados sugerem que os compartimentos genômicos aumentam em resposta à perda de coesina (Fig. 4).

Compactação de coesina e cromatina durante a interfase

Alterar os níveis de coesinas também pode produzir uma compactação da estrutura da cromatina que é facilmente resolvida por microscopia de luz (Tedeschi et al., 2013 Ouyang et al., 2016 Wutz et al., 2017). Por exemplo, a depleção de WAPL (isto é, aumentando a residência de coesina) via RNAi em células HeLa dá origem, durante a interfase, a estruturas de cromatina semelhantes a vermes pré-condensadas denominadas vermicelli. A condensação prematura aumenta ainda mais com a co-depleção do fator regulador e de ligação à coesina PDS5 (os humanos contêm dois parálogos PDS5A e PDS5B) (Tedeschi et al., 2013 Ouyang et al., 2016 Wutz et al., 2017). Embora o Pds5 tenha sido identificado pela primeira vez como apoiando papéis de coesina em ambos trans- e cis-tethering, Pds5 também se liga ao fator de liberação de coesina WAPL (denominado Rad61 em levedura) e esta associação é altamente conservada (Hartman et al., 2000 Panizza et al., 2000 Losada et al., 2005 Sutani et al., 2009 Shintomi e Hirano, 2009 Ouyang et al., 2016 Goto et al., 2017). Em combinação, esses resultados sugerem que o Pds5 estabiliza as amarras de coesina, mas pode promover a liberação de coesina em coordenação com WAPL. Essa condensação prematura durante a interfase envolve condensinas? É importante ressaltar que a depleção do componente de condensina Smc2 não bloqueia a formação de vermicelli em células co-depletadas de WAPL e PDS5 (Wutz et al., 2017), indicando que a compactação da cromatina durante a interfase é mediada por coesinas.


Perspectiva futura

Devido à sua natureza séssil, as plantas desenvolveram mecanismos dinâmicos para lidar com mudanças ambientais imprevisíveis. Os encontros frequentes com o estresse ambiental são uma circunstância única no estilo de vida das plantas. As respostas ao estresse são muitas vezes prejudiciais ao crescimento (Bennett et al., 2012) e precisam ser ajustados para que sejam ativados apenas quando necessário. Outra característica única das plantas é que elas mantêm pools de células-tronco pluripotentes que geram novos órgãos iterativamente a partir de meristemas ao longo de suas vidas. Isso significa que a pluripotência deve ser mantida de forma estável, enquanto a resposta aos sinais de diferenciação precisa ser versátil e fluida. Remodeladores de cromatina fornecem uma excelente plataforma regulatória para o estilo de vida da planta.

As plantas são claramente sistemas modelo excelentes para compreender as funções e a regulação dos remodeladores da cromatina SWI / SNF e CHD3. No entanto, alguns desafios importantes surgiram que precisam ser abordados para compreender totalmente essas proteínas ‘motoras’ dependentes de ATP. Um é ferramentas genéticas mais precisas, como perda condicional ou resgate da atividade ou ATPases de remodelação da cromatina. Isso será especialmente informativo para descobrir papéis sobrepostos dos diferentes tipos de remodeladores da cromatina (como PKL e PKR2 ou SYD e BRM) e para identificar seus efeitos iniciais imediatos nos processos nucleares.

Um segundo requisito é a elucidação da composição dos complexos de remodelação específicos do estágio e do tipo de célula. Em metazoários, configurações complexas únicas determinam programas de desenvolvimento (Hargreaves e Crabtree, 2011). Ainda não está claro se os complexos de remodelação da cromatina dedicados a estágios específicos de desenvolvimento ou respostas ao estresse existem nas plantas. Uma ampla gama de ferramentas genéticas e moleculares permitiu aos cientistas de plantas isolar com sucesso tipos de células ou núcleos únicos de uma planta intacta (Birnbaum e Benfey, 2004 Deal e Henikoff, 2011). Essas ferramentas, combinadas com anticorpos específicos ou plantas transgênicas marcadas com epítopo para subunidades complexas de remodelação da cromatina, irão facilitar a purificação de complexos de remodelação da cromatina e tipos de células vegetais definidos associados.

Finalmente, para obter uma compreensão abrangente de como os remodeladores da cromatina controlam o desenvolvimento da planta ou as respostas ao estresse, as análises de ligação do genoma de remodeladores da cromatina combinadas com a análise do transcriptoma após a perda condicional ou resgate da reatividade do remodelador da cromatina serão altamente informativas. Esses estudos devem ajudar a identificar genes-alvo diretos que são provavelmente importantes na reprogramação da transcrição dependente do remodelador da cromatina. Idealmente, essas análises devem ser realizadas em um único tecido ou tipo de célula. Esses experimentos ajudarão a resolver a questão de como a versatilidade e a robustez dos remodeladores da cromatina são alcançadas.

Remodeladores de cromatina desempenham papéis essenciais no controle da fidelidade de interruptores em programas de transcrição. Nesta função, os remodeladores da cromatina foram identificados como possíveis alvos para a geração de plantas resistentes à seca (Han et al., 2012) e para o tratamento do câncer em humanos (Garraway e Lander, 2013 Kadoch et al., 2013 Helming et al., 2014). A questão pertinente a abordar é como a especificidade dos complexos de remodelação da cromatina pode ser manipulada. Abordar essa questão pode ajudar a resolver dois dos maiores desafios atuais da humanidade.


A expressão alterada da coesina está associada a distintos fenótipos de câncer

É significativo que tanto a superexpressão quanto a subexpressão de coesina estão associadas ao câncer. A expressão da coesina é desregulada em uma série de cânceres, incluindo mama, próstata e carcinoma de células escamosas oral, e alterações nos genes que codificam proteínas coesina são encontradas no câncer colorretal e malignidades mieloides (Tabela 2).

O nível da subunidade RAD21 da coesina é freqüentemente elevado no câncer (Tabela 2). RAD21 a superexpressão no câncer de mama está associada a cânceres mais agressivos e resulta em um pior prognóstico para a paciente (95–97). Por exemplo, RAD21 foi identificada como parte de uma assinatura de expressão gênica que conferiu um curto intervalo a metástases distantes em pacientes com câncer de mama, com RAD21 encontrado para ser regulado significativamente para cima no grupo de pior prognóstico (95). De forma similar, RAD21 a superexpressão foi associada a um mau prognóstico em pacientes com câncer de mama com metástases em linfonodos supraclaviculares (96).

Existem algumas evidências que indicam que níveis elevados de coesina podem estar associados à proliferação tumoral, às custas de metástases tumorais (97, 98). No câncer de mama, RAD21 a expressão mostrou ser significativamente menor em tumores invasivos em comparação com seus no local contrapartes (97). Embora RAD21 a superexpressão se correlacionou com o tamanho do tumor maior, talvez indicativo de proliferação aumentada, não houve correlação com o grau do tumor. No entanto, aumentou RAD21 a expressão se correlacionou significativamente com menor sobrevida livre de recidiva em tumores de grau 3 em comparação com tumores de grau 1 e 2 (97). Tumores de grau 3 são caracterizados por um alto índice proliferativo, e é possível que RAD21 contribui para o potencial proliferativo do câncer. Por outro lado, Yamamoto e colegas (98) mostraram que no carcinoma de células escamosas oral, RAD21 a expressão foi regulada para baixo em tumores que exibiram um padrão de crescimento invasivo em comparação com tumores que cresceram mais expansivamente, consistente com um papel proliferativo da coesina na progressão do tumor. De interesse, os autores especularam que as condições hipóxicas, que são conhecidas por regular negativamente RAD21 em muitas células tumorais humanas, pode levar a um potencial invasivo (98). Essas observações levantam a possibilidade de que mudanças em RAD21 a expressão está associada à mudança entre a capacidade de invasão do tumor e a proliferação do tumor.

Uma variedade de estudos forneceu fortes evidências de que a coesina tem um papel importante no câncer (Tabela 2). A desregulação da coesina pode levar à aneuploidia, que geralmente é considerada a causa patológica em cânceres com mutações da coesina. No entanto, os efeitos potenciais na transcrição resultantes da função alterada da coesina também devem ser considerados. É interessante notar que os cânceres nos quais o envolvimento da coesina está associado a um pior prognóstico são aqueles em que a coesina está superexpressa. É provável que haja bastante coesina disponível para mitose intacta em tais cânceres e, portanto, relações alternativas de causa e efeito entre a coesina e o câncer podem estar em jogo.

Indivíduos com CdLS têm função de coesina reduzida e, portanto, podem ser informativos sobre o papel da coesina no câncer. Há poucas evidências conclusivas de que os pacientes com CdLS têm defeitos evidentes na coesão da cromátide irmã, mesmo que esses indivíduos estejam comprometidos com a carga ou função de coesina (99). Curiosamente, o câncer é, se alguma coisa, sub-representado nas coortes CdLS. Uma incidência maior do que o normal de esôfago de Barrett causando carcinoma provavelmente está ligada ao refluxo gastrointestinal prevalente encontrado em indivíduos com CdLS (100). É interessante especular que a insuficiência de coesina proeminente em pacientes com CdLS poderia realmente proteger contra o câncer, talvez porque os genes do câncer que são regulados positivamente pela coesina sejam regulados negativamente. Por exemplo, expressão do c-MYC oncogene é regulado para baixo em células de pacientes com CdLS (ref. 101 e veja abaixo).

A superexpressão de coesina em muitos cânceres aumenta a possibilidade de que a coesina contribua para o câncer por meio da regulação da transcrição. Abaixo, descrevemos 2 meios pelos quais a transcrição do gene mediada pela coesina pode contribuir para o câncer, a saber, a regulação de oncogenes e genes que mantêm a pluripotência e a participação da coesina nas vias dependentes de hormônio subjacentes ao câncer.


O papel do ATP na ligação ao DNA por complexos Rad50

o B. subtilis A proteína SMC fornece algumas pistas específicas de como a ligação e a hidrólise do ATP podem influenciar a ligação ao DNA em proteínas relacionadas. B. subtilis SMC é um homodímero que pode se ligar ao DNA por meio de seu domínio de dobradiça (Hirano e Hirano 2006). Duas formas diferentes de ligação ao DNA moduladas pelo ciclo da ATPase foram descritas (Hirano e Hirano 2006). Uma interação menos estável com o DNA, chamada de modo sentado, estimula a atividade ATPase levando ao desprendimento cabeça-cabeça e abertura do anel proposto formado pelas bobinas enroladas, que ainda são mantidas como um dímero através da interface dobradiça-dobradiça (Fig. 2b em comparação com a Fig. 2c). Esse desligamento da interface do domínio ATPase é um pré-requisito para a formação de uma ligação de DNA mais estável, chamada de modo de gancho. Neste modo de ligação mais estável, o ATP tem um efeito positivo na ligação ao DNA, pois o engajamento cabeça-cabeça pode levar à captura de um segundo duplex de DNA dentro de um anel formado quando as bobinas enroladas são conectadas nas extremidades da dobradiça e ATPase. Essas ideias são conceitualmente semelhantes ao modelo de anel proposto para a função do complexo de coesina eucariótica (Haering et al. 2002), em que dois duplexes de DNA são mantidos dentro de um anel de proteína formado pela associação das bobinas enroladas em ambos os domínios da dobradiça e da cabeça de ATPase. (Haering et al. 2008), embora aqui locais específicos de ligação ao DNA não tenham sido definidos. o B. subtilis SMC, como outros SMCs, interage por meio de seu domínio ATPase com proteínas não SMC, neste caso ScpA e ScpB (Hirano 2005). A ligação de ScpA e ScpB suprime a atividade ATPase, estabilizando assim o envolvimento dos domínios ATPase (Hirano e Hirano 2004).

Embora os presentes modelos para a função dos vários membros SMC ainda sejam especulativos, os dados acima mostram que o ciclo de ATPase está ligado a mudanças nas interações entre as subunidades e, possivelmente, regula a ligação ao DNA de várias maneiras. Vários estudos sugerem que a ligação ou hidrólise de ATP é importante para a função MR (N). O ATP provavelmente atua como um interruptor estrutural que altera a conformação de MR (N). A adição de ATP, e mais ainda AMP-PNP, aumentou a preferência de MR humano purificado para formar grandes oligômeros em substratos de DNA com saliências 3 'em comparação com extremidades cegas e saliências 5' (de Jager et al. 2002). Com base na cristalografia de raios-x de domínios ATPase isolados, a ligação de ATP causa dois rearranjos estruturais principais no domínio ATPase de Rad50. Em primeiro lugar, há uma rotação de 30 ° do lóbulo C-terminal em relação ao lóbulo N-terminal e, em segundo lugar, os dois motivos ATPase de Rad50 se formam em um homodímero compacto (Hopfner et al. 2001). Foi proposto que as reposições de rotação induzida por ATP ligaram o DNA em relação a Mre11 (Hopfner et al. 2001). Os papéis específicos das mudanças conformacionais induzidas por ATP no contexto do complexo RMN completo ainda precisam ser elucidados.

Um requisito específico para ATP na ligação ao DNA pelo complexo MR (N) foi sugerido em vários estudos, mas não foi observado em outros. Rad50 originalmente purificado por si mesmo a partir de S. cerevisiae (Raymond e Kleckner 1993) DNA ligado de forma dependente de ATP em um ensaio de ligação de filtro. Da mesma forma, uma construção de proteína incluindo os domínios ATPase N- e C-terminais de P. furiosus Rad50 (doravante referido como pfRad50cd para domínio catalítico) dimerizado na presença de ATP, conforme determinado por dispersão de luz dinâmica (Hopfner et al. 2000b). Neste mesmo estudo, um ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) mostrou que as mesmas concentrações de pfRad50cd ligam mais DNA na presença de ATP. No entanto, complexos purificados de MR ou MRN humanos exibiram ligação de DNA independente de ATP em um estudo (Paull e Gellert 1999), mas ligação de nucleotídeo e DNA dependente de NBS1 em outro (Lee et al. 2003). As substituições de aminoácidos no motivo de assinatura de ligação de ATP conservado do RAD50 humano abolem a ligação ao DNA pelo complexo MRN resultante (Moncalian et al. 2004), também implicando que o ATP é necessário para a ligação ao DNA. No entanto, a ligação de DNA substancial pelo complexo MR humano na ausência de nucleotídeos adicionados foi observada em ensaios EMSA, bem como por imagens SFM que demonstraram ligação de DNA independente de nucleotídeos, oligomerização e amarração (de Jager et al. 2001b). Um exame cuidadoso desses diferentes estudos mostra algumas diferenças importantes que podem ajudar a esclarecer os resultados aparentemente díspares.

A ligação da proteína a um substrato, neste caso o DNA, é caracterizada por constantes de associação e dissociação relacionadas à concentração. Vários estudos de ligação de DNA, descritos acima, relatam um comportamento um tanto diferente de complexos contendo Rad50. Estas diferenças relatadas podem, obviamente, ser devidas a condições variáveis ​​para as reações de ligação e ensaios. No entanto, qualquer mudança na afinidade implícita da proteína para o DNA, devido à presença ou ausência de cofatores, seria devido a diferenças nas constantes de ligação. As constantes de associação para Rad50, ou complexos incluindo Rad50, que se ligam ao DNA não foram rigorosamente determinadas e podem ser difíceis de classificar pelas razões descritas abaixo. No entanto, a aparente atividade de ligação ao DNA depende da concentração de proteína e DNA, e esses fatores diferem entre os relatórios publicados. A ligação de DNA independente de nucleotídeo é observada por imagem EMSA e SFM em concentrações de proteína MR na faixa de 10–100 nM (de Jager et al. 2001b, 2002). Ligações dependentes de nucleotídeos variáveis ​​são observadas em estudos onde substratos de DNA e complexos de proteínas estão presentes em baixas concentrações nanomolares (Paull e Gellert 1999 Lee et al. 2003). A comparação desses estudos indica que grandes diferenças no comportamento de ligação ao DNA são observadas com alterações de 2 a 3 vezes na concentração de proteína. Isso pode indicar que o K d para MR ou MRN a ligação ao DNA está na faixa de 10 nM. Também é possível que as proteínas purificadas usadas nesses estudos possam diferir ligeiramente em composição, qualidade e atividade específica.

Além de considerações sobre a quantidade e qualidade da proteína usada, o tipo de DNA nos diferentes ensaios pode influenciar a afinidade de ligação aparente. Os ensaios EMSA normalmente usam DNA relativamente curto, na faixa de 50-160 nt ou bp nos estudos citados acima, que acomodaria a ligação de um ou alguns complexos MR (N). Os experimentos de imagem SFM usam DNA mais longo na faixa de 1–5 kbp. A ligação de MR (N) a substratos de DNA mais longos, da ordem de 1 kbp, pode envolver a interação proteína-proteína, além da interação proteína-DNA. A imagem SFM mostra que o DNA mais longo é ligado por conjuntos oligoméricos nos quais a formação do complexo proteína-DNA e a estabilidade podem ser influenciadas pelo favorecimento de interações entre proteínas aproximadas por ligação ao DNA. As múltiplas interações DNA-proteína e proteína-proteína que ocorrem em substratos de DNA capazes de ligar múltiplos complexos MR (N) tornam difícil determinar afinidades simples de proteína-DNA e constantes de ligação.

Uma maneira de interpretar esses relatórios de ligação de DNA dependente de ATP e independente de ATP por MR e MRN é que existem diferentes locais de ligação ao DNA e que o ATP afeta o acesso ou a montagem de locais de ligação ao DNA. Esta ideia reflete os diferentes modos de ligação de DNA propostos e seu controle pela ligação de ATP descrita para B. subtilis SMC (Hirano e Hirano 2006). Para o complexo MR, são esperados diferentes locais de ligação ao DNA, uma vez que Mre11 e Rad50 se ligam separadamente ao DNA (Paull e Gellert 1998 Raymond e Kleckner 1993 de Jager et al. 2001a Hopfner et al. 2000a). Enquanto a ligação do DNA por Mre11 é independente do ATP, o ATP é necessário para que o Rad50 sozinho se ligue ao DNA. Assim, os diferentes efeitos do ATP na ligação ao DNA por complexos MR ou MRN podem refletir a ligação a esses dois locais diferentes. Além disso, o acesso aos locais de ligação ao DNA no complexo proteico pode depender das mudanças induzidas pela ligação do ATP na arquitetura molecular.

Por analogia com proteínas SMC bem descritas, espera-se que a ligação de ATP a Rad50 faça com que os domínios de ATPase se envolvam como dímeros e a hidrólise de ATP cause o desligamento. Os estudos cristalográficos de raios-X do domínio catalítico pfRad50 revelam uma rotação de 30 ° dos domínios entre si induzida pela ligação de ATP (Hopfner et al. 2000b). Curiosamente, a análise bioquímica do MR eucariótico mostra uma interação proteína-DNA aprimorada com AMP-PNP (um análogo não hidrolisável do ATP) (Lee et al. 2003). Esses autores argumentaram que a ligação AMP-PNP pode bloquear a liberação de DNA que, de outra forma, seria desencadeada pela hidrólise do ATP. Eles sugerem que a necessidade de um análogo de ATP não hidrolisável implica em rápida hidrólise de ATP por MRN. No entanto, as taxas de renovação de ATP para RM são bastante lentas, variando de 0,026 a 0,08 por minuto por complexo de RM (de Jager et al. 2002 Bhaskara et al. 2007). Uma imagem mais clara da importância do ATP na função complexa do Rad50 exigirá uma maior consolidação da riqueza de dados disponíveis, bem como a consideração de papéis mais sutis dos cofatores de nucleotídeos. Por exemplo, os possíveis efeitos da ligação do DNA na afinidade de MR e troca de nucleotídeos ligados não foram determinados, nem a cinética de liberação de ADP está bem definida. Esses eventos mecanisticamente interessantes estão possivelmente ligados a mudanças na arquitetura do complexo de proteínas durante o ciclo da ATPase. Além disso, a discussão que apresentamos aqui prevê novos aspectos da função do MR (N) na organização do DNA que podem ser controlados no ciclo da ATPase.Essas conexões estrutura-função incluem: (1) a existência de diferentes sítios de ligação ou modos nos complexos MR (N), (2) a importância das interações proteína-proteína para controlar a ligação ao DNA e (3) mudanças arquitetônicas no MR ( N) que poderia influenciar os contatos inter ou intra-complexos e, subsequentemente, controlar a formação ou o acesso aos locais de ligação ao DNA.


Reconhecimentos

Gostaríamos de agradecer: Duncan Odom e Paul Flicek por seu apoio e feedback útil David Bazett-Jones por fornecer comentários críticos Morgane Collier por conselhos sobre análise de ChIP-exo James Hadfield e Dax Torti do Instituto de Cambridge e instalações centrais de sequenciamento de Donnelly, respectivamente , para sequenciamento de DNA e Clive de Santos da unidade de proteômica do Cambridge Institute.

Financiamento

Este trabalho foi financiado por: Fundação SickKids (MDW), Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), concessão 436194-2013 (MDW), Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde por meio da concessão 143301 (ACG) e cátedras de Pesquisa do Canadá de nível II para MDW e ACG. LU é apoiado pelo Conselho de Pesquisa da Estônia (PUTJD145), AM é apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología Fellowship, ML é apoiado pelo Programa de Bolsas de Estudo da Fundação Restracomp Hospital for Sick Children e SH é apoiado pelo Wellcome Trust.

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados gerados durante e / ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis em:

Contribuições dos autores

Concepção e desenho do estudo: MDW, LU, HH, PST, ACG e SH aquisição de dados: LU, PST, HM, EJY, DS e MDW análise e interpretação dos dados: HH, LU, MVR, PST, PS, ML , JR, AM, SH, ACG e MDW MDW, LU e HH escreveram o manuscrito e todos os autores ajudaram na redação e revisão do manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Interesses competitivos

Os autores declaram não ter interesses conflitantes.

Consentimento para publicação

Aprovação ética e consentimento para participar

O material do fígado post-mortem de camundongos C57BL / 6J foi gentilmente cedido pelo Dr. Jayne Danska. Os camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos específicos no Hospital for Sick Children Laboratory Animal Services de acordo com um protocolo de uso de animais aprovado. Material de fígado post-mortem de camundongos C57BL / 6J e C57BL / 6 × A / J também foi gentilmente cedido pelo Dr. Duncan Odom (Cambridge Institute) sob a licença Home Office PPL 80/2197).


Resumo

Os cinetocoros são grandes complexos de proteínas que são formados em regiões cromossômicas conhecidas como centrômeros. Para a segregação cromossômica de alta fidelidade, os cinetocoros devem ser capturados corretamente no fuso mitótico antes do início da anáfase. Durante a prometáfase, os cinetocoros são inicialmente capturados por um único microtúbulo que se estende a partir de um pólo do fuso e, em seguida, são transportados em direção ao pólo ao longo do microtúbulo. Posteriormente, os microtúbulos que se estendem do outro pólo do fuso também interagem com os cinetocoros e, eventualmente, cada cinetocoro irmão se liga a microtúbulos que se estendem de pólos opostos - isso é conhecido como bi-orientação. Aqui, discutimos os mecanismos moleculares desses processos, focalizando a levedura em brotamento e fazendo comparações com outros organismos.


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