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Proteases no sangue

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Estou lendo sobre hormônios e o livro fala sobre como os hormônios peptídeos ou aminas são facilmente decompostos por proteases presentes no plasma sanguíneo. Isso me levou a questionar as interações entre essas proteases e as proteínas do sangue (como albuminas e globulinas). Ter proteases no sangue significa que as proteínas do sangue são constantemente quebradas? Então, como as proteínas do sangue são produzidas? E de que servem as proteínas de ligação para proteger os hormônios durante o trânsito vascular, quando as proteínas de ligação também são suscetíveis às proteases do sangue?

Edit: Fui solicitado a fornecer algumas citações e referências.

Como os hormônios solúveis em água podem se dissolver no sangue, muitos circulam como hormônios livres, o que significa que a maioria deles se dissolve diretamente no sangue e é entregue ao tecido-alvo sem se ligar a uma proteína de ligação.

O livro continua a dizer

Hormônios solúveis em água, como proteínas, peptídeos e derivados de aminoácidos, têm meia-vida relativamente curta porque são rapidamente degradados por enzimas, chamadas proteases, na corrente sanguínea. Os rins então removem os produtos da decomposição do hormônio do sangue.

Essas citações eram de Anatomia e fisiologia de Seeley, 10ª edição.


Plaquetas e proteases

As plaquetas circulantes são essenciais para a formação de coágulos sanguíneos. Estudos em ratos revelam mais sobre as proteínas envolvidas na ativação das plaquetas, com implicações para a compreensão de derrames e ataques cardíacos.

Como os animais param de sangrar após um ferimento? Na época em que os humanos evoluíram, uma solução comum consistia em gerar rapidamente um coágulo complexo composto de proteínas derivadas do sangue (fibrina) e células (plaquetas). Trabalhando juntas, a fibrina e as plaquetas criam um tampão que evita o sangramento por tempo suficiente para que a cura ocorra. A desvantagem é que os coágulos também podem se formar em vasos sanguíneos marcados por placas carregadas de colesterol (aterosclerose), interrompendo o fluxo sanguíneo e levando a derrames e ataques cardíacos.

Escrevendo na página 74 desta edição, Sambrano e colegas 1 investigam uma das principais questões sem resposta sobre a coagulação: qual é o papel em camundongos de uma proteína chamada receptor-4 ativado por protease (PAR4)? Seus resultados confirmam a necessidade dessa proteína na coagulação, mas as implicações vão além disso, tocando no ajuste fino da ativação plaquetária e diferenças intrigantes entre ratos e humanos. Também pode haver implicações para o desenvolvimento de medicamentos para prevenir problemas cardiovasculares.

Uma das primeiras etapas na formação de um coágulo sanguíneo é a geração localizada da enzima ativa trombina a partir de seu precursor inativo circulante, a protrombina. A trombina cliva o fibrinogênio no plasma sanguíneo, criando monômeros de fibrina que então se polimerizam em uma malha através de uma ferida na parede de um vaso sanguíneo. A trombina também ativa as plaquetas 2. Um estudo publicado há uma década 3 estabeleceu que as plaquetas humanas se expressam em seu receptor-1 ativado por protease de superfície (PAR1), uma proteína sinalizadora que é substrato da trombina. Ao clivar PAR1, a trombina inicia a sinalização dentro das plaquetas, fazendo com que elas grudem umas nas outras. A estrutura básica do PAR1 o coloca dentro de uma grande família de receptores de superfície celular que funcionam por meio de interruptores intracelulares chamados proteínas G.

Com o PAR1 identificado, o mistério de como uma protease plasmática poderia ativar as plaquetas parecia ter sido resolvido. Mas em pouco tempo, as perguntas começaram a se acumular. Se PAR1 é de fato o receptor universal de trombina, por que a exclusão de seu gene em camundongos não teve efeito sobre a ativação plaquetária pela trombina? Como a clivagem de um único tipo de receptor pode ativar mais de uma via de sinalização dentro das plaquetas e como essas respostas podem ser moduladas ao longo do tempo e na ampla faixa de concentrações de trombina que as plaquetas provavelmente irão encontrar? Qual, se houver, é o papel de outras proteínas de ligação à trombina encontradas na superfície das plaquetas?

As respostas a pelo menos algumas dessas perguntas são conhecidas. Acontece que existem três outros membros da família PAR 4: PAR2, PAR3 e PAR4. Como PAR1, dois desses receptores - PAR3 e PAR4 - são ativados pela trombina PAR2 não é. Plaquetas humanas expressam PAR1 e PAR4, enquanto as plaquetas de camundongos expressam PAR3 e PAR4, mas não PAR1. Isso, é claro, explica por que a perda de PAR1 não teve efeito sobre a função plaquetária em camundongos.

A trombina produz uma variedade de respostas nas plaquetas porque os receptores PAR estão acoplados a mais de um tipo de proteína G. As respostas graduadas a uma gama de concentrações de trombina podem ser explicadas em parte por uma relação entre a quantidade de trombina presente e o número de proteínas PAR clivadas por segundo, e em parte por diferenças entre os membros da família PAR na concentração de trombina necessária para a clivagem. Assim, por exemplo, PAR1 é um substrato melhor para a trombina do que PAR4. Quando ambos estão presentes, a clivagem de PAR1 presumivelmente precede a clivagem de PAR4 conforme a trombina se acumula (Fig. 1a) 5,6. Por outro lado, uma vez que PAR4 é clivado, parece sinalizar por mais 7.

A comunicação entre a enzima de clivagem de proteínas trombina (tesoura) e membros da família de proteínas PAR desencadeia vias de sinalização que ativam as células sanguíneas. uma, Em humanos, as plaquetas expressam PAR1 e PAR4. Estes são acoplados a vias de sinalização intracelular por meio de interruptores moleculares do Gq, G12 e Geu famílias de proteínas. Quando a trombina remove os terminais amino de PAR1 e PAR4, várias vias de sinalização (setas coloridas) são ativadas, um dos resultados das quais é a secreção de ADP. Ao se ligar ao seu receptor, P2Y12, ADP ativa G adicionaleuvias mediadas. Na ausência de ferimento, a ativação plaquetária é neutralizada pela sinalização da prostaglandina I2. A clivagem de PAR1 pela trombina parece ser ativada pela ligação da trombina à glicoproteína Ibα. b, As plaquetas do rato expressam PAR3 e PAR4. PAR4 parece ser o único responsável pela sinalização 1, enquanto PAR3 permite a clivagem de PAR4, permitindo-lhe responder a concentrações mais baixas de trombina.

O fato de que as plaquetas humanas expressam PAR1 e PAR4 enquanto as plaquetas de camundongos expressam PAR3 e PAR4 parece ser um exemplo de soluções divergentes para um problema comum - como induzir uma variedade de respostas à trombina. Embora o PAR3 do mouse seja um bom substrato para a trombina, ele sinaliza mal, se é que sinaliza. Em outras palavras, por algum motivo, ele perdeu a capacidade de ativar as proteínas G, ao mesmo tempo que retém a capacidade de ser clivado pela trombina. No entanto, quando o gene que codifica PAR3 foi excluído dos camundongos, as plaquetas responderam consideravelmente menos bem à trombina 5. Assim, foi sugerido que PAR4 é o principal mediador das respostas do camundongo à trombina, e que PAR3 tem um papel de suporte, permitindo a clivagem de PAR4 em baixas concentrações de trombina. Nesse caso, seria de se prever que a exclusão de PAR4 aboliria a sinalização da trombina nas plaquetas de camundongos.

Sambrano et al. Agora, eliminei o gene PAR4 em camundongos e descobri que as plaquetas não são mais ativadas pela trombina. Os resultados mostram o requisito para PAR4 e suportam o papel auxiliar previsto para PAR3 (Fig. 1b). Para que esse arranjo estranho tenha surgido, o PAR3 do camundongo não só teve que perder sua capacidade intrínseca de sinalizar quando clivado, como também "adquirir" a capacidade de auxiliar a ativação do PAR4. Pode-se especular que essas diferenças entre as plaquetas de camundongos e humanas não são mera casualidade, mas são apropriadas por outras razões. Isso ainda está para ser visto.

Como os autores mostram, as respostas das plaquetas à trombina foram completamente abolidas em camundongos sem as duas cópias do gene PAR4. Camundongos com uma cópia do gene mostraram uma deficiência modesta na formação de coágulos. Embora esse comprometimento não tenha alcançado significância estatística, parece haver uma tendência aqui: as plaquetas de camundongos podem exigir que a maioria, senão todos, seus receptores de trombina estejam totalmente funcionais. Se isso for verdade também para as plaquetas humanas, então as variações herdadas na estrutura dos membros da família PAR que resultam em uma redução na sinalização podem se traduzir em diferenças entre as pessoas no risco de desenvolver derrames e ataques cardíacos. Até agora, nenhuma variação de alteração de função em PAR1 e PAR4 foi relatada, mas uma foi descrita 8 para PAR2.

As proteínas PAR são suficientes para responder por todas as respostas das plaquetas à trombina? Dados os novos resultados 1 e o fato de que o bloqueio simultâneo de PAR1 e PAR4 abole a capacidade das plaquetas humanas de responder à trombina 9, a resposta pareceria "sim". Mas estudos recentes 10,11 revigoraram o debate sobre o papel do complexo multiproteico da glicoproteína Ib / IX / V como sítio de ligação e substrato para a trombina. Ainda é muito cedo para prever o resultado desse debate. No entanto, os resultados do Sambrano et al. fornecem uma demonstração conclusiva do papel essencial do PAR4 na ativação das plaquetas pela trombina e, por extensão, da necessidade da própria trombina. Seu trabalho também enfatiza a possibilidade de que drogas que bloqueiam PAR1, PAR4 ou ambos possam ser úteis no tratamento de uma variedade de distúrbios de coagulação em humanos.


O que é Protease? (com fotos)

Uma protease é membro de um grupo muito grande de enzimas que têm uma variedade de funções no corpo. A principal é como uma enzima digestiva para processar proteínas. Sem a protease, o corpo não seria capaz de digerir a proteína dos alimentos. Outros tipos de proteases estão envolvidos na regulação de eventos celulares, como a coagulação do sangue. Estes também são chamados enzimas proteolíticas ou proteinases.

As proteínas são longas cadeias de aminoácidos que são mantidas juntas por ligações peptídicas. Pequenos fragmentos de proteínas são conhecidos como peptídeos, e fragmentos maiores são referidos como polipeptídeos. As enzimas que quebram os peptídeos são chamadas peptidases.

Proteases são tipos de proteínas que aceleram a degradação de outras. Eles diferem na maneira como realizam essa atividade. Exopeptidases clivar aminoácidos terminais e mordiscar proteínas. Eles quebram as ligações peptídicas para liberar aminoácidos. Em contraste, endopeptidases atuam dentro da proteína, e também clivam ligações peptídicas, produzindo polipeptídeos como resultado de suas atividades.

Existem várias classes de proteases, dependendo do tipo de aminoácido no local onde ocorre a reação e de qualquer molécula adicional necessária para a atividade. Por exemplo, muitas proteínas requerem um átomo de metal para serem ativas. Eles são conhecidos como metaloproteinases. Outras proteases têm um aminoácido conhecido como serina em seu sítio ativo, e são conhecidas como serina proteases.

Os estudos iniciais de proteases, na fisiologia humana, foram feitos para discernir seu papel na digestão no sistema gastrointestinal. O objetivo da digestão enzimática é quebrar moléculas maiores em menores. Várias proteases atuam em conjunto com as peptidases para degradar as proteínas dos alimentos em pequenos peptídeos e aminoácidos. Essas pequenas moléculas podem ser absorvidas pelas células intestinais e usadas como combustível ou para construir novas moléculas de proteína.

Uma coisa que todas essas proteases digestivas têm em comum é que são sintetizadas como formas maiores e inativas para evitar danos enzimáticos no tecido que as contém. Esses precursores são conhecidos como zimógenos. Outra característica que eles compartilham é que são todas endopeptidases, embora variem na preferência por qual parte das proteínas irão clivar. Esta especificidade de substrato é baseada na localização de aminoácidos específicos nas proteínas alvo.

O estômago contém a protease digestiva pepsina, que é estimulado pelo ácido clorídrico do estômago. A pepsina quebra as proteínas em polipeptídeos, que viajam para o intestino. Nesse local, eles são quebrados em pedaços ainda menores pelas proteases digestivas adicionais, tripsina e quimiotripsina. Todas essas enzimas são serina proteases.

Outros tipos de protease atuam regulando a atividade de outras proteínas. Ao clivar um local específico em uma proteína, eles podem ativá-la ou desativá-la. Isso pode ser parte de um mecanismo para sinalizar uma mudança fisiológica. Outra função das proteases é auxiliar no processamento de proteínas produzidas em formas maiores, como a proteína precursora amilóide. Outras proteases degradam proteínas que não são mais necessárias para a função celular.


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ADAMTS proteases na fisiologia e doença cardiovascular

A família de um tipo desintegrina e metaloproteinase com motivo de trombospondina (ADAMTS) compreende 19 proteases que regulam a estrutura e função de proteínas extracelulares na matriz extracelular e no sangue. O papel cardiovascular mais bem caracterizado é o de ADAMTS-13 no sangue. Níveis moderadamente baixos de ADAMTS-13 aumentam o risco de acidente vascular cerebral isquêmico e níveis muito baixos (menos de 10%) podem causar púrpura trombocitopênica trombótica (PTT). ADAMTS-13 recombinante está atualmente em ensaios clínicos para o tratamento de TTP. Recentemente, novos papéis cardiovasculares para as proteases ADAMTS foram descobertos. Vários membros da família ADAMTS são importantes no desenvolvimento dos vasos sanguíneos e do coração, especialmente as válvulas. Vários estudos também investigaram o papel potencial de ADAMTS-1, -4 e -5 nas doenças cardiovasculares. Eles clivam proteoglicanos como o versican, que representam os principais componentes estruturais das artérias. ADAMTS-7 e -8 estão atraindo considerável interesse devido às suas implicações na aterosclerose e hipertensão arterial pulmonar, respectivamente. Mutações no ADAMTS19 gene causa doença valvar cardíaca progressiva e variantes missense em ADAMTS6 estão associados à condução cardíaca. Nesta revisão, discutimos em detalhes as evidências para esses e outros papéis cardiovasculares dos membros da família ADAMTS, seus substratos proteolíticos e os potenciais mecanismos moleculares envolvidos.

1. Introdução

A matriz extracelular (ECM) orienta a formação de tecidos cardiovasculares durante a embriogênese e os apóia por toda a vida adulta, fornecendo suporte estrutural, orientação do comportamento celular e sequestro de fatores de crescimento. Em grandes artérias e vasos sanguíneos, o colágeno e as fibras elásticas fornecem suporte estrutural essencial para prevenir a ruptura. Uma artéria sã consiste em três camadas (túnica): túnica adventícia, média e íntima (figura 1). A íntima está em contato com o lúmen do vaso e consiste em células endoteliais (ECs) fixadas a uma membrana basal rica em colágeno IV, laminina, nidogênio e proteoglicanos (PGs) de sulfato de heparan (HS) (sindecan, perlecan). A túnica média é composta por células do músculo liso vascular (VSMC), que expressam sulfato de condroitina (CS) / sulfato de dermatan (DS) -PGs (CSPGs) (como versican e agrecan) e elastina. Existem folhas fenestradas de elastina chamadas lamelas entre as quais existem fibras de colágeno, camadas finas de ECM rico em PG e VSMCs. A elastina, que é distensível e tem baixa resistência à tração, funciona como um reservatório elástico e distribui o estresse uniformemente por toda a parede e nas fibras de colágeno [1]. A adventícia é a camada mais externa de um vaso sanguíneo e consiste em uma ECM rica em colágeno secretada por fibroblastos que evita a ruptura vascular em pressões muito altas. A adventícia também é um reservatório de células-tronco e desempenha um papel essencial na regulação das funções das populações de células na íntima e na média [2]. Vários PGs estão presentes nas diferentes camadas. Na túnica média, eles contribuem para as propriedades viscoelásticas da parede do vaso. Esta função de PGs é mediada por suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAG). Devido à sua alta carga negativa, esses GAGs atraem contra-íons e água para o tecido [3,4]. Além disso, CSPGs como o versican e o agrecan são componentes essenciais dos folhetos da válvula cardíaca e, em particular, da camada média da ECM, a esponjosa, enquanto a elastina e os colágenos predominam nas camadas ventricular / atrial e fibrosa, respectivamente [5,6] (figura 2). As relações de PGs e as fibras colágenas / elásticas intercaladas fornecem um meio de equilíbrio entre rigidez e flexibilidade dos tecidos cardiovasculares [7]. Por esse motivo, a remodelação da ECM vascular por proteases secretadas por ECs e VSMCs é crucial para estabelecer as propriedades mecânicas desses tecidos. Além disso, a degradação da ECM é necessária para a migração e proliferação de VSMCs, bem como a infiltração de células inflamatórias em condições patológicas. Entre as proteases envolvidas nesta ação dinâmica, membros da família das metaloproteinases da matriz (MMP) foram extensivamente investigados devido à sua capacidade de clivar os componentes elásticos da ECM, como colágenos (MMP-1, -8, -13, -14) e elastina (MMP-12). Além disso, as proteases da família relacionada de uma desintegrina e metaloproteinases (ADAMs) exercem um papel fundamental na ECM vascular devido à sua capacidade de clivar seletivamente o ectodomínio de proteínas de membrana (derramamento). O papel dessas famílias de metaloproteinases em doenças cardiovasculares foi exaustivamente revisado em outro lugar [8,9].

Figura 1. Envolvimento das proteases ADAMTS na fisiologia e doença cardiovascular. Aterosclerose e hemostasia: diminuição da atividade da proteoglicanase (uma1) está associado ao acúmulo de proteoglicanos, aumento da internalização de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) (uma2) e formação de células de espuma (uma3), que eventualmente leva à formação de uma placa aterosclerótica. Um trombo pode se formar no topo de uma placa se o colágeno for exposto ao sangue. ADAMTS-13 regula a capacidade do Fator de von Willebrand (VWF) de recrutar plaquetas para o local de exposição do colágeno e iniciar a formação de trombos. Na aorta, atividade de proteoglicanase reduzida (uma1) causa o acúmulo de proteoglicanos, aumento da pressão osmótica, redução da viabilidade das células do músculo liso vascular (VSMC) e interrupção da detecção mecânica (b) BM, membrana basal CE, célula endotelial VWF, fator de von Willebrand.

Figura 2. Organização da matriz extracelular (ECM) em válvulas cardíacas. (uma) A composição do ECM em uma válvula madura é mostrada. A formação do ventrículo e da fibrosa durante o desenvolvimento é um processo molecular complexo e rigidamente regulado no qual ADAMTS proteases desempenham um papel essencial. (b) A atividade disfuncional do ADAMTS pode levar a um certo grau de ECM desorganizado, formato da válvula alterado e vazamento da válvula. A ECM desorganizada pode se apresentar como uma abundância de proteoglicanos, o que pode ser devido à atividade insuficiente de proteoglicanase ou possivelmente devido à montagem incorreta da ECM no ventricularis (por exemplo, microfibrilas / elastina de fibrilina-1). ADAMTS-1, -5 e -9 foram implicados no desenvolvimento da válvula cardíaca por estudos em camundongos e ADAMTS-19 por uma doença genética humana.

Esta revisão enfoca uma família de metaloprotease intimamente relacionada, a desintegrina-like e metaloproteinase com motivo de trombospondina (ADAMTS) e seu papel (patho) fisiológico no coração e vasos sanguíneos. Em humanos, a família ADAMTS compreende 19 metaloproteinases secretadas, bem como 7 proteínas semelhantes a ADAMTS desprovidas de atividade catalítica [10]. Eles compartilham uma composição de domínio comum que consiste em um peptídeo sinal, um prodomínio, um domínio catalítico de metaloproteinase (Mp, ausente nas proteínas semelhantes a ADAMTS), seguido por domínios auxiliares não catalíticos, como um domínio semelhante a desintegrina (Dis), um motivo central de trombospondina tipo I (TSR), um domínio rico em cisteína (CR), um domínio espaçador (Sp) e, com exceção de ADAMTS-4, um vários número de TSRs no terminal C (tabela 1) . Alguns membros têm domínios C-terminais adicionais, como um domínio mucina (presente em ADAMTS-7 e ADAMTS-12), um domínio semelhante a Gon-1 (em ADAMTS-20 e ADAMTS-9) e um PLAC (protease e lacunina) domínio (em ADAMTS-2, -3, -6, -10, -12, 14, -16, -17, -18 e -19). Além disso, ADAMTS-13 é único entre as proteases ADAMTS, uma vez que apresenta dois domínios CUB [subcomponente do complemento C1r / C1s / proteína embrionária de ouriço-do-mar (fator de crescimento epidérmico do ouriço-do-mar) / proteína morfogênica óssea 1] [11,12]. Uma característica comum da família é a presença de um motivo de ligação de zinco no domínio Mp, contendo a sequência de consenso H EXX H XXGXX H, na qual os três resíduos de histidina sublinhados coordenam um átomo de zinco, que juntamente com um resíduo de glutamato, exerce um papel catalítico. Este motivo é seguido no terminal C por um resíduo de metionina que constitui uma volta estrutural (volta Met) conservada dentro da família metzincina das metalopeptidases (compreendendo MMPs, ADAMs, ADAMTSs e astacinas) [13].

Tabela 1. Resumo dos papéis cardiovasculares, funções proteolíticas e organização do domínio da família ADAMTS. Para as funções e doenças cardiovasculares, os números entre parênteses indicam membros específicos da família ADAMTS. DAC, doença arterial coronariana HAP, hipertensão arterial pulmonar TAAD, aneurismas e dissecções da aorta torácica TTP, púrpura trombocitopênica trombótica VSMC, células do músculo liso vascular VWF, fator de von Willebrand WMS, síndrome de Weill-Marchesani. Os domínios de proteína ADAMTS são abreviados da seguinte forma: S, peptídeo sinal Pro, prodomínio Mp, domínio de metaloproteinase Dis, domínio semelhante a desintegrina CR, domínio rico em cisteína Sp, domínio espaçador Muc, domínio semelhante a mucina CUB, subcomponente de complemento C1r / C1s / Proteína embrionária de ouriço-do-mar Uegf (fator de crescimento epidérmico de ouriço-do-mar) / proteína morfogênica óssea 1 PL, domínio de protease e lacunina GON, domínio semelhante a gon-1.

As proteases ADAMTS são geralmente ativadas após a remoção proteolítica do prodomínio N-terminal por convertases de pró-proteína do tipo subtilisina (por exemplo, Furin, PCSK6) [14]. Com exceção do ADAMTS-13, que circula no sangue, os outros membros da família ADAMTS parecem funcionar na MEC. As enzimas ativadas secretadas são reguladas principalmente através da inibição por inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) [15] e endocitose [16].

Subfamílias ADAMTS distintas podem ser definidas com base na homologia de sequência (tabela 1). Eles provavelmente evoluíram através de um processo de duplicação de genes resultando em neofuncionalização ou subfuncionalização [17] e alguns ainda compartilham um repertório de substrato comum.

ADAMTS-1, -4, -5, -8 e -15 são caracterizados por sua capacidade de clivar PGs e são, portanto, chamados coletivamente de 'proteoglicanases'. Embora mais distantemente relacionados, ADAMTS-9 e -20 também exibem esta atividade proteolítica distinta.

ADAMTS-2 é uma N-propeptidase procolágeno bem caracterizada que cliva os pró-peptídeos N-terminais do colágeno tipo I, II e III [18]. ADAMTS-3 e ADAMTS-14 mostram um alto grau de homologia com ADAMTS-2 e podem clivar pró-colágeno em vitro. ADAMTS-3 é essencial para a linfangiogênese por meio da ativação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) -C [19,20].

Os pares relacionados ADAMTS 7/12, ADAMTS 6/10, ADAMTS16 / 18 e ADAMTS 17/19 não são bem caracterizados [21]. ADAMTS10 e ADAMTS17 mutações dão origem ao espectro semelhante à síndrome de Weill-Marchesani (WMS) e têm sido funcionalmente associadas à formação de microfibrilas de fibrilina [21]. ADAMTS-6 também demonstrou promover a formação de microfibrilas de fibrilina-1 [22].

ADAMTS-13, de longe o membro da família mais bem caracterizado, regula a função do Fator de von Willebrand (VWF) na hemostasia primária [23,24].

Considerando que os papéis não cardiovasculares dos diferentes membros da família ADAMTS foram discutidos em excelentes revisões recentes [10,14], aqui, discutiremos em detalhes o envolvimento das proteases ADAMTS na biologia e doença cardiovascular.

2. Proteoglicanos e proteoglicanases na fisiologia e doença cardiovascular

2.1. Proteoglicanos

Vários membros da família ADAMTS clivam especificamente os PGs. Porque ‘a biologia de uma protease é realmente a biologia de seus substratos’ [14], discutiremos brevemente o papel dos PGs no sistema cardiovascular. Nos vasos sanguíneos, as PGs são expressas principalmente por CEs e VSMCs na íntima e na média, respectivamente, onde regulam as propriedades biofísicas da MEC [3,19]. Além disso, por meio de suas interações com proteínas da ECM, fatores de crescimento e quimiocinas, as PGs regulam uma variedade de processos, como sinalização celular, proliferação, migração e apoptose [25]. O aumento do acúmulo de PGs é uma característica da aterosclerose [26,27] e aneurismas [28], bem como de doenças hereditárias, como doença valvar aórtica pediátrica e válvulas mitrais mixomatosas adultas [29].

PGs são classificados de acordo com o GAG predominante covalentemente ligado a resíduos de serina em seu núcleo de proteína, PGs heparina / sulfato de heparana (HS) e PGs sulfato de condroitina / dermatan (CS / DS). CS-GAGs contêm Dácido -glucurônico e N-acetil-D-galactosamina, enquanto que em DS-GAGs, o D-ácido glucurônico é epimerizado em euácido -idurônico. HS-GAGs contêm D-ácido glucurônico ou euácido -idurônico alternando com N-acetil-D-glucosamina. Os GAGs não são apenas importantes para gerar uma pressão osmótica de Donnan no tecido vascular devido às suas cargas negativas [4], mas também para mediar a captação de lipoproteínas da circulação.

O acúmulo sub-íntimo de depósitos (placas) ricos em lipídios e inflamatórios em artérias médias e grandes é uma marca registrada da aterosclerose (figura 1uma) O aumento das placas dificulta o fluxo sanguíneo normal, levando à isquemia do órgão e necrose do tecido. A ruptura da placa com subsequente formação de trombo pode causar oclusão vascular levando a eventos cardiovasculares potencialmente fatais, como infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. PGs como versican e agrecan também tendem a se acumular em aneurismas e dissecções da aorta torácica (TAAD) [28,30,31] e durante o envelhecimento normal da aorta [32], resultando em um aumento da pressão osmótica que perturba a ECM ( figura 1b) Além disso, o acúmulo de PG pode interromper a detecção mecânica por VSMCs e criar elevadores de tensão na parede aórtica que podem predispor ou propagar uma dissecção [33].

HSPGs como perlecan e os quatro sindecanos transmembrana são sintetizados principalmente por ECs na íntima e inibem processos pró-aterogênicos, como retenção de lipoproteínas, infiltração de células inflamatórias, proliferação de VSMCs e trombose [34,35]. Uma vez que HSPGs não são substratos ADAMTS principais, eles não serão discutidos em detalhes aqui. Em vez disso, vamos nos concentrar em CSPGs.

CSPGs são expressos principalmente por VSMCs na túnica média [25]. Em contraste com HSPGs, CSPGs podem iniciar processos ateroscleróticos, aumentando a deposição e internalização de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) que penetraram na parede arterial após transcitose ou disfunção endotelial [27,36] (figura 1uma) CSPGs podem formar complexos de alta afinidade com partículas de LDL, que são então internalizadas de forma mais eficiente por VSMCs e macrófagos infiltrados do que LDLs nativas [37,38]. Uma vez internalizadas, as LDLs aumentam a síntese intracelular de éster de colesterol e a formação de espuma subsequente [39]. A interação entre lipoproteínas e CSPGs envolve uma ligação iônica entre os aminoácidos básicos na apoproteína B (apoB) e grupos sulfato carregados negativamente nos GAGs [40]. Além disso, quanto mais longas as cadeias de CS, maior a afinidade pelo LDL [41]. Para apoiar a noção de que a ligação direta de partículas de LDL a CSPGs é uma etapa chave na aterogênese, camundongos transgênicos expressando partículas de LDL onde aminoácidos carregados positivamente em apoB foram substituídos por neutros exibindo significativamente menos lesões ateroscleróticas do que camundongos expressando apoB de tipo selvagem [42]. Os CSPGs compreendem grandes PGs de agregação, como versican e agrecan, e pequenos PGs ricos em leucina (SLRPs), como biglycan e decorin. Devido à sua capacidade de ligar hialuronano, o único GAG não sulfatado, e lectinas, os grandes agregados de PGs também são chamados de hialectanos [43]. Os hialectanos têm uma estrutura semelhante, compreendendo dois domínios globulares nos terminais N e C, denominados G1 e G3, respectivamente, e um domínio GAG central contendo locais de ligação para as cadeias GAG. O domínio G1 se liga ao hialuronano, enquanto o domínio G3 contém a região de ligação à lectina (figura 1uma).

Versican é o principal hialectan na vasculatura, onde desempenha um papel nos processos de desenvolvimento e reparo, como adesão, proliferação e migração celular, montagem de MEC e inflamação [25,26,44]. Está presente em 5 isoformas (V0-V4), geradas por splicing alternativo na região central rica em GAG. A expressão do versican é essencial para o desenvolvimento normal do coração e dos vasos sanguíneos [45,46]. O versican está envolvido em vários aspectos do desenvolvimento da lesão vascular e está presente em placas ateroscleróticas, lesões reestenóticas, lesões que surgem durante o reparo do enxerto e lesões aneurismáticas [27] . Os níveis versicanos aumentam dramaticamente na aterosclerose [27,47], sugerindo que seu acúmulo pode ser em parte responsável pelo aumento da deposição / internalização de LDL na parede do vaso (figura 1uma).

Aggrecan, um importante CSPG na cartilagem, foi recentemente identificado em aortas humanas [28,30,31,48-53] e, junto com o versican, demonstrou se acumular nas aortas de pacientes com TAAD, resultando em um aumento pressão osmótica que perturba o ECM [30] (figura 1b) Aqui, é importante notar que agrecan tem uma ordem de magnitude mais CS do que versican [54] e, portanto, mais potencial para exercer pressão osmótica. Além de CS, agrecan também contém GAGs de sulfato de queratana (KS) (onde o D-galactose substitui o ácido hexurônico) agrupado em uma região rica em KS [54].

O núcleo da proteína de SLRPs como o biglycan é pequeno (40–60 kDa) e caracterizado pela presença de 11–12 repetições em tandem ricas em leucina e a fixação de 1–2 cadeias de GAG ​​CS / DS [55]. As repetições em tandem, ricas em leucina, ligam-se aos colágenos, regulando assim a formação de fibrilas de colágeno [56-58].

Biglycan é um dos principais PGs encontrados em lesões ateroscleróticas humanas [59-62]. Assim como o agrecan e o versican, o biglycan se liga às partículas de LDL, embora com afinidade reduzida devido ao menor número de cadeias GAG [63]. Bgn camundongos knockout não mostraram retenção reduzida de LDL na parede arterial, provavelmente devido à compensação de outros CSPGs [64].No entanto, a superexpressão de biglycan em camundongos aumentou a retenção arterial de lipoproteínas apoB e promoveu aterosclerose [62,65]. O biglycan também pode exercer uma função anti-aterosclerótica. Em camundongos geneticamente suscetíveis a desenvolver lesões ateroscleróticas (já apresentando deleção de qualquer apolipoproteína-E, ApoE, ou receptor de LDL, LDLR), a abolição da expressão do biglycan aumentou a inflamação da placa mediada por macrófagos [64]. O biglycan também é considerado um iniciador precoce da lesão de estenose aórtica, contribuindo para o espessamento da parede [66]. Além disso, o biglycan está implicado na formação do TAAD, desde Bgn/LDLR camundongos knockout duplo mostraram aumento na incidência de TAAD [67] e perda de mutações de função em Bgn resulta em TAAD de início sindrômico precoce em humanos [68]. Bgn camundongos knockout também mostraram aneurismas de aorta abdominal espontâneos (AAA) [69]. Uma vez que a deficiência de biglycan prejudica a formação de fibras de colágeno na parede aórtica e contribui para a quebra das fibras elásticas [67,70], isso afetará a capacidade do vaso de sustentar as forças de tensão.

2.2. Proteoglicanases

Os níveis fisiológicos de PGs são regulados pela atividade de proteoglicanase de vários membros da família ADAMTS. Foi demonstrado que ADAMTS-1, -4, -5, -8, -9, -15 e -20 clivam, embora em uma extensão diferente, ambos versican [71-75] e agrecan [76]. A única clivagem ADAMTS da isoforma versican V1 descrita até o momento ocorre na ligação Glu441 ↓ 442Ala dentro do βDomínio GAG [71-75]. Os locais de clivagem equivalentes no αA região GAG nas isoformas V0 e V2 foram identificadas como Glu1428 ↓ 1429Ala [71] e Glu405 ↓ 406Gln, respectivamente [77]. O agrecano é clivado por proteases ADAMTS em vários locais [78], embora o evento de clivagem mais prejudicial para sua função ocorra na ligação Glu392 ↓ Ala393 (numeração Uniprot P16112) na região entre os domínios G1 e G2 [79]. É importante notar que a clivagem mediada por ADAMTS de agrecan e versican demonstrou liberar fragmentos bioativos. O fragmento de clivagem G1-DPEAAE 441 versican V1, denominado versikine, está envolvido em uma variedade de processos biológicos, como sinalização imunológica [80] e apoptose [81], enquanto o fragmento de clivagem G1-NIVSFE 405 V2 foi identificado como um hialuronan- proteína de ligação previamente identificada no cérebro humano [77]. Foi demonstrado que um fragmento de agrecan de 32 aminoácidos gerado por clivagem mediada por MMP em Asn360 ↓ Phe361 e clivagem mediada por ADAMTS em Glu392 ↓ Ala393 interage com o receptor 2 do tipo toll e excita neurônios nociceptivos em condrócitos [82,83] . Após a clivagem de ADAMTS em Glu392 ↓ Ala393, o neopeptídeo 393 ARGS pode se difundir da ECM para o plasma, urina e fluido sinovial [84,85]. Entre as proteases ADAMTS mencionadas, ADAMTS-4 e -5 mostram a atividade proteolítica mais forte contra agrecan [86,87] e versican [88], além disso, eles também mostraram clivar o biglicano SLRP em Asn186 ↓ 187Cys [86,89 ] Essa atividade de proteoglicanase exerce funções importantes na biologia vascular e pode contribuir para doenças cardiovasculares, como aterosclerose e aneurismas, conforme descrito nas seções a seguir.

2.2.1. ADAMTS-1: amigo (em TAAD) ou inimigo (em aterosclerose)?

ADAMTS-1 foi o primeiro membro da família a ser descrito [90]. Os primeiros modelos de nocaute murino mostraram o envolvimento desta enzima na fertilização e no desenvolvimento do sistema urogenital [91-94], mas logo foi reconhecido que ADAMTS-1 desempenha um importante papel cardiovascular. O repertório do substrato de ADAMTS-1 parece se estender além dos CSPGs agrecan [95] e versican [88]. Relatado em vitro substratos incluem nidogênio-1 e -2 [96,97], semaforina 3C [98], inibidor da via do fator tecidual (TFPI) -2 [99], proteína de ligação do fator de crescimento da insulina (IGFBP) -2 [100], sindecan-4 [101] e trombospondinas 1 e 2 [98,102]. Atividade da versicanase ADAMTS-1 em vitro é consideravelmente mais fraco do que o ADAMTS-4 ou ADAMTS-5 [88], mas parece biologicamente importante em certos processos de desenvolvimento, como a foliculogênese [94]. Estudos em ratos sugerem que a atividade da ADAMTS-1 versicanase dentro do coxim endocárdico contribui para a maturação da válvula e trabeculação miocárdica [103,104]. No entanto, a proteólise ADAMTS-1 de substratos não-PG ou atividades não proteolíticas podem ser parcialmente responsáveis ​​por esses fenótipos.

Nos vasos sanguíneos, ADAMTS-1, como ADAMTS-4 e -5, é expresso por ECs, VSMCs e macrófagos invasores [105-108]. A expressão de ADAMTS-1 foi regulada positivamente em lesões ateroscleróticas humanas [105] e sua atividade de versicanase pode contribuir para a instabilidade da placa [71,105]. Camundongos transgênicos superexpressando Adamts1 em um ApoE - / - antecedentes foram investigados por Jönsson-Rylander et al. [107], mas medidas de formação de lesão aterosclerótica não foram relatadas. No entanto, a ligação da artéria carótida nesses camundongos mostrou um aumento significativo na formação da neo-íntima, sugerindo um efeito de ADAMTS-1 na migração / proliferação de VSMC (tabela 2). Em apoio a isso, dois miRNAs direcionados ADAMTS1, miR-265b-3p e miR-362–3p, pareceram inibir a proliferação e migração de VSMC [123,124].

Mesa 2. Adamts ratos knockout e superexpressão na Vivo. AB, hipertrofia cardíaca induzida por bandagem aórtica BAV, válvula aórtica bicúspide AngII, angiotensina II PAH, hipertensão arterial pulmonar PPS, polissulfato de pentosano TAAD, aneurismas de aorta torácica e dissecções. A manipulação genética é em camundongos, se não for especificado de outra forma.

Também foi relatado que a angiotensina II (Ang II) e outros estímulos associados à remodelação vascular induzem a expressão de ADAMTS-1 na aorta [125]. Desde a Adamts1 camundongos knockout têm mortalidade perinatal elevada [92], heterozigotos Adamts1 +/− ratos foram testados em um modelo TAAD [109]. o Adamts1 +/− genótipo exacerbou aneurismas aórticos e dissecções letais de aorta induzidas pelo tratamento com o fator hipertensivo Ang II. A administração de TAAD induzida por Ang II em quase 80% dos Adamts1 +/− camundongos e dissecções letais da aorta em quase 50% desses camundongos, em comparação com quase 10 e 8% em camundongos do tipo selvagem [109]. Este fenótipo se assemelha ao de Fbn1 C1039G / + , um modelo de camundongo da síndrome de Marfan (MFS) caracterizado por uma baixa incidência de dissecções e rupturas da aorta em comparação com outros modelos de camundongo MFS [126]. Nestes 'ratos Marfan', o introduzido Fbn1 a mutação C1039G interrompe o arcabouço de microfibrilas, que tem efeitos de arrastamento complexos (incluindo níveis diminuídos de proteína ADAMTS-1) devido às muitas complexidades mecanísticas do nicho de microfibrilas de fibrilina e seus papéis na formação de fibra elástica, sinalização de fator de crescimento e biologia de VSMC [127,128 ] No entanto, em aneurismas aórticos humanos, os níveis de ADAMTS-1 estão inalterados ou aumentados [30,129,130].

Em conclusão, esses achados sugerem que ADAMTS-1 pode desempenhar um papel prejudicial na etiologia da aterosclerose, enquanto mais estudos são necessários para estabelecer seu envolvimento no desenvolvimento de aortopatias.

2.2.2. ADAMTS-4, um potencial alvo terapêutico na aterosclerose e TAAD

ADAMTS-4 cliva CSPGs como versican e agrecan [87,88], brevican [131] e SLRPs como fibromodulina [86,87] e biglycan [86,89], bem como substratos não-PG, como proteína de matriz oligomérica de cartilagem (COMP) [132].

Embora ADAMTS-4, como todos os outros membros da família ADAMTS, com exceção de ADAMTS-13, esteja predominantemente ligado à ECM [86,87], pode se difundir para o plasma após dano cardiovascular. Níveis plasmáticos elevados de ADAMTS-4 foram encontrados de forma consistente em pacientes afetados por doença arterial coronariana (DAC) [129,133–135], aterosclerose [106,136–138] e TAAD [112,129]. Alguns desses estudos associaram níveis plasmáticos elevados de ADAMTS-4 com aumento da gravidade de DAC [134,136] e desestabilização da placa [137,138]. Níveis aumentados de ADAMTS-4 também foram encontrados em áreas ricas em macrófagos de placas ateroscleróticas humanas e placas coronárias instáveis ​​[106,138]. É importante ressaltar que esses achados em humanos estão de acordo com aqueles obtidos a partir de vários modelos de camundongos (tabela 2). Os níveis de ADAMTS-4 mostraram aumentar nas placas ateroscleróticas e no plasma de ApoE nocaute [111,138] e LDLR - / - ApoB 100/100 [99] camundongos com duplo nocaute conforme a aterosclerose progredia. Além disso, a deleção genética de Adamts4 em um ApoE O fundo de nocaute produziu um fenótipo aterosclerótico mais brando, com estabilidade de placa aumentada em comparação com seus irmãos de ninhada [111]. ApoE/Adamts4 camundongos double knockout também mostraram redução da clivagem de versican e agrecan nas artérias, sem compensação mostrada por outras proteoglicanases como ADAMTS-1 e −5. Isso foi associado com redução da deposição de lipídios e infiltração de macrófagos, mas aumento da proliferação de VSMC [111]. Além disso, na ausência de ADAMTS-4, aumento da apoptose de macrófagos e diminuição dos níveis de citocinas pró-inflamatórias foram observados [111]. Esses dados sugerem que a atividade de ADAMTS-4 está associada a placas ateroscleróticas mais instáveis. Portanto, a inibição terapêutica de ADAMTS-4 pode ser benéfica nos estágios finais do desenvolvimento aterosclerótico.

Exclusão de Adamts4 foi mostrado para reduzir significativamente o aumento do diâmetro aórtico, formação de aneurisma, dissecção e ruptura da aorta em um modelo de camundongo de TAAD esporádico induzido por uma dieta rica em gordura e infusão de AgII [112]. Esses fenótipos foram associados à diminuição da infiltração de macrófagos, apoptose de VSMC e degradação de versican [112]. Expressão de Adamts4 é aumentado após o tratamento com Ang II e injeção de miR-126a-5p, um miRNA direcionado Adamts4, foi recentemente demonstrado que reduz a dilatação da aorta e a degradação do versican, bem como aumenta a sobrevivência desses camundongos [139]. A regulação negativa severa deste miRNA pode ser um dos mecanismos responsáveis ​​pela regulação positiva observada de Adamts4 expressão no modelo Ang II [139].

Em vitro, ADAMTS4 foi demonstrado que o knockdown reduz a infiltração de macrófagos [129] e a apoptose de VSMC [112], dois processos que são críticos para o desenvolvimento de aneurismas aórticos [140] e o arrebatamento da placa [141]. Em ambos os casos, a atividade da versicanase do ADAMTS-4 pode desempenhar um papel. Versican completo é dotado de propriedades adesivas e sua clivagem por proteoglicanases ADAMTS facilita a migração de células imunes [80,142]. Além disso, o versikine, o fragmento de clivagem do versican gerado pelo ADAMTS, pode promover a apoptose [81], antagonizando assim o efeito anti-apoptótico do versican de comprimento completo [143,144]. ADAMTS-4 também pode estar diretamente envolvido na apoptose de VSMCs após a translocação para o núcleo e clivagem da poli ADP ribose polimerase-1 (PARP-1), uma molécula chave no reparo de DNA e sobrevivência celular [112]. PARP-1 de comprimento total promove a sobrevivência celular, enquanto PARP-1 clivada pode induzir apoptose [145]. Finalmente, foi demonstrado que ADAMTS-4 exerce efeitos pró-apoptóticos independentemente de sua atividade catalítica [146], sugerindo que ADAMTS-4 pode induzir apoptose por meio de diferentes mecanismos.

Curiosamente, a expressão de ADAMTS-4 foi aumentada no miocárdio de ratos submetidos a hipertensão e a adição de polissulfato de pentosana inibiu ambos Adamts4 expressão e clivagem versican e função miocárdica melhorada [147].

Essas observações clínicas e na Vivo dados de modelos de camundongos da doença apontam para papéis múltiplos de ADAMTS-4 em tecidos cardiovasculares doentes. Se a inibição terapêutica de ADAMTS-4 pode retardar a progressão da doença vascular, em particular, justifica uma investigação mais aprofundada.

2.2.3. ADAMTS-5 regula os níveis de proteoglicanos cardiovasculares

ADAMTS-5 foi extensivamente estudado no contexto da degradação de agrecan na cartilagem e é um alvo validado para o tratamento da osteoartrite [148]. Mais recentemente, um papel cardiovascular emergiu para ADAMTS-5, que foi recentemente revisado [148] e será resumido brevemente aqui.

Em vitro, ADAMTS-5 é uma proteoglicanase mais potente do que ADAMTS-1 e -4 [87,88] e a ausência de ADAMTS-5 na Vivo causa acúmulo de PGs cardiovasculares (tabela 2). Por exemplo, Adamts5 camundongos knockout mostraram graves anomalias nas cúspides da válvula pulmonar devido à diminuição da clivagem de versican e subsequente acúmulo de versican e agrecan [53,113,114] da mesma forma, eles exibiram dilatação da aorta torácica com acúmulo de agrecan e biglycan [51]. Seria interessante comparar este fenótipo com o de camundongos knock-in que expressam versican resistente à clivagem de ADAMTS (isto é, mutado no sítio Glu1428 ↓ 1429Ala), chamados camundongos V1R, mas infelizmente seu fenótipo cardiovascular não foi descrito [149]. Enquanto a maioria dos camundongos V1R eram viáveis ​​e férteis, alguns deles morrem de hemorragia de órgãos após retrocruzamento [149].

ADAMTS-5 foi encontrado para ser significativamente reduzido em aortas de ApoE camundongos knockout, que desenvolveram espontaneamente lesões ateroscleróticas, resultando no acúmulo de versican e biglycan [150]. ADAMTS-5 recombinante reduziu a capacidade de ligação de LDL do biglycan e liberou partículas de LDL de lesões aórticas humanas [150], sugerindo assim um papel para esta enzima na regulação da retenção de lipoproteína mediada por PG (figura 1uma) ADAMTS-5 é expresso em ambos VSMCs [151,152] e macrófagos [106], dois tipos de células que também expressam versican [151,153-155] e TIMP-3 [156-158], o principal inibidor de ADAMTS-4 e -5 [ 15]. Uma vez que a placa é formada, sua estabilidade está associada a altos níveis de expressão de TIMP-3 [158,159] e versican [160]. Portanto, o desenvolvimento da placa aterosclerótica é impactado por um desequilíbrio entre a expressão de proteoglicanases, inibidores de proteoglicanases e PGs, onde cada proteína pode exercer um papel benéfico / prejudicial em diferentes estágios do processo.

Em estudos de TAAD, os níveis de mRNA de ADAMTS-5 estão diminuídos [30,161] e isso foi recentemente confirmado em nível de proteína, tanto no plasma quanto em biópsias aórticas [152]. Modelos de camundongo de TAAD podem ajudar a esclarecer o papel de ADAMTS-5 nesta doença. No modelo Ang II, Adamts5 camundongos knockout mostraram aumento da dilatação da aorta, sugerindo que ADAMTS-5 desempenha um papel não redundante na manutenção das propriedades viscoelásticas da ECM aórtica [51]. A perda de ADAMTS-5 foi associada a níveis elevados de proteína de versican e TGF-β [50], um jogador crucial no desenvolvimento de TAAD [160]. Ao mesmo tempo, a expressão da proteína-1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP-1) foi regulada para baixo [50], um fenômeno que já foi mostrado para exacerbar a dilatação da aorta [162]. Notavelmente, neste modelo, um aumento nos níveis de proteína ADAMTS-1 não compensou a ausência de ADAMTS-5, uma vez que a clivagem do versican foi severamente diminuída [50]. Isso pode ser explicado pela maior atividade da versicanase intrínseca do ADAMTS-5 [88].

Tomados em conjunto, esses dados sugerem que a atividade proteolítica de ADAMTS-5 é essencial na regulação dos níveis de PGs cardiovasculares e que os distúrbios podem afetar o processo de doença na aterosclerose e TAAD. Como consequência, qualquer tratamento para a osteoartrite deve ter como objetivo poupar a atividade do ADAMTS-5 nos vasos sanguíneos para evitar o desequilíbrio nos níveis de PG [148].

2.2.4. ADAMTS-8, um contribuinte para a hipertensão arterial pulmonar

As propriedades enzimáticas de ADAMTS-8, incluindo seu repertório de substrato, não foram extensivamente investigadas. O único substrato relatado é agrecan, que foi clivado em vitro, mas em uma razão enzima / substrato extremamente alta [163]. Apesar da homologia de ADAMTS-8 com ADAMTS-1, -4 e -5, esses dados lançam dúvidas sobre a inclusão de ADAMTS-8 na subfamília de proteoglicanase. ADAMTS8 foi identificado como um gene supressor de tumor em vários tipos de câncer [164] e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no ADAMTS8 locus foram associados à hipertensão em um estudo de associação do genoma (GWAS) [165]. Ao nível da proteína, ADAMTS-8 é altamente expresso no pulmão e no coração [119,166] e, juntamente com ADAMTS-1, -4 e -5, foi detectado em lesões carotídeas humanas e placas ateroscleróticas coronárias avançadas [106,107]. A expressão de ADAMTS-8 foi aumentada nos pulmões de pacientes com hipertensão arterial pulmonar (HAP) e em modelos de HAP em camundongo / rato [119]. Em um modelo de HAP induzida por hipóxia, camundongos com uma deleção direcionada de Adamts8 nas células do músculo liso arterial pulmonar (Adamts8 ΔSM22α ) mostraram diminuição da pressão sistólica ventricular direita e hipertrofia ventricular direita em comparação com camundongos do tipo selvagem, sugerindo um papel crucial para ADAMTS-8 no desenvolvimento de HAP [119]. A adição de ADAMTS-8 recombinante a CE de artéria pulmonar pareceu exercer um papel pró-inflamatório e pró-apoptótico [119], semelhante a seus efeitos nas linhas de células de carcinoma nasofaríngeo [167]. Esses dados sugerem semelhanças potenciais entre a função de ADAMTS-8 na HAP e no câncer. Uma vez que ADAMTS-8 também é expresso no coração, um modelo de nocaute condicional com deleção específica de cardiomiócitos de Adamts8 (Adamts8 ΔαMHC ) foi gerado [119]. Esses camundongos mostraram diminuição da hipertrofia cardíaca, fibrose e disfunção ventricular direita em resposta à hipóxia.

Tomados em conjunto, esses resultados implicam ADAMTS-8 no desenvolvimento de HAP e potencialmente outros fenótipos cardiovasculares, mas mais estudos são necessários para caracterizar o repertório do substrato de ADAMTS-8, mecanismo de ação e regulação.

2.2.5. ADAMTS-9 no desenvolvimento do coração

Evolutivamente, ADAMTS-9 parece ser o membro da família mais velho, com base em sua alta homologia com nematóides e proteases de mosca da fruta, denominadas Gon-1 e Adamts-A, respectivamente [72,168-170]. É também o maior membro da família ADAMTS, compreendendo 14 repetições de TSR e um domínio semelhante a Gon-1 no terminal C (tabela 1).

Adamts9 camundongos knockout não sobreviveram após 7,5 dias de gestação por razões desconhecidas, mas possivelmente devido a um papel importante da ADAMTS-9 na formação e função dos cílios primários [171,172]. Camundongos knockout heterozigotos mostraram uma penetrância variável de anomalias cardíacas envolvendo o miocárdio, válvulas mitrais, válvulas aórticas e aorta proximal, associada ao excesso de versican [120], sugerindo que esta enzima está envolvida no desenvolvimento do coração (tabela 2).

Em um estudo de expressão gênica associada à ruptura do AAA, os tecidos aórticos do reparo de emergência do AAA rompido foram comparados com o tecido da cirurgia eletiva. Isso identificou um conjunto de 5 genes expressos por fibroblastos exclusivamente regulados positivamente em AAA, incluindo ADAMTS9 [173].

3. ADAMTS-7 na doença arterial coronariana

ADAMTS-7 é um potencial alvo terapêutico na aterosclerose e doenças associadas, como DAC.A evidência de um papel prejudicial acumulou-se ao longo da última década e inclui 1) redução da aterosclerose após ablação do Adamts7 gene em camundongos (tabela 2) 2) GWAS que mostram uma associação de ADAMTS7 SNPs com CAD e 3) detecção imunohistoquímica de ADAMTS-7 em placas ateroscleróticas humanas.

Nocaute de Adamts7 em um fundo aterosclerótico reduziu a área total de lesão aterosclerótica na aorta de Adamts7 −/− /ApoE - / - camundongos em 62% (machos) e 54% (fêmeas) em comparação com os controles do companheiro de ninhada. No Adamts7 −/− /Ldlr - / - camundongos, as reduções foram de 37% e 52%, respectivamente [116]. Esses achados sugerem que a inibição farmacológica da atividade de ADAMTS-7 pode retardar a progressão da aterosclerose. Adamts7 Os camundongos - / - também mostraram uma resposta alterada de VSMCs à lesão do fio arterial [116,117]. Eles mostraram formação de neoíntima muito reduzida após lesão vascular, que tinha sido vista anteriormente em ratos após Adamts7 knockdown com siRNA em um modelo de lesão por balão [118]. Usando o mesmo modelo, o efeito oposto foi visto quando ADAMTS-7 foi superexpresso [118]. Esses efeitos do ADAMTS-7 em VSMC na Vivo concordo com as descobertas em vitro [116–118,174].

GWAS mostrou que SNPs no ADAMTS7 locus estão associados com CAD [174]. O SNP que se acredita causar a associação é rs3825807, do qual o alelo G está associado a um risco reduzido de DAC. Causa uma substituição de serina por prolina na posição 214 do prodomínio de ADAMTS-7. A prolina está localizada perto de motivos de reconhecimento de convertases de pró-proteínas semelhantes à subtilisina, como furina e PCSK6, que ativam ADAMTS-7 por remoção proteolítica do prodomínio inibitório. A prolina demonstrou dificultar a remoção do prodomínio, o que consequentemente reduz a ativação de ADAMTS-7 [174] e, potencialmente, medeia o risco reduzido de DAC associado ao alelo G. VSMCs do genótipo G / G para rs3825807 também migrou menos em vitro em comparação com o genótipo A / A.

A imunohistoquímica de placas ateroscleróticas humanas identificou a proteína ADAMTS-7 [174,175]. Nas placas carotídeas, os níveis de ADAMTS-7 foram aumentados em pacientes com sintomas cerebrovasculares em comparação com pacientes sem esses sintomas e níveis elevados também se correlacionaram com risco aumentado de eventos cardiovasculares pós-operatórios [175].

Diversos em vitro substratos de ADAMTS-7 foram relatados na literatura, mas ligações claras com aterosclerose e comportamento de VSMC não foram estabelecidas [117,176,177]. O método baseado em espectrometria de massa de marcação isotópica de amina terminal de subestados (TAILS) foi usado para identificar substratos de ECM potenciais, que identificaram a proteína de ligação 4 de TGF-β latente (LTBP4) como um substrato [178]. LTBP4 é um componente de microfibrilas / fibras elásticas no pulmão e grandes vasos sanguíneos e também é co-expresso com ADAMTS-7 no coração [179,180]. Ele se liga a várias proteínas da ECM, incluindo fibrilina-1, fibulina-4 e fibulina-5, que são essenciais para a formação de fibras elásticas em grandes vasos sanguíneos [179,181,182]. A proteólise de LTBP4 por ADAMTS-7 provavelmente afeta esse processo, mas isso ainda precisa ser investigado na Vivo. O significado da proteólise de LTBP4 por ADAMTS-7 para a aterosclerose também não está claro. No entanto, um relatório recente mostrou que o LTBP4 gene foi diferencialmente expresso entre as placas de pacientes sintomáticos e assintomáticos [183], sugerindo que o LTBP4 pode afetar a composição das placas ateroscleróticas.

Enquanto vários outros membros da família ADAMTS são regulados pelo inibidor endógeno de metaloprotease TIMP-3, ADAMTS-7 é mais suscetível à inibição por TIMP-4, que inibiu ADAMTS-7 eficientemente em baixas concentrações nanomolares [178]. Tanto o TIMP-4 quanto o ADAMTS-7 têm uma distribuição tecidual restrita com expressão particularmente abundante em tecidos cardiovasculares adultos [116,184].

Em resumo, ADAMTS-7 é um potencial alvo terapêutico em DAC e doenças relacionadas decorrentes da aterosclerose, mas mais pesquisas são necessárias para validá-lo como um alvo e permitir um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos.

4. ADAMTS-13, púrpura trombocitopênica trombótica e acidente vascular cerebral

ADAMTS-13 circula no sangue a uma concentração de aproximadamente 6 nM, onde corta multímeros de VWF recentemente segregados que, de outra forma, seriam muito trombogênicos [185] (figura 1uma) A atividade ADAMTS-13 muito baixa (menos de 10%) causa a doença TTP e a atividade ADAMTS-13 moderadamente baixa está associada ao AVC isquêmico, que também é uma característica da TTP. No TTP, os multímeros do VWF que são muito longos agregam espontaneamente as plaquetas na ausência de dano endotelial [186]. A PTT é uma condição rara e com risco de vida que se apresenta mais comumente em adultos jovens e de meia-idade previamente saudáveis, com uma incidência anual de 6 por milhão no Reino Unido [187,188]. Eles mostram anemia hemolítica microangiopática grave (MAHA), trombocitopenia grave e lesão de órgão-alvo. Os órgãos mais comumente afetados são o coração, cérebro, rins e trato gastrointestinal [189]. O MAHA é o resultado dos microtombos que obstruem os pequenos vasos e danificam os glóbulos vermelhos, enquanto a trombocitopenia grave é causada pelo consumo das plaquetas que ficam presas nos microtrombos. O dano ao órgão-alvo resulta da oclusão dos pequenos vasos que oxigenam os órgãos [188]. Em uma pequena minoria de pacientes com TTP, a atividade da ADAMTS-13 é baixa por causa de mutações hereditárias na região codificadora do ADAMTS13 gene [189]. A forma mais comum de TTP é a TTP imunomediada (iTTP), envolvendo autoanticorpos contra ADAMTS-13, que eliminam rapidamente a enzima da circulação e inibem sua atividade, impedindo a ligação ao seu substrato VWF [190]. Os autoanticorpos que têm como alvo os domínios N-terminais até o domínio Sp podem ser inibitórios, em linha com a descoberta de vários exositos nesses domínios [190-195]. O tratamento do iTTP atualmente consiste em troca de plasma (PEX) para remover autoanticorpos patogênicos e fornecer ADAMTS-13, em conjunto com Rituximabe para suprimir a produção de autoanticorpos [186,196]. O PEX é fundamental e salva vidas quando os pacientes se apresentam no hospital em caso de emergência. Mais recentemente, o PEX também é suplementado com Caplacizumab, um construto que consiste em dois anticorpos de domínio único fundidos que têm como alvo o mesmo epítopo no domínio A1 do VWF e reduzem a agregação plaquetária [197]. O ADAMTS-13 recombinante está atualmente passando por um ensaio clínico de Fase 2, no qual é usado para complementar o PEX em pacientes com iTTP com o objetivo de acelerar a recuperação e reduzir o uso de PEX (ClinicalTrials.gov: NCT03922308). Enquanto a maioria dos agentes antitrombóticos apresenta risco de sangramento, isso é improvável para ADAMTS-13 recombinante devido ao mecanismo único pelo qual sua atividade é regulada. Não é regulado por um inibidor fisiológico (por exemplo, TIMPs, [198]), mas pela disponibilidade limitada e condicional de exositos de VWF e ligações cindíveis. Estes são normalmente enterrados dentro do domínio VWF A2 globular e apenas expostos quando o domínio A2 se desdobra sob tensão de cisalhamento elevada na circulação [199-201]. O VWF ultralongo sofre tensão de cisalhamento elevada quando sai do endotélio e entra na circulação, causando proteólise por ADAMTS-13, que reduz o tamanho do multímero e, assim, reduz a força de tração exercida sobre a molécula, impedindo o desdobramento e clivagem do VWF A2 domínios [199,202]. VWF é o único substrato relatado de ADAMTS-13. A especificidade da protease é conferida por exositos em vários domínios ADAMTS-13 que ligam exositos complementares no terminal C do domínio A2 do VWF à ligação cindível [193,194,203-205]. Além disso, os subsites no domínio Mp acomodam as cadeias laterais do VWF em ambos os lados da ligação cindível e aumentam a especificidade geral da enzima [204,206,207].

Enquanto os níveis de atividade do ADAMTS-13 menores que 10% podem causar TTP, os níveis baixos que se enquadram na faixa normal (quartil inferior) estão associados ao risco aumentado de desenvolver AVC isquêmico [208-210]. Em pacientes que apresentam lesão cerebral isquêmica aguda, a proporção dos níveis de antígeno VWF para a atividade ADAMTS-13 (VWF: Ag / ADAMTS-13Ac) prediz mortalidade e está associada ao impacto na função cerebral em sobreviventes [211]. Além disso, em pacientes com PTT que se recuperaram e estão em remissão, níveis mais baixos de atividade da ADAMTS13 após a recuperação estão associados a acidente vascular cerebral [212]. Em modelos animais de acidente vascular cerebral isquêmico, a administração de ADAMTS-13 recombinante após um acidente vascular cerebral parece ser benéfica [213,214].

5. Outros membros da família ADAMTS

5.1. A procolagenase ADAMTS-2 no reparo miocárdico

ADAMTS-2 é a principal enzima que cliva o N-propeptídeo do procolágeno tipo I, permitindo assim a montagem de trímeros de colágeno em fibrilas / fibras [215]. Embora tenha sido estudado principalmente na pele, também pode ocorrer em outros tecidos. Por exemplo, a análise de corações de pacientes cardiomiopatas mostrou sobrerregulação de ADAMTS2, o que pode refletir o importante papel do colágeno na reparação e cicatrização do miocárdio. O colágeno que é depositado para "reparar" o dano miocárdico requer a remoção do prodomínio por ADAMTS-2 para que as fibras de colágeno se formem. É provável que o aumento da expressão de colágeno exija um aumento da expressão de ADAMTS-2. Isso também pode explicar a alteração Adamts2 expressão em camundongos tratados com isoproterenol, que induz miopatia cardíaca e hipertrofia [216] (tabela 2). Em umdamts2 camundongos nulos, os efeitos prejudiciais da sobrecarga de pressão no coração foram aumentados [110], possivelmente devido a mecanismos de reparo perturbados envolvendo o colágeno.

5,2 ADAMTS-6 no desenvolvimento do coração e duração do QRS

ADAMTS6 O mRNA foi detectado no coração de camundongo, especificamente no trato de saída, válvulas, átrios e miocárdio ventricular [115]. A função fisiológica do ADAMTS-6 não é conhecida, mas em vitro estudos sugerem que pode estar relacionado com o de microfibrilas de fibrilina-1 e aderências focais [22]. É importante ressaltar que ADAMTS-6 foi implicado na biologia cardíaca por um GWAS, que descobriu que dois ADAMTS6 variantes missense (S90 L e R603 W) foram associadas à duração do intervalo QRS do eletrocardiograma [115], que reflete a despolarização ventricular cardíaca. Um QRS prolongado é um preditor de mortalidade tanto na população geral quanto em pacientes afetados por doença cardiovascular [217–219]. As variantes missense S90 L no prodomínio e R603 W no primeiro domínio semelhante a TSP-1 prejudicam gravemente a secreção de proteínas [115]. Surpreendentemente, S90 L foi associado com QRS mais longo e R603 W com duração QRS mais curta. Em pessoas de ascendência europeia, aproximadamente 1/500 é heterozigoto para a variante S90 L, enquanto R603 W é raro em indivíduos de ascendência europeia, mas é comum em pessoas de ascendência africana, onde aproximadamente 1/70 é heterozigoto (https: // gnomad .broadinstitute.org /). Ambas as variantes podem, no entanto, ser patogênicas em um estado homozigoto e / ou funcionar como fatores de risco para doença cardíaca na forma heterozigótica. Um papel cardíaco para ADAMTS-6 também está de acordo com os defeitos cardíacos congênitos fatais de camundongos homozigotos para uma mutação nula em Adamts6, que morrem no período pré / peri-natal [115]. Seus defeitos cardíacos embrionários compreendem a dupla saída do ventrículo direito, um defeito do septo atrioventricular e hipertrofia ventricular. Curiosamente, os camundongos hemizigóticos para a mutação nula são viáveis ​​e não apresentam defeitos cardíacos estruturais, mas seus ventrículos expressam baixos níveis de proteína conexina-43, a principal proteína de junção de lacuna miocárdica no coração de camundongo e humano. Os níveis reduzidos de conexina-43 parecem ter uma causa pós-transcricional, como os níveis de mRNA do gene correspondente (Gja1) não foram afetados [115]. Em resumo, esses achados sugerem que ADAMTS-6 pode desempenhar um papel no desenvolvimento do coração e na regulação da despolarização ventricular mediada por junções comunicantes.

5.3. ADAMTS-10 e manifestações cardiovasculares da WMS

Mutações em ADAMTS10 causar uma forma autossômica recessiva de WMS [220–222]. WMS é uma doença hereditária rara dos tecidos conjuntivos caracterizada por baixa estatura, braquidactilia, rigidez articular, crânio largo, defeitos cardíacos e uma variedade de anormalidades oculares [222,223]. Três distintos ADAMTS10 mutações foram identificadas em duas famílias consanguíneas e em um caso esporádico de WMS, incluindo uma mutação sem sentido e duas mutações de splice [220]. Entre as características clínicas de pacientes com WMS portando ADAMTS10 as mutações foram estenose aórtica e pulmonar com válvulas displásicas e cardiomiopatia hipertrófica obstrutiva [220]. A síndrome de Weil-Marchesani também é causada por mutações na fibrilina-1 (FBN1) e LTBP2, implicando ADAMTS-10 na biologia de microfibrilas de fibrilina-1 [21]. As microfibrilas de fibrilina-1 são conjuntos de ECM essenciais para a formação das fibras elásticas nos vasos sanguíneos, pulmões, pele, ligamentos e outros tecidos elásticos. Eles também regulam a biodisponibilidade de fatores de crescimento da superfamília TGF-β e proteína morfogenética óssea (BMP) [224]. ADAMTS-10 foi subsequentemente confirmado para regular a função das microfibrilas da fibrilina e para ligar a fibrilina-1 em dois locais que coincidem com as mutações da fibrilina-1 em WMS [225]. Também se co-localiza com a fibrilina-1 em tecidos e acelera a montagem de microfibrilas em culturas de fibroblastos [226]. Características oculares em WMS causadas por ADAMTS10 as mutações podem ser devidas à redução da clivagem da fibrilina-2 [227]. Mutações em outros genes envolvidos na biologia das microfibrilas de fibrilina causam distúrbios relacionados à síndrome do tipo WMS (ADAMTS17) e displasia geleofísica (LTBP3, ADAMTSL2, Fibrilina 1) [228].

5,4 ADAMTS-16, um potencial regulador da pressão arterial

A função do ADAMTS-16 é atualmente desconhecida, com relatórios contraditórios sobre seu possível envolvimento na fertilidade masculina e determinação do sexo [229,230]. Até agora, o único substrato descrito é a fibronectina [231]. ADAMTS-16 foi identificado como um gene de característica quantitativa (QTG) para a pressão arterial em humanos [232,233] e ratos [234]. Para investigar a função cardiovascular do ADAMTS-16, Adamts16 ratos knockout foram gerados [121] (tabela 2). Esses ratos apresentam pressão sanguínea sistólica mais baixa, diminuição da rigidez arterial e espessura da túnica média em comparação com ratos do tipo selvagem, sugerindo um envolvimento de ADAMTS-16 na regulação da hemodinâmica [121]. Além disso, Adamts16 ratos knockout sobreviveram mais, embora exibissem anomalias renais [121]. Mais dados são necessários para determinar um possível papel da ADAMTS-16 na regulação da pressão arterial.

5.5. ADAMTS-19 na doença valvar cardíaca progressiva

Um estudo recente de doença valvar de início precoce identificou mutações em ADAMTS19 por sequenciamento completo do exoma. Quatro pacientes em duas famílias consanguíneas eram portadores de mutações homozigóticas em ADAMTS19 causando uma grande deleção de múltiplos exons em uma família e uma proteína ADAMTS-19 truncada na outra família [122]. Para confirmar a causalidade, Adamts19 ratos knockout foram gerados (tabela 2). Dos homozigotos Adamts19 camundongos knockout, 38% apresentaram regurgitação da válvula aórtica e / ou estenose aórtica aos três meses de idade, confirmando um papel importante da ADAMTS-19 na fisiologia da válvula aórtica. Análise de expressão de lacZ no Adamts19 camundongos knockout mostraram forte expressão localizada de lacZ por células intersticiais valvares em todas as quatro válvulas em torno de E14.5 e expressão por essas células até a idade adulta. A análise ultraestrutural da MEC sugeriu alterações na organização da MEC, incluindo acúmulo de PG. A observação do acúmulo de PG levanta a questão se isso é secundário a distúrbios da fisiologia da válvula / função celular ou redução do turnover de PG pelo ADAMTS-19.

6. Visando ADAMTS terapeuticamente

Os inibidores de ADAMTS podem ser potencialmente usados ​​terapeuticamente para reduzir a atividade enzimática que contribui para ou agrava a doença cardiovascular (por exemplo, para ADAMTS-7). No entanto, tem se mostrado desafiador desenvolver inibidores de metaloprotease terapêuticos com seletividade suficiente para prevenir os efeitos colaterais causados ​​pela inibição cruzada de metaloproteinases relacionadas [235]. Os inibidores seletivos podem ser anticorpos monoclonais [235] ou moléculas pequenas, com os últimos tendo a vantagem distinta de que podem ser administrados por via oral. Os inibidores seletivos de pequenas moléculas podem ser projetados com base na estrutura tridimensional disponível da enzima alvo ou identificados por triagem de alto rendimento (HTS) de grandes bibliotecas de compostos. Para rastrear bibliotecas de moléculas pequenas quanto ao seu potencial inibitório, são necessários enzima purificada e um ensaio de atividade de alto rendimento. Normalmente, os ensaios de atividade de alto rendimento para proteases envolvem a tecnologia de transferência de energia de ressonância Förster (FRET), onde a proteólise de um pequeno peptídeo gera um sinal fluorescente [236]. Para ADAMTS-7, desenvolvemos um ensaio de atividade usando um pequeno peptídeo LTBP4 como um substrato eficiente e estamos atualmente convertendo isso para HTS de bibliotecas de moléculas pequenas (manuscrito em preparação)

Por outro lado, onde a atividade de um membro da família ADAMTS provou ser benéfica em um determinado contexto patológico, os chamados intensificadores ou ativadores podem ser considerados. Por exemplo, anticorpos monoclonais capazes de aumentar a atividade catalítica de ADAMTS-13 foram relatados [237]. Outra abordagem inovadora para aumentar a atividade de ADAMTS pode envolver a interferência com a endocitose mediada por LRP-1. Recentemente, relatamos um anticorpo monoclonal que é capaz de se ligar a ADAMTS-5 e bloquear sua ligação a LRP-1 sem interferir com sua atividade de proteoglicanase [238], resultando no acúmulo de ADAMTS-5 ativo no meio extracelular. Esse anticorpo pode ser usado para resgatar a atividade da proteoglicanase ADAMTS-5 em modelos de aterosclerose e TAAD em camundongos (tabela 2).

7. Conclusão

Os membros da família ADAMTS desempenham vários papéis distintos nos tecidos cardiovasculares (tabela 1). Vários deles são importantes para a embriogênese e homeostase da válvula cardíaca (figura 2), mas, em geral, a multiplicidade de processos fisiológicos afetados pelas proteases ADAMTS reflete as muitas funções da ECM, como a regulação do comportamento celular e o sequestro de uma ampla gama de crescimento celular fatores. Muito se aprendeu sobre ADAMTS proteases a partir de estudos em animais, mas deve-se ter cuidado ao extrapolar dados de camundongos para doenças humanas na ausência de estudos clínicos. A este respeito, uma conclusão deve ser apoiada por dados de alta qualidade coletados in vitro, in vivo e ex vivo mas até agora esse objetivo foi alcançado apenas por alguns membros da família. No entanto, novas descobertas interessantes são publicadas a cada ano, elucidando cada vez mais os papéis fisiológicos dessa família fascinante de proteases.


Métodos

Os dados da protease

As proteases em P. falciparum foram previstos usando uma abordagem de genômica comparativa e uma abordagem de aprendizado de máquina supervisionada baseada em máquina de vetores de suporte (SVM) [1-3]. A classificação e anotação foram de acordo com a nomenclatura de proteases MEROPS, que é baseada em relações evolutivas e estruturais intrínsecas [110].

Dados e análise de rede

O conjunto completo de associações proteína-proteína para P. falciparum foi extraído do banco de dados STRING baixado [4] cada associação entre um par de proteínas tem uma pontuação de confiança (S) variando de 0,15 a 0,999 que foi inferida a partir da evidência usada para estabelecer a associação, como transferência de homologia, atribuições de via KEGG, sintenia cromossômica conservada, co-ocorrência filogenética e co-ocorrência da literatura [111]. Este conjunto de associações foi visualizado no Cytoscape [112] e convertido em um gráfico não direcionado, onde há uma única aresta entre qualquer par de proteínas e o valor S é usado como o peso. A rede foi caracterizada usando NetworkAnalyzer [113] e módulos significativos foram detectados usando MINE [114] e MCODE [115]. Os valores padrão foram usados ​​para todos os três plug-ins. O conjunto de proteínas diretamente associadas com as 77 proteases no conjunto de associação foram rastreados usando BiNGO [116] para determinar se quaisquer categorias de proteínas, conforme identificadas por seus termos de Ontologia Genética, estavam sobre-representadas. O teste hipergeométrico foi utilizado com a correção da data da descoberta falsa de Benjamini e Hochberg. Foi selecionado um nível de significância de 0,05.

A mineração de dados ômicos

Nós baixamos o P. falciparum sequência genômica e dados de anotação [18], dados de microarray transcriptômico [6-8], dados de proteômica de espectrometria de massa [9-12] e dados de interatoma de proteína-proteína [5] para proteínas associadas à rede do PlasmoDB, o centro de recursos do Genoma do Plasmodium (http://www.plasmodb.org) [117]. Domínios / motivos conservados em P. falciparum as sequências foram identificadas pesquisando no InterPro [118]. Alinhamentos múltiplos foram obtidos usando o programa ClustalX [119] e T-coffee [120], seguido de inspeção manual e edição. Árvores filogenéticas foram inferidas pelos métodos de união de vizinhos, máxima parcimônia e máxima verossimilhança, usando MEGA5 [121].


Conteúdo

As proteases são atualmente classificadas em seis grupos:

  • Serina proteases
  • Proteases de treonina
  • Proteases de cisteína
  • Proteases de ácido aspártico
  • Metaloproteases
  • Proteases de ácido glutâmico

As proteases da treonina e do ácido glutâmico não foram descritas até 1995 e 2004, respectivamente. O mecanismo usado para clivar uma ligação peptídica envolve fazer um resíduo de aminoácido que tem a cisteína e treonina (peptidases) ou uma molécula de água (ácido aspártico, peptidases de ácido metalo e glutâmico) nucleofílica de modo que possa atacar o grupo carbonila do peptídeo. Uma maneira de fazer um nucleófilo é por uma tríade catalítica, onde um resíduo de histidina é usado para ativar a serina, cisteína ou treonina como um nucleófilo.


Proteases no sangue - Biologia

Em seu livro de 1996, Darwin's Black Box, Michael Behe ​​argumentou que a cascata de coagulação do sangue dos vertebrados era "Irredutivelmente Complexa." coagulação para trabalhar. Visto que, de acordo com Behe, um sistema irredutivelmente complexo não pode ser produzido pela seleção natural darwiniana, ele deve ter sido produzido por outra coisa. Deve ter sido projetado.

Após a publicação do livro de Behe, vários cientistas foram rápidos em apontar que Behe ​​estava errado em muitas de suas afirmações sobre a cascata de coagulação do sangue. O trabalho de Russell Doolittle e muitos outros cientistas mostrou claramente que o sistema evoluiu por um processo de duplicação de genes de serina proteases que antes eram enzimas digestivas. Não surpreendentemente, Behe ​​afirma que muitas críticas a seu trabalho estão incorretas. Em agosto de 2000 ele colocou um ensaio na internet:

Em defesa da complexidade irredutível da cascata de coagulação do sangue.
Uma resposta a Russell Doolittle, Ken Miller e Keith Robison.

Uma resposta à tentativa de defesa de Behe

Como escrevi em meu livro de 1999, Finding Darwin's God, o trabalho pioneiro de Russel Doolittle sobre a evolução das proteínas mostrou de fato que a cascata de coagulação do sangue poderia, e de fato foi, produzida pela evolução darwiniana. A defesa do Dr. Behe ​​de sua posição ao contrário requer que ele explique por que minha descrição da evolução do sistema (pp. 152-161) não é válida. Em sua defesa publicada na web, ele escreve que minha descrição é uma história & quota just-so que não lida com nenhuma das dificuldades que a evolução de um sistema tão complexo enfrentaria. & Quot

Curiosamente, Behe ​​quase ignora minha descrição da evolução da coagulação do sangue na lagosta e não oferece nenhuma refutação ao meu cenário para sua evolução (com base, é claro, no trabalho de pesquisa de Doolittle). Descrevi o sistema de lagosta em meu livro por duas razões: (1) como o sistema de vertebrados é (pelos padrões de Behe) irredutivelmente complexo, e (2) é um sistema mais simples cuja evolução passo a passo é relativamente fácil de responsável por.

Behe observa muito apropriadamente que minha própria descrição da evolução do sistema de coagulação dos vertebrados é bastante breve. uma decisão, infelizmente, do meu editor na Harper-Collins (a editora do livro). No entanto, ainda tenho meu rascunho original desta seção editada, que o leitor pode desejar consultar. (Clique aqui para ver minhas idéias sobre a evolução do sistema de coagulação dos vertebrados). No entanto, com quais elementos da minha descrição, além de sua superficialidade, ele discorda?

Behe afirma que o direcionamento de uma protease, uma enzima digestiva, para a corrente sanguínea é uma "situação potencialmente mortal" e diz aos leitores de seu documento da web que podemos dizer o quão mortal isso pode ser olhando para situações & quot onde proteínas regulatórias estão faltando organismos modernos. ”Em outras palavras, Behe ​​quer que vejamos o que acontece quando as versões atuais altamente reguladas das proteases de coagulação estão perdendo seus fatores regulatórios. Apesar dessa fanfarronice, no entanto, Behe ​​não tem evidências de que o direcionamento incorreto de uma protease inativa para a corrente sanguínea possa causar danos. De fato, a recente descoberta de que os genes da proteína anticongelante em peixes surgiram exatamente desse direcionamento incorreto de proteases para a corrente sanguínea (Chen, L., DeVries, AL & amp Cheng, C.- HC Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 3811 & shy3816 ( 1997) e Chen, L., DeVries, AL & amp Cheng, C.-HC Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 3817 & shy3822 (1997)) sugere que exatamente o oposto é verdadeiro.

Tendo feito afirmações infundadas sobre o "perigo" de tal mutação, Behe ​​diz que seria difícil ver que "vantagem" isso representaria para o organismo. A resposta, claro, é que proporcionaria uma ligeira melhora na capacidade do organismo de coagular o sangue - e esse é o ponto. O sistema de coagulação não precisa funcionar a todo vapor imediatamente. Em um vertebrado primitivo com sistema circulatório de baixa pressão, uma melhora muito leve na coagulação seria vantajosa e seria favorecida pela seleção natural.

Behe então se pergunta como a protease circulante poderia se localizar no local de um coágulo, como se isso fosse uma dificuldade intransponível. Não é. Como sugeri em meu rascunho original sobre a evolução da coagulação, um processo bem compreendido chamado de embaralhamento de exon poderia ter colocado um "domínio de EEGF" na sequência de protease e o "problema" que Behe ​​resolveu em um piscar de olhos.

Por fim, Behe ​​enfatiza que o verdadeiro problema não é gerar um coágulo - é "regular" esse coágulo por meio de um inibidor da protease para que não se torne destrutivo. Mas isso também não é um problema para a evolução. Como de costume, Behe ​​prevê uma protease de coagulação que é tão poderosa quanto as proteases totalmente desenvolvidas nos vertebrados modernos. No entanto, lembre-se de que esse é o mesmo cara que se preocupou um ou dois momentos atrás que a protease não seria forte o suficiente para coagular com eficácia. Ele quer ter as duas coisas. A resposta à sua objeção é exatamente o que escrevi no rascunho:

& quot. um sistema de coagulação primitivo, adequado para um animal com pressão baixa e fluxo sanguíneo mínimo, não tem capacidade de coagulação para representar esse tipo de ameaça. Mas assim que o coágulo ocasional se torna grande o suficiente para apresentar riscos à saúde, a seleção natural favorece a evolução dos sistemas para manter a formação do coágulo sob controle. E de onde viriam esses sistemas? De proteínas pré-existentes, é claro, duplicadas e modificadas. Os tecidos do corpo produzem uma proteína conhecida como alfa-1-antitripsina, que se liga ao sítio ativo das serina proteases encontradas nos tecidos e as mantém sob controle. Assim, assim que os sistemas de coagulação se tornaram fortes o suficiente, a duplicação do gene teria apresentado a seleção natural com um inibidor de protease ativo que poderia então evoluir para antitrombina, um inibidor semelhante que hoje bloqueia a ação da protease primária de clivagem do fibrinogênio, a trombina.

Em suma, nenhum dos pontos levantados por Behe ​​é adequado para explicar por que o sistema de coagulação dos vertebrados não poderia ter evoluído. Além disso, como o trabalho de Doolittle mostrou claramente, a hipótese da evolução faz previsões testáveis ​​com respeito às sequências de DNA das proteínas de coagulação, e essas previsões se mostraram corretas repetidas vezes.

Por que o & quotBiochemical Challenge to Evolution & quot de Behe ​​teve tão pouco apoio dentro da comunidade científica? Eu sugeriria que o motivo é simples. Sua hipótese está errada. Os complexos sistemas bioquímicos dos organismos vivos, incluindo a cascata de coagulação dos vertebrados, são totalmente compreensíveis em termos da evolução darwiniana.

Kenneth R. Miller
Professor de biologia
Brown University
Providence, RI 02912


PARs e proteases - cooperação na progressão do câncer

Fator de tecido

O TF é uma glicoproteína de membrana presente nas células subendoteliais que inicia a coagulação do sangue. A ruptura do endotélio expõe o FT a fatores de coagulação presentes na corrente sanguínea. O TF se liga ao FVII e causa sua ativação (FVIIa). O complexo TF / FVIIa pode ainda ativar FX (FXa), que juntamente com seu cofator FVa, gera trombina (FIIa) a partir da protrombina por conversão proteolítica. A trombina inicia a coagulação por ativação plaquetária e conversão de fibrina do fibrinogênio, resultando em coagulação sanguínea eficaz [83].

O TF também é o pró-coagulante mais proeminente das células cancerosas e é um determinante da progressão do tumor [97]. TF foi descoberto na superfície de células malignas distintas, vasculatura tumoral e microambiente tumoral: células-tronco, macrófagos, ECs e miofibroblastos [9, 10, 40, revisado em 98, 99]. Também é amplamente reconhecido que a expressão do TF se correlaciona com maior invasividade e estágio clínico mais alto da doença maligna e está associada com prognóstico geral ruim [revisado em 40, 97]. As células tumorais expressam endogenamente o FT constitutivamente, ou induzem a produção de FT em seus arredores, produzindo substâncias solúveis capazes de desencadear monócitos e ECs para expressá-lo [98]. A expressão do TF está associada a eventos carcinogênicos durante a transformação oncogênica, pois existem evidências crescentes de que mutações de proto-oncogenes e genes supressores de tumor influenciam sua expressão [40]. No câncer colorretal, o K-ras e p53 mutações que provocam as vias de sinalização mediadas por MAPK e PI3 resultam em expressão aumentada de TF [100]. No câncer de pulmão, observações semelhantes foram feitas para PTEN e p53 mutações [101]. A expressão de TF também demonstrou ser modulada em outros cânceres por formas mutantes constitutivamente ativas do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRvIII) em células de glioma e vulva, bem como quinases da família Src, produção de TGF-β e hipóxia [40].

Existem vários mecanismos pelos quais o TF afeta a biologia do câncer. Em primeiro lugar, após a ativação pelos fatores VII e X e a criação de complexos com eles (TF / VIIa, TF / Xa, TF / VIIa / Xa), o TF promove a sinalização mediada por PAR-1- e PAR-2 ​​responsável pela resposta proliferativa do câncer células [38, 97, 102]. Além disso, o TF pode sinalizar diretamente através de sua cauda citoplasmática através de Rac1 e p38 e remodelação do citoesqueleto [103]. Além disso, uma isoforma de TF (asTF) com splicing alternativo também afeta o crescimento do tumor, independentemente da clivagem de VIIa e PARs, por meio da ativação das integrinas α6β1 e αVβ3 em CEs para promover a angiogênese [97, 104]. O asTF humano promoveu o crescimento do tumor e a angiogênese no câncer pancreático [105], mas foi inativo no mecanismo de metástase dependente de coagulante em um modelo de câncer de mama [106].

Em modelos experimentais e clínicos, as células cancerosas que expressam TF tiveram maior tendência a metástase em comparação com células deficientes em TF [106]. Os efeitos do TF na metástase podem ser mediados por meio de mecanismos que são dependentes ou independentes da ativação da coagulação, isto é, através da função de sinalização do TF. O fator de tecido provavelmente promove o potencial proliferativo e infiltrativo em vez das propriedades adesivas das células metastáticas [30, 68, 107]. Também há evidências de que o TF desempenha um papel na intravasamento de células tumorais, que é o primeiro passo na disseminação de células malignas [108].

Embora o TF possa promover a ativação de PAR-1 e PAR-2, parece que o complexo TF ou TF / FVIIa tipicamente dispara PAR-2, mas não a sinalização de PAR-1 em células cancerosas [38, 67-69, 99, 102, 109, 110]. Em modelos experimentais de câncer de mama, a inibição do crescimento do tumor e da angiogênese foi observada após o bloqueio da função de sinalização do TF, mas não sua atividade de coagulação, e após a inibição de PAR-2, mas não da atividade de PAR-1 [109, 110]. Um fenótipo semelhante foi observado no glioblastoma (GBM), que é o tumor cerebral primário mais agressivo, caracterizado por intensa neovascularização, hiperplasia de CE e hipercoagulação [73]. Experimentos com linhas de células de GBM determinaram que havia expressão de PAR-1 e PAR-2 ​​nessas células, bem como nas paredes dos vasos vasculares dentro da área invasiva de tumores cerebrais [31, 72, 73]. No entanto, apenas a estimulação da via PAR-2 ​​levou ao aumento da secreção de VEGF e IL-8, sugerindo que a sinalização PAR-2 ​​/ MAPK / ERK1 / 2, mas não PAR-1 / PI3K / Akt, regula a angiogênese em GBM. Vale ressaltar que em células GBM existe uma correlação entre a expressão de TF e PAR-2 ​​[72]. Também há evidências de que a hipóxia regula positivamente a expressão de PAR-2 ​​em tumores cerebrais. Há um aumento de aproximadamente 2,5 vezes na expressão de PAR-2 ​​em ECs microvasculares hipóxicos vs. normóxicos de GBM, resultando em sobrerregulação de HB-EGF e um fenótipo pró-angiogênico [111]. Poole et al. demonstraram recentemente que o PAR-2, que é um fator central na inflamação neurogênica e na dor, sustenta a inflamação por meio de um novo mecanismo de acoplamento de canais de TRP. Ao gerar lipídios bioativos, como 5 ′, 6′-EET e 12 (S) -HETE, os efeitos pró-inflamatórios do PAR-2 ​​são sustentados por meio de sinais de Ca 2+ dependentes de TRPV4 [112]. Isso pode ser extremamente relevante neste contexto, visto que o TRPV4 mostrou ter impacto na angiogênese em vários níveis [113, 114]. Finalmente, a sinalização induzida por EGFR em células de glioma estimula a expressão de TF, FVII e PAR-2, aumentando assim a ativação de PAR-2 ​​mediada por TF / VIIa em células cancerosas [115], e as células cancerosas podem secretar aFVII que pode atuar sozinho para ativar PAR-2 ​​[116].

A ativação de PAR-2 ​​mediada por TF / VIIa resulta em um aumento transitório nos níveis de Ca 2+ e dispara a sinalização intracelular que é dependente da família MAPK (p44 / 42, p38, JNK), PI3, quinases semelhantes a Src, Jak / STAT , Vias Rho GTPases, Rac1 e Cdc42 [40, 80, 102]. Além disso, níveis elevados de proteínas pró-angiogênicas, como VEGF, Cyr61, VEGF-C, CTGF, CXCL1, IL8 e moduladores imunológicos, como GM-CSF (ou CSF2) e M-CSF (ou CSF1), foram observados [38, 68, 73, 97]. A eficácia da ativação mediada por TF / VIIa / PAR-2 ​​de mediadores angiogênicos é maior do que aquela induzida pela sinalização PAR-1 [38]. A sinalização PAR-2 ​​desencadeada por TF também resulta no aumento da expressão de MMP-9, que se correlaciona positivamente com a invasividade das células tumorais de mama MCF-7 [70] e pode estar ligada à resposta de MMP-9 ao metabolismo do ácido araquidônico [117]. Foi relatado que as interações TF / FVIIa / PAR-2 ​​são críticas para a migração de células de câncer de mama MDA-MB-231 e invasão em direção ao meio condicionado de fibroblastos NIH-3T3 [68]. Portanto, a ativação de PAR-2 ​​induzida por TF / VIIa facilita a proliferação e a sobrevivência, bem como o potencial metastático de células cancerosas [50, 68, 70].

Em células de câncer de mama, a ativação de PAR-2 ​​também pode ser induzida por FXa, bem como por complexos TF / FXa ou TF / FVIIa / FXa. A fosforilação subsequente de MAPK ou ativação de Erk1 / 2 estimula a migração e invasão de células cancerosas [67, 68].

Em tumores com altos níveis de TF (estado pró-trombótico), o mecanismo metastático predominante resulta da atividade de coagulação do TF em vez de sua capacidade de sinalização inerente [109]. A atividade pró-coagulante do TF leva à geração de trombina, ativação plaquetária e proteção dependente de plaquetas de células natural killer, bem como formação de fibrina e recrutamento de monócitos / macrófagos, todos os quais influenciam as propriedades angiogênicas e metastáticas do tumor [6, 97, 106 , 118]. Estudos de Yokota et al. [106] forneceram uma nova visão sobre metástases dependentes de TF mediadas por trombina com base em um modelo de camundongo hipertrombótico com deficiência de trombomodulina (camundongos TM Pro). As metástases de câncer de mama dependentes de TF, mas independentes da via de contato, foram associadas à hiperatividade das plaquetas e à formação de agregados plaquetários-leucocitários. A deleção genética da glicoproteína plaquetária Ibα (GPIbα) e do leucócito CD11b excluiu esses receptores das metástases plaquetárias dependentes. Além disso, o bloqueio do hospedeiro e do tumor PAR-1 diminuiu significativamente o potencial metastático das células tumorais. Resultados semelhantes foram obtidos em modelos de melanoma, confirmando assim a contribuição do PAR-1 para o melanoma e as metástases mamárias [97].

Trombina

A geração de trombina (IIa) é a etapa central na coagulação do sangue. Como mencionado acima, a trombina cliva o fibrinogênio para produzir fibrina e ativa as plaquetas sanguíneas, resultando na formação de um tampão sanguíneo eficaz após a lesão do vaso. No entanto, a trombina enzimaticamente ativa também é detectada em vários tipos de tumores malignos removidos cirurgicamente (por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células, câncer renal, ovariano, laríngeo, pancreático e gástrico, bem como melanoma) [11, 98, 119, 120] .

A presença de FT nas células tumorais contribui para a geração de trombina no microambiente tumoral, independentemente da coagulação do sangue.Múltiplos alvos de trombina (por exemplo, plaquetas sanguíneas e ativação de EC, geração de fibrina) contribuem para a progressão do câncer, fornecendo matriz para novos vasos e colônias de células tumorais metastáticas [118, 121, 122]. Os primeiros relatos de um novo papel da trombina nas metástases de células tumorais foram publicados no início da década de 1990 [123-128]. Quando incubada com células de carcinoma W256, a α-trombina produziu um aumento de 50–300% na adesão às células endoteliais da aorta de rato e fibronectina [123–127]. Os precursores e análogos da trombina, incluindo protrombina, protrombina-1, mesil-trombina, exo-sítio-trombina, DFP-trombina e nitro-trombina imitaram o efeito da α-trombina [123-127]. Curiosamente, a α-trombina associada aos seus inibidores, nomeadamente hirudina ou complexo antitrombina III-heparina, não foi tão eficaz no aumento da adesão às células tumorais como a forma nativa da enzima [123-127]. Os dados indicam um novo mecanismo de interação da trombina na metástase de células tumorais que não é proteolítica. Além disso, camundongos transplantados com células de câncer de ovário humano (SKOV3) demonstraram tamanho tumoral elevado e taxa de sobrevivência diminuída quando tratados com trombina [122]. Se a sinalização da trombina funciona sinergicamente com as vias de metabolização do araquidonato que estimulam o crescimento do câncer de ovário ainda não foi determinado [129]. Além de seu papel central na via de coagulação, a trombina é considerada o principal ativador PAR-1 e PAR-4. Assim, muitas respostas celulares, incluindo as observadas em células cancerosas, como o rearranjo do citoesqueleto [130], são dependentes da trombina. A evidência para um papel crucial da geração de trombina dependente de TF e ativação de plaquetas PAR-4 mediada por trombina na progressão e metástase do câncer vem de estudos realizados em camundongos geneticamente modificados. As células estromais e tumorais estão envolvidas em várias etapas da tumorigênese, incluindo proliferação, angiogênese, invasão e sobrevivência. Os animais com depleção de plaquetas, PAR-4 ou fibrinogênio foram protegidos da metástase [118, 121, 122]. O tratamento das células de melanoma B16a com α-trombina resultou em um número significativamente aumentado de colônias pulmonares metastáticas [123-127]. A protrombina, a ɣ-trombina e a trombina de camundongo, mas não a nitro-trombina, foram capazes de imitar o efeito da α-trombina de aumentar o potencial de colonização pulmonar de células tumorais [123-127]. A administração de trombina por via intravenosa com células de câncer de cólon (CT26) e células de melanoma (B16a) aumentou as metástases pulmonares murinas de 4 a 413 vezes [131]. O potencial metastático foi diminuído pela hirudina, um inibidor específico da trombina [4, 122, 132].

Trombina / PAR-1 em fibroblastos

Durante o processo de coagulação, a conversão da protrombina em trombina e sua atividade subsequente leva à clivagem do fibrinogênio para formar fibrina. Os depósitos de fibrina no microambiente tumoral são a reserva de trombina que é liberada após a degradação da fibrina pela plasmina [133]. o em vitro experimentos forneceram evidências de que as células do estroma de tumores malignos, como fibroblastos, expressam PAR-1 e PAR-2 ​​elevados em comparação com lesões benignas ou tecidos normais onde tal expressão não é observada [74]. A sinalização crônica mediada por PAR-1 em fibroblastos NIH-3T3 pode causar transformação do crescimento [85]. Alegadamente, a expressão de PAR-1 no microambiente conduz a progressão e induz a quimiorresistência do câncer pancreático [134] ao regular a migração de monócitos e a produção de quimiocina dependente de fibroblastos.

Trombina / PAR-1 em células endoteliais

As células endoteliais são outro alvo das interações trombina / PARs. A ativação de PAR-1 mediada por trombina regula as vias inflamatórias que também estão implicadas na progressão do câncer. Aumento da produção e expressão de lipídios de PAF, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α e moléculas adesivas (E-selectina, P-selectina, molécula de adesão intracelular-1 e molécula de adesão de célula vascular-1, integrinas) promove a proliferação de EC, o recrutamento de plaquetas e a fixação de células malignas [4, 5, 128, 135-138]. A inibição da atividade de PAR-1 inibe o crescimento de EC aumentando a fração sub-G0 / G1, reduzindo assim a porcentagem de células na fase S [139]. Além disso, a ativação da trombina / PAR-1 regula a função de barreira entre os CEs, modulando as junções aderentes (AJ) [140]. O aumento na permeabilidade da barreira endotelial em resposta às ações associadas à trombina / PAR resulta da modificação da caderina-VE, p120 e β-catenina via sinalização dependente da proteína quinase C [138, 140]. A disfunção na barreira endotelial gera uma matriz pró-angiogênica temporária que é a base para a ativação da cascata trombina / PAR / IP3 / Ca 2+ / MAPK e subsequentes respostas celulares [98]. A regulação positiva de fatores angiogênicos, como VEGF, VEGFR2 e angiopoietina-2, por meio da via dependente da trombina / PAR, juntamente com o aumento da permeabilidade da barreira de ECs, resulta na indução da angiogênese e na disseminação do câncer [4, 141].

A integrina αvβ3 é encontrada principalmente nas células dos vasos sanguíneos e desempenha um papel essencial na angiogênese. Localização de αvβ3 é alterado em resposta a metabólitos eicosanóides pró-inflamatórios, como 12 (S) -HETE, levando à retração de EC e interrupção da função de barreira [142-144]. A expressão da integrina αvβ3 é regulado pela atividade PAR-1 mediada pela trombina. A ativação de PARs pela trombina também leva ao aumento da expressão de gelatinases que degradam o colágeno IV e aumentam a permeabilidade dos vasos para promover a migração e invasão das células endoteliais e cancerosas [120].

Em CEs, a trombina pode clivar diretamente PAR-1, que se acredita levar a um fenótipo pró-inflamatório, ou pode fazê-lo indiretamente após ativar uma protease intermediária chamada proteína C (proteína C ativada (APC)) que então atua em PAR- 1 No entanto, quando o domínio GLA de APC está em complexo com seu receptor cognato, EPCR e trombomodulina (TM), a especificidade de sinalização de PAR-1 é alterada para um fenótipo antiinflamatório ou protetor. Assim, em CEs, a modulação da especificidade da sinalização da protease de coagulação através do PAR-1 depende se a trombina está agindo diretamente no PAR-1, ou indiretamente, através do APC, e se o APC está ligado ao EPCR [145]. Em CEs, PAR-1 pode ter ação tanto da trombina quanto da proteína C ativada (APC) para afetar resultados opostos, mas acredita-se que isso dependa de se a última protease está em complexo com EPCR.

A via APC / EPCR / PAR-1 induz motilidade, proliferação de ECs e angiogênese por meio de sinalização protetora vascular e formação de tubo para promover a disseminação de células cancerosas [146, 147]. Além disso, o modulador de hemostasia associado a EC, TM, também influencia fortemente o potencial metastático associado à função pró-coagulante da trombina [148].

Relatórios recentes ligaram a ativação de PAR-2 ​​e TRPV4, onde TRPV4 é conhecido por aumentar a proliferação de EC e a migração de EC tumoral mediada por ácido araquidônico [112, 113].

Trombina / PARs em plaquetas

As plaquetas humanas expressam dois tipos de PARs desencadeados por trombina, nomeadamente o PAR-1 de alta afinidade e o PAR-4 de baixa afinidade. Ambos os receptores ativam efeitos celulares pleiotrópicos via acoplamento à proteína Gαq e Gα13, que leva à ativação da fosfolipase Cβ, hidrólise de fosfoinositídeos e aumento da concentração de cálcio citoplasmático, resultando na ativação da integrina αIIbβ3e agregação plaquetária [5, 6, 91, 149]. Relatórios iniciais descrevendo o sistema PARs duplo em plaquetas humanas explicaram esse fenômeno pelo fato de PAR-1 e PAR-4 interagirem com diferentes concentrações de ativador e, portanto, podem sintonizar a sinalização de trombina de forma mais eficiente [30]. Estudos adicionais revelaram que PAR-4 funciona de forma diferente do PAR-1, em que a clivagem induzida por trombina de PAR-4 resulta em ativação muito mais longa de Gαq. Isso leva a uma resposta sustentada de Ca 2+, que prolonga a sinalização secundária, em comparação com PAR-1, que é crucial para a fase tardia da agregação plaquetária [150]. Em baixas concentrações de trombina, PAR-1 pode atuar como um cofator de PAR-4. Há também atividade PAR mitogênica mediada por trombina derivada de plaquetas, bem como para CEs e miócitos de vasos [97, 120]. As plaquetas revestidas com trombina sobrevivem por mais tempo, o que dá às células cancerosas a oportunidade de aderir e invadir ainda mais [4, 120, 151]. Além disso, as células tumorais revestidas por plaquetas são protegidas da eliminação mediada por células assassinas naturais [152].

A agregação de plaquetas e a geração de fibrina resultante são acompanhadas por aumento da expressão de proteínas adesivas (glicoproteína GPIIb / IIIa, fator de von Willebrand, P-selectina, fibronectina) em plaquetas que sofreram estimulação de trombina [4]. Essas proteínas adesivas permitem que as células malignas formem complexos com o trombo de fibrina e as plaquetas sanguíneas em espaços vasculares no melanoma e nos cânceres epiteliais [revisado em 4]. Esses complexos aumentam a sobrevivência das células cancerosas e o potencial metastático. O tratamento das plaquetas com trombina promoveu a adesão das células do melanoma às plaquetas, o que aumentou a metástase pulmonar [129].

Além da agregação plaquetária, a clivagem de PAR-1 e PAR-4 mediada por trombina induz a liberação seletiva de reguladores plaquetas pró-angiogênicos e mitogênicos (PDGF, VEGF e angiopoietina-1) que facilitam a migração de células progenitoras endoteliais e a formação de nova rede capilar, que é uma etapa fundamental para metástases [153]. Em comparação com indivíduos saudáveis, as plaquetas de pacientes com câncer de mama produzem níveis muito mais elevados de VEGF em resposta à estimulação da trombina [151]. A trombina induziu esse efeito por meio da ativação do PAR-1, enquanto a estimulação do PAR-4 resultou na secreção de endostatina, um fator antiangiogênico [151].

Trombina / PAR-1 em células cancerosas

A trombina pode induzir uma resposta de sinalização por meio da interação direta com PAR-1 presente nas células tumorais [4, 14, 41, 48]. Em vitro estudos com várias linhagens de células cancerosas mostraram correlação entre a superexpressão de PAR-1 em células cancerosas e maior invasividade e desenvolvimento de metástases distantes [14, 17, 18, 41-44, 52, 94, 154]. Além disso, em pacientes com câncer de pulmão, estômago ou câncer de mama, a expressão de PAR-1 foi um fator prognóstico desfavorável e independente em termos de sobrevida global, enquanto em pacientes com câncer de próstata acabou sendo um fator prognóstico para recorrência local [17, 18, revisado em 155]. A expressão diminuída de PAR-1 foi associada à capacidade de invasão reduzida de células cancerosas [68].

A expressão de PAR-1 foi confirmada em melanoma, mama, pulmão, esôfago, estômago, cólon, próstata, pâncreas, câncer de fígado, ovário, endométrio e de cabeça e pescoço (Tabela 1) [17, 38, 43-45, 78, 79, revisado em 155-157]. Curiosamente, embora PAR-1 seja expresso em células-tronco hematopoéticas normais, sua expressão é marcadamente diminuída na leucemia mieloide aguda [158]. O efeito celular induzido pelo PAR-1 depende da concentração do agonista de modo que a baixa concentração de trombina (menos de 3 nM) estimule a proliferação de células cancerosas e o crescimento do tumor, enquanto altos níveis de trombina levam à apoptose [159]. A maioria dos efeitos celulares é desencadeada pela ativação de longa duração de segundos mensageiros ERK1 / 2. No entanto, várias vias de sinalização intracelular podem estar implicadas na ativação da trombina / PAR-1 (descrito abaixo) [118, 160].

Apoptose, proliferação, migração e invasão

Em modelos murinos de tumores benignos, a ativação do PAR-1 resulta no crescimento do tumor e na invasão por meio do silenciamento de genes pró-apoptóticos [154]. No entanto, em cânceres epiteliais e células de melanoma, a ativação de PAR-1 mediada por trombina desencadeia vias de pró-sobrevivência [5, 50, 75, 77, 154, 161]. A superexpressão e ativação de PAR-1 em linhas celulares de melanoma não metastático estimulam a via de sinalização Akt / PKB, levando a uma diminuição na expressão de Bim e Bax, bem como níveis de caspase-3 e caspase-9 clivados. A inibição da atividade de PAR-1 diminuiu o crescimento do tumor durante na Vivo experimentos, confirmando os efeitos relacionados à apoptose eliciados por este receptor [5].

Em vários cânceres, a resposta à ativação de PAR-1 induzida por trombina aumenta a proliferação celular, bem como a motilidade e a migração em ensaios de barreira de Matrigel [45, 46, 50, 77]. Em células de carcinoma hepático Hep3B, PAR-1 e PAR-4 ativam vias de sinalização promigratórias comuns por meio da ativação do receptor tirosina quinases Met, PDGFR e ROS quinase, bem como a inativação da proteína tirosina fosfatase, PTP1B [162]. No câncer de nasofaringe, a ativação de PAR-1 induzida por trombina leva ao aumento da expressão de MMP-2 e MMP-9, que estão intimamente associadas à metástase tumoral, pois podem degradar a matriz extracelular e romper a membrana basal [43, 60].

Maior expressão de integrinas

As integrinas são proteínas transmembrana que medeiam as interações entre os CEs e a matriz extracelular que são vitais para o sucesso da angiogênese [41, 42, 120]. Há evidências substanciais de que a expressão aumentada de proteínas de adesão devido à atividade PAR mediada por trombina resulta em aumento do potencial metastático de células cancerosas [4, 41-43]. PAR-1 aumenta as propriedades invasivas das células tumorais principalmente ao promover a adesão aos componentes da matriz extracelular. Várias linhas de células cancerosas (por exemplo, pulmão e melanoma) exibem adesão aumentada às plaquetas, bem como ECs aórticos e capilares após estimulação de trombina / PAR-1 [4, 14, 41, 42, 130]. A adesão dirigida por PAR-1 aos componentes da matriz extracelular ocorre por meio de três mecanismos: (1) fosforilação da cinase de adesão focal e paxilina e indução de complexos de contato focal, (2) mobilização de integrinas na superfície celular sem alterar seu nível de expressão, e (3) recrutamento específico de integrina αvβ5 para sites de contato focal [163]. Interação de células cancerosas com integrina αvβ5 e a reorganização do citoesqueleto facilita a migração celular, invasão e desenvolvimento metastático no câncer de pulmão e melanoma [43, 163, 164]. Além disso, a aplicação de anti-αvβ5 os anticorpos atenuam especificamente esta invasão induzida por PAR-1 [163]. Expressão da integrina αIIbβ3 e a P-selectina em resposta ao PAR-1 pode levar à ligação de células de melanoma a CEs e plaquetas e, dessa forma, também aumentar o potencial metastático de células cancerosas [14, 41, 42, 120]. Aumento da expressão de αIIbβ3 proteína foi relatada em vários tumores malignos [4, 14, 41, 42, 165, 166].

Angiogênese

O desenvolvimento de novos vasos sanguíneos, angiogênese (angio-navio, gênese—Criação) é o processo principal para o crescimento e progressão do tumor [167, 168]. Os pequenos vasos sanguíneos fornecem às células cancerosas oxigênio e nutrientes e removem os resíduos metabólicos. Supõe-se que os tumores malignos não podem crescer acima de 2-3 mm 3 sem vasculatura [168]. Embriogênese murina e estudos de câncer demonstraram que a expressão de PAR-1 é necessária para a angiogênese, já que metade dos embriões animais privados de PAR-1 morreram devido ao desenvolvimento insuficiente da vasculatura, enquanto a ativação da sinalização de PAR-1 preveniu a morte de células cancerosas [169]. Em células de melanoma e câncer de mama, a expressão de PAR-1 se correlaciona com níveis aumentados de VEGF e estimulação da angiogênese e crescimento do tumor [161]. Também há correlação entre a expressão de trombina e VEGF em células de glioma, sugestiva de um possível mecanismo autócrino de regulação da angiogênese em tumores cerebrais.

A clivagem de PARs mediada por trombina no câncer, células sanguíneas e células da parede do vaso resulta na ativação da transcrição de muitos genes pró-angiogênicos, como VEGF e seu receptor (VEGFR), TF, MMP-2, angiopoetina-2 (Ang-2), fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), MAP e PI3 quinases [120, 142, 170-173]. Baseado em em vitro estudos, VEGF proveniente de plaquetas e células cancerosas pode ser secretado dentro de minutos após a ativação [170]. Além disso, a ativação de PAR mediada por trombina induz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) através do aumento da expressão de fator-1 induzido por hipóxia (HIF-1) [116]. O HIF-1 ativa a transcrição do gene VEGF e sua expressão é responsiva aos metabólitos do ácido araquidônico [174].

A sinalização PAR-1 e PAR-4 após a ativação plaquetária leva à síntese e liberação de tromboxano (TXA2) e ácido 12-hidroxieicosatetraenóico (12 (S) -HETE) [6, 142, 143, 175-181]. Estes são produtos metabólicos finais da atividade da ciclooxigenase (COX-1) e da lipoxigenase (12-LOX) no ácido araquidônico e são importantes mediadores da formação de trombos, tônus ​​vascular e angiogênese por meio de sua ação em receptores específicos (TPα, GPR31) e regulação transcricional de fatores como VEGF e HIF1α [144, 174–186]. O ácido araquidônico é liberado como um substrato para essas enzimas da membrana celular pela fosfolipase A2 citosólica (cPLA2a) que responde à sinalização de PAR-1 e PAR-4 diferencialmente, dependendo se está acoplado à via COX-1 ou 12- Via LOX [187]. A ativação da trombina de PAR-1 e PAR-4 também leva à formação de eicosanóides esterificados na mesma taxa que a liberação de ácidos livres. No entanto, HETE esterificado para fosfatidiletanolamina após esta reação é apresentado ao exterior da célula em vez de reciclar no pool de substrato interior e tem funções únicas nesse contexto [188].

Transição epitelial-mesenquimal

Outro fenômeno potencialmente importante na metástase do câncer, pelo menos em parte regulado pela trombina, é a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [44]. O mecanismo, com seu processo reverso, uma transição mesenquimal-epitelial (MET), aumenta a capacidade dos cânceres sólidos de se disseminarem e colonizarem locais distantes [189]. Os tumores malignos compostos por células moderadamente diferenciadas também podem conter regiões de diferenciação insuficiente. Essas células podem se desprender da massa tumoral e invadir o estroma adjacente após passar por um evento semelhante ao EMT. Eles perdem a expressão de marcadores de diferenciação epitelial e ganham a capacidade de expressar marcadores mesenquimais e de “stemness”. Essas células também contribuem para a migração de células-tronco circulantes (CSCs) que se disseminam e dão origem a metástases. Durante a EMT, algumas características do epitélio diferenciado (por exemplo, polaridade ápico-basal e adesões célula-célula) são substituídas por traços mesenquimais - polaridade posterior para frontal, capacidade de migração celular individual e invasão da lâmina basal e vasos sanguíneos [189] . Para colonizar efetivamente novos locais, tais células também devem ser capazes de passar pelo processo de MET reverso para se rediferenciar e restabelecer a organização das células [189].

Estudos experimentais em linhas de células de câncer gástrico revelaram que a ativação de PAR-1 mediada por trombina leva à reprogramação da expressão gênica por estimulação de fatores de transcrição como SNAIL1 que é conhecido por conduzir a EMT no embrião [44].Além disso, em cânceres epiteliais (por exemplo, gástrico e de mama), o complexo trombina / PAR-1 leva à alteração dos componentes da membrana basal (aumento da expressão de fibronectina, Wnt e β-catenina, diminuição da expressão de E-caderina), bem como do citoesqueleto proteínas (miosina IIA e filamina B), que regulam coletivamente a EMT envolvida na progressão do tumor maligno [45, 46, 75, 77, 94, 189].

As MMPs são proteases dependentes de zinco secretadas por células tumorais e hospedeiras. É amplamente reconhecido que as MMPs estão envolvidas na progressão e metástase do câncer, facilitando a invasão das células tumorais através da membrana basal e do tecido do estroma [39, 157, 190]. A coexpressão de MMPs e PARs está associada a alta invasividade (infiltração mais profunda do tumor, invasão linfovascular, ocorrência mais frequente de metástases em linfonodos, estágio clínico mais avançado da doença) e baixa sobrevida em vários tumores malignos, por exemplo, mama, gástrico, esofágico , câncer da vesícula biliar, hepatocelular, pulmão e câncer de ovário [18, revisado em 39, 157, 189].

Além disso, estudos com linhagens de células de câncer de mama, vesícula biliar e ovário mostraram que MMPs (MMP-1, MMP-9, MMP-13, MMP-14) podem ativar a sinalização de PARs, especialmente pela clivagem de PAR-1 (maioria dos tumores ) ou PAR-2 ​​(câncer de pulmão) [15, 39, 52, 71]. Além disso, foi determinado que os fibroblastos senescentes aumentam os eventos carcinogênicos cutâneos iniciais por meio da ativação de PAR-1 mediada por MMP-1 [191]. Das MMPs testadas, a MMP-1 apresenta a correlação positiva mais forte com a migração e invasividade celular. O bloqueio da atividade PAR-1 mediada por MMP-1 em modelos de xenoenxerto de câncer peritoneal de ovário avançado resulta na inibição da angiogênese e metástase [39].

A ativação da PAR-1 plaquetária pela MMP-1 também pode levar à ativação do sinal Rho-GTP e MAPK, promovendo assim a agregação plaquetária, bem como aumentando a motilidade plaquetária e a proliferação celular [87]. O zimogênio ProMMP-1 é convertido em MMP-1 na superfície das plaquetas após o contato com fibrilas de colágeno. O bloqueio da sinalização MMP-1 / PAR-1 inibe muito a trombose em animais, demonstrando que a via colágeno / MMP-1 / PAR-1 é um ativador de eventos de sinalização plaquetária independente da trombina. Como PARs estimulam a expressão e liberação de 12 (S) -HETE que regula positivamente MMP9 [117], parece haver um precedente para a regulação bidirecional de MMPs e sinalização de PARs.

Tripsina

A tripsina é outra serina protease que ativa o PAR-2 ​​nas células cancerosas. A concentração de tripsina está aumentada em pacientes com câncer gástrico, de cólon, de pâncreas e de ovário [54, 155, 192]. A expressão aumentada de PAR-2 ​​e sua influência na proliferação de células cancerosas foi definida em câncer gástrico, esofágico, colorretal, pancreático, escamoso oral, fígado, colangiocarcinoma, pulmão, mama e ovário, bem como em melanoma e tumores cerebrais (Tabela 3 ) [53, 54, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 71, 155, 193–195]. PAR-2 ​​também pode ser altamente expresso em regiões de tumor ricas em estroma. Estudos de Shi et al. demonstraram papéis duplos intrigantes para PAR-2 ​​do estroma no desenvolvimento do câncer pancreático, ou seja, que PAR-2 ​​potencializou o crescimento do tumor primário, mas diminuiu a linfangiogênese e subsequente metástase de linfonodo [194]. Os resultados definiram PAR-2 ​​como um regulador negativo da linfangiogênese no câncer de pâncreas. Em contraste, a expressão de PAR-2 ​​correlacionou-se com a profundidade da invasão da parede, metástase hepática, bem como infiltração linfática e venosa em pacientes com câncer gástrico [193]. Os pacientes com tumores PAR-2 ​​positivos tiveram prognóstico significativamente pior do que aqueles com tumores de expressão negativa.

Em vitro estudos com cânceres epiteliais mostraram que PAR-2, como PAR-1, exerce atividade mitogênica [46, 53, 54, 56-61, 64, 71, 155, 193-195]. O peptídeo ativador de tripsina e PAR-2, SLIGKV, aumentou significativamente a atividade gelatinolítica de MMP-2, bem como a sinalização ERK / AP-1, MEK1 / 2 e MAPK para promover a proliferação, migração e metástase de células cancerosas [53, 57, 58, 60–62, 195]. O aumento da atividade da MMP-2 sugere que o PAR-2 ​​pode estar implicado na invasão do câncer pela via MMP / EGFR / MAPK / ERK1 / 2 [60]. PAR-2 ​​também pode ativar canais de Ca 2+ para promover a liberação de prostaglandina E2, resultando em proliferação celular estimulada por EGFR [53]. Empregando um ensaio de migração através da barreira Matrigel, foi determinado que a transativação da tirosina quinase do receptor Met pelo PAR-2 ​​está envolvida na invasão de células hepatocelulares e colangiocarcinoma [58].

A influência da inflamação no câncer é inegável. Existem conexões interessantes entre o sistema nervoso e a regulação da inflamação, onde o nervo vago participa de um ciclo de feedback sistêmico que também envolve PARs [revisado em 196]. Estudos recentes determinaram que a isoforma PAR-1 nas fibras C vagais nos pulmões de camundongos poderia evocar um potencial de ação em resposta à trombina, tripsina ou ao peptídeo ativador de PAR-1 TFLLR-NH (2) [197]. Os canais de TRPV que induzem dor e inflamação também são regulados pelos PARs e seus mediadores lipídicos bioativos pró-inflamatórios a jusante, como 12 (S) -HETE [198-204]. Embora associemos principalmente a inflamação neurogênica à nocicepção, deve-se notar que as células tumorais podem migrar por uma via perineural, que pode se comunicar com os gradientes lipídicos bioativos PARs pró-inflamatórios ao longo dos nervos que servem como balizas de metástase [205-207]. Da mesma forma, foram descritos mecanismos neurogênicos que relacionam a ativação de PARs ao extravasamento de plasma e que dependem de mediadores lipídicos bioativos [112, 208]. Biópsias ao redor da glândula de Bartholin de mulheres com vestibulodínia revelam mais terminações nervosas intraepiteliais do que indivíduos saudáveis ​​e aumento da liberação de mediadores inflamatórios que levam à sensibilização das fibras do nervo C e aumento da proliferação [209]. Por causa dessa inflamação neurogênica, esses pacientes geralmente apresentam infecções recalcitrantes por fungos que podem levar à hiperplasia epitelial e câncer [210].

Microbiome, PARs, câncer

PARs têm sido implicados em muitas interações hospedeiro-micróbio que com o tempo podem ser relevantes para decifrar o papel do microbioma no início e progressão do câncer, bem como outras doenças com raízes em processos inflamatórios infecciosos [211-217]. Insulto microbiano por Streptococcus pneumoniae é conhecido por estimular proteases derivadas do hospedeiro de modo a ativar PARs [218]. Porphyromonas gingivalis pode ativar PARs nas células epiteliais orais para regular positivamente a IL-6 [219], e a bactéria foi recentemente demonstrado que estimula o PAR-2 ​​resultando na expressão de MMP9 e promoção de carcinoma de células escamosas oral [220]. Ambos Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus na pele, produzem proteases que alimentam a ativação de PARs nos queratinócitos levando à inflamação [221]. Os próprios micróbios produzem numerosas proteases que auxiliam na disseminação microbiana, superando alguns dos mesmos processos logísticos que as células cancerosas em metástase devem contornar para se espalhar [222–225]. A interação entre o microbioma e o hospedeiro para afetar as mudanças no tecido e no microambiente hematológico está sendo ativamente investigada [226, 227]. As proteases bacterianas podem clivar PARs para modular a inflamação e foram estudadas por seu potencial de comprometer a função de barreira do hospedeiro [228]. Para tanto, é concebível que células em circulação ou metástase de tumores ou nichos-tronco possam tirar proveito de tais mudanças. Recentemente, também há evidências para a ativação da protease microbiana de um novo TLR em um mecanismo semelhante à ativação do PAR [229].

Como alimento para o pensamento, o microbioma intestinal tem recebido muita atenção em relação a doenças e bem-estar [230–233]. Portanto, é digno de nota no clima de alimentos geneticamente modificados que são criados ou manipulados que os rendimentos abundantes de certos grãos na indústria agrícola dependem da expressão de serpina [233, 234], o que pode ter implicações para a regulação de PAR no intestino [235 –239].

Implicação clínica

Os resultados dos estudos teóricos apresentados acima sugerem que os PARs e a sinalização associada aos PARs podem ser usados ​​como um possível alvo terapêutico, isoladamente ou em combinação com outras modalidades, como quimioterapia, agentes antiangiogênicos e drogas pró-apoptóticas. Uma abordagem direcionada por PAR é atraente, uma vez que tem como alvo o tumor e seu microambiente. Em vitro e na Vivo estudos fornecem evidências de que a inibição da sinalização associada a PAR resulta em redução do crescimento tumoral, invasividade e metástase [5, 41, 42, 240]. Existem antagonistas de sinalização associados a PAR funcionais (inibidores de proteases) e farmacológicos (inibidores de ligante retido ou local de clivagem de PAR) [19, 20]. O benefício clínico pode ser fornecido pelo bloqueio direto de PAR-1 ou PAR-2 ​​em células tumorais, inibição de PAR-1 em plaquetas, fibroblastos e ECs (ATAP2, WEDE15, SCH530348, SCH79797, vorapaxar), bem como administração de inibidores de trombina (hirudina, argatroban), TF (TFPI, mAb-10H10), MMPs e outros inibidores de serina protease (serpinas) [4, 5, 16, 22, 24, 87, 95, 96, 241, 242]. Embora a inibição experimental da tripsina seja viável, parece que a tripsina como um alvo para terapia clínica é improvável de ter sucesso devido à sua distribuição universal [60]. O bloqueio de proteínas expressas em resposta à sinalização induzida por PAR, por exemplo, anti-αvβ5 anticorpos, EGFR, Erb, Erk, inibidores de MEK, bem como agentes que interferem com PAR RNA (short hairpin RNA (shRNA)), também têm potencial terapêutico [24, 61].

A inibição de atividades relacionadas que não estão associadas diretamente aos efeitos promotores de câncer de PARs também podem beneficiar pacientes com câncer. Existem descobertas intrigantes de um modelo animal de que a ativação de PAR-1 e PAR-2 ​​mediada por trombina desempenha um papel na patogênese dos efeitos colaterais agudos da radioterapia, por exemplo, enterite, onde a sinalização mediada por PAR ativa processos inflamatórios, mitogênicos e proliferativos nas células do intestino após a radioterapia. Os inibidores PAR-1 diminuíram a intensidade dos efeitos colaterais imediatos e agudos (enterite), mas não afetaram os efeitos colaterais de início tardio [243–245]. A patogênese dos efeitos adversos tardios é presumida como independente de PAR. Além disso, os antagonistas de PAR-2 ​​potencializam os efeitos analgésicos da morfina sistêmica em um modelo de rato de dor de câncer ósseo [246].

Embora os resultados de modelos experimentais sejam promissores, a inibição da atividade PAR em células normais e tumorais pode causar efeitos colaterais, como hemorragia, de modo que a descoberta de drogas personalizadas para PAR é um grande desafio. Os ensaios clínicos ainda são limitados e até agora direcionados a pacientes com doenças diferentes do câncer. Antagonistas PAR-1, como vorapaxar e atopaxar, foram avaliados em ensaios clínicos em pacientes com síndrome coronariana aguda, infarto cerebral e aterosclerose [24, 247].

No entanto, o conhecimento da base molecular do câncer de mama e do melanoma fornece novos alvos potenciais para a descoberta de drogas anticâncer adaptadas à sinalização dependente de PAR.

Câncer de mama

Há evidências crescentes de que PARs, principalmente PAR-1 e PAR-2, são fortes mediadores da invasão celular em cânceres epiteliais [68, 77]. As células do câncer de mama podem expressar PAR-1 e PAR-2 ​​[66, 68, 77], e seu papel no carcinoma de mama é o mais amplamente estudado. PAR-1 não é expresso no epitélio normal da mama, displasia ou adenoma, mas é regulado positivamente no carcinoma no local (baixa expressão) e é altamente expresso em linhas de células invasivas de carcinoma da mama [47, 77, 154]. Estudos experimentais sobre câncer de mama mostraram que PAR-1 é ativado por trombina, MMPs e TF, enquanto PAR-2 ​​é ativado por fatores de coagulação VIIa, Xa ou seus complexos com FT [16, 52, 66, 68, 77]. Também há observações de que PAR-1 e PAR-2 ​​atuam como uma unidade funcional neste tipo de tumor [248]. O silenciamento de PAR-2 ​​por shRNA atenua a ativação de PAR-1 mediada por trombina, levando à redução da formação de colônias e diminuição da invasão celular [248].

A atividade PAR medeia a migração de células de câncer de mama através de Matrigel (uma membrana basal reconstituída), facilita a quimiocinese celular através da via de sinalização Gαi / c-Src / JNK / paxilina, ativa as vias de sobrevivência Akt-dependentes e se correlaciona com o nível de invasividade e potencial metastático de numerosas linhas de células cancerosas [66, 77, 154, 163]. PARs também regulam os processos EMT em tumores de câncer de mama, o que facilita a proliferação celular (no local carcinoma), invasão da membrana basal, degradação da matriz e infiltração local (câncer invasivo). Além disso, as interações PAR com integrinas, formação de complexos de contato focal e reorganização do citoesqueleto permitem a disseminação à distância via intravasamento e extravasamento (via vasos linfáticos ou sanguíneos). Finalmente, o processo MET e as interações com sangue e CEs facilitam a formação de metástases (câncer disseminado) [77]. A inibição da ativação de PAR em células de câncer de mama MDA-435 altamente metastáticas reduziu a invasão celular [77]. A administração de um inibidor de MMP-1 e P1pal-7 (inibidor da viabilidade celular mediada pela sinalização de Akt) atenua a atividade de Akt, promovendo significativamente a apoptose em xenoenxertos de tumor de mama e inibindo a metástase para os pulmões em até 88% [16].

Há evidências de na Vivo estudos para progressão do câncer de mama mediado por PAR [32]. A expressão de PAR-1 foi essencial para o crescimento tumoral e invasão em xenoenxertos mamários via interação mediada por trombina com EGFR- e ErbB ou pela via de Ca 2+ mediada por MMP-1 derivada de fibroblastos [32, 52]. A transativação persistente de EGFR e ErbB2 / Her2 pela via PAR-1 clivada por trombina foi demonstrada em carcinoma de mama invasivo, mas não em células epiteliais mamárias normais [32, 94]. Há evidências de que Gαi / o, atividade de metaloprotease e liberação de HB-EGF (EGF de ligação à heparina) ligando são críticos para a transativação de EGFR. Finalmente, a sinalização de EGFR e ErbB2 / Her2 desencadeada por PARs resulta na ativação prolongada de Erk-1/2 levando à invasão de células de carcinoma de mama. Estes resultados indicam benefício terapêutico potencial de inibidores de trombina, EGFR, ErbB e Erk quinases em pacientes com câncer de mama metastático.

Melanoma

Em cânceres epiteliais, o mecanismo predominante que leva à disseminação metastática é a EMT. No melanoma, a transição de uma lesão da fase de crescimento radial não invasivo (RGP) para a fase de crescimento vertical competente para metástase e invasiva (VGP) é uma etapa importante na progressão do tumor, e a expressão de PAR está implicada no processo de transição RGP-VGP [249]. As células de melanoma expressam PAR-1 e PAR-2 ​​[50, 250]. O papel do PAR-2 ​​na metástase do melanoma não foi avaliado anteriormente, mas as descobertas mais recentes mostraram seu papel duplo no melanoma [187, 194]. Em um modelo murino de melanoma B16 metastático espontâneo, o PAR-2 ​​contribuiu para a limitação da progressão do câncer local em uma área, ao mesmo tempo em que aumentava a disseminação metastática distante. Numerosos relatórios documentam o papel da sinalização PAR-1 no fenótipo prometastático das células de melanoma [4, 5, 21]. Estudos experimentais em linhas de células de melanoma demonstraram que a sinalização induzida por PAR-1 ativa fatores adesivos, invasivos, antiapoptóticos e angiogênicos para promover a metástase de melanoma [4, 5, 21, 251]. Prova adicional para o papel do PAR-1 na disseminação do melanoma é o fato de que ele é altamente expresso tanto em linhas celulares de melanoma metastático quanto em lesões metastáticas em comparação com nevos primários e pele normal [21, 250]. Além disso, células de melanoma isoladas de lesões que deram origem a metástases em pacientes tiveram maior expressão de RNAm e proteína PAR-1, em comparação com aquelas obtidas de lesões que não desenvolveram doença metastática [252]. A motilidade e a migração de células de melanoma também são reguladas pela ativação de PAR-1 mediada por trombina [50, 252]. A trombina, cuja geração é dependente de TF (pró-coagulante expresso em células de melanoma), é o ativador PAR-1 predominante [21, 107]. No entanto, também há evidências de que a ativação de PARs mediada por MMP-1 existe em células de melanoma [5, 249]. Ambos MMP-1 e PAR-1 são altamente expressos por melanomas VGP. Acredita-se que a MMP-1 facilite a invasão do melanoma pela degradação do colágeno tipo I na pele, enquanto a ativação do PAR-1 leva ao aumento da ativação dos fatores de crescimento: FGFR-2 e IGF-1 [5, 249].

Experimentos com o modelo de metástase murina B16F10 de melanoma demonstraram que as células transfectadas com PAR-1 exibiram potencial de metástase pulmonar substancialmente maior do que aquelas privadas de sinalização PAR-1 [4, 48]. PAR-1 promoveu melanoma metastático regulando o supressor de tumor Maspina e a proteína de junção comunicante Connexina 43. Villares et al. [253] determinou que Connexin 43 facilita a interação entre células malignas e ECs, e a expressão de maspina é diminuída em células de melanoma metastático, onde há uma correlação inversa entre PAR-1 e expressão de Maspina [254]. PAR-1 também promove a expressão da molécula de adesão celular de melanoma MCAM / MUC18 (MUC18), que é um marcador chave da metástase do melanoma. É de interesse que a atividade do PAR-1 aumenta a expressão do receptor do fator ativador de plaquetas (PAFR) e seu ligante e, portanto, não apenas promove a agregação plaquetária, mas também aumenta os níveis de MUC18. Isso é extremamente relevante para o processo metastático, pois foi demonstrado que a via PAR1 / PAFR / MUC18 medeia a adesão de células de melanoma a CE microvasculares, migração transendotelial e retenção metastática nos pulmões [251].

O silenciamento de PAR-1 e a inibição da trombina afetam a capacidade de disseminação das linhas celulares de melanoma metastático [21, 22, 251]. A inibição da atividade PAR em 80% por meio do uso de shRNA lentiviral diminui o potencial metastático do pulmão de linhas celulares de melanoma superexpressando PAR-1 [21]. O silenciamento de PAR-1 também inibe a expressão da proteína adesiva MUC18, que atenua o fenótipo metastático das células de melanoma [251].

Para reduzir as respostas imunes tóxicas da terapia viral, PAR-1 pequeno RNA interferente (siRNA) incorporado em lipossomas neutros (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina, DOPC) foi usado em experimentos em modelos de melanoma. Houve um declínio significativo no crescimento tumoral, peso e formação de colônias pulmonares metastáticas em camundongos tratados com o PAR-1 siRNA-DOPC [21]. A entrega de siRNA também resultou em um declínio nos níveis de expressão de VEGF, IL-8 e MMP-2 e diminuição da densidade de vasos sanguíneos. Em outro estudo, a redução da expressão de PAR-1 por siRNA e a inibição da função de PAR-1 pelo antagonista específico SCH79797 diminuíram significativamente a motilidade e invasividade das células de melanoma na extensão das células não metastáticas e de baixa expressão de PAR-1 [252 ] Um inibidor específico da trombina, argatroban, também diminui a migração e o potencial metastático ósseo das células de melanoma B16BL6 [22].

Esses achados sugerem que a estimulação do crescimento tumoral e metástase dependente de PAR-1 é regulada por fatores invasivos, adesivos e pró-angiogênicos e que PAR-1 pode ser um alvo terapêutico potencial para pacientes com melanoma metastático.

Resumo

A invasão e metástase de células tumorais envolve interações complexas entre as células mesenquimais e a matriz extracelular, bem como os componentes sanguíneos e os CEs. As proteases de coagulação, metaloproteases de matriz e serina proteases interagem com PARs, promovendo assim múltiplas atividades que levam à progressão do câncer. Mais estudos são necessários para converter o conhecimento teórico em valor prático.


Como funcionam as serpentes

As serpinas inibem a ação de suas respectivas serina proteases, imitando a estrutura tridimensional do substrato normal da protease.

  • A serina protease liga a serpina em vez de seu substrato normal. Isso por si só bloquearia qualquer outra atividade da protease. Mas a serpente tem outro truque para jogar.
  • A protease faz um corte na serpina levando a
    • a formação de uma ligação covalente ligando as duas moléculas
    • uma mudança alostérica maciça na estrutura terciária da serpina
    • que move a protease anexada para um local onde pode ser destruída.

    Borrelia burgdorferi, Proteases derivadas do hospedeiro e a barreira hematoencefálica

    FIGO. 1 O BMEC humano in vitro expressa a glicoproteína P e proteínas de junção apertada. (A) Monocamadas de BMEC humanas confluentes e subconfluentes foram levantadas com EDTA. As células foram fixadas com 2% de paraformaldeído em PBS por 30 min, permeabilizadas com PBS contendo 0,01% de Triton X-100 e extintas com 10 mM de glicina-PBS. Após bloqueio com soro de cabra normal a 10%, as células foram incubadas com anticorpo monoclonal de camundongo anti-glicoproteína P marcado com isotiocianato de fluoresceína e anticorpo policlonal de coelho anti-fator VIII-Rag, seguido de anticorpo secundário acoplado a ficoeritrina. A análise foi feita usando um FACScan e o software CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, Calif.). As percentagens de BMEC humano bloqueado positivo para fator VIII-Rag e glicoproteína P são mostradas. (B) Monocamadas de BMEC humanas foram fixadas com paraformaldeído a 4%, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,5% e coradas com anticorpo monoclonal ZO-1 anti-humano. A presença de ZO-1 foi visualizada com anticorpo secundário conjugado com Alexa 488. As imagens de contraste de interferência diferencial (painel esquerdo) e fluorescência (painel direito) de BMEC humano mostraram que ZO-1 é expresso nas junções celulares. Ampliação, × 400. FIGO. 2 Modelo in vitro para B. burgdodrferi 297 cruzando o BBB humano. Um total de 10 7 B. burgdodrferi 297 (Bb) as células foram incubadas durante a noite com BMEC humano cultivado até a confluência em inserções Transwell. (A) A microscopia de campo escuro foi usada para determinar o número de espiroquetas que cruzaram as monocamadas. Os dados de dois experimentos independentes com determinações em triplicado são expressos como as porcentagens de B. burgdorferi (médias ± erros padrão das médias) que cruzaram em relação ao número total de espiroquetas em poços de controle sem inserções. (Inserção) Comparação de B. burgdorferi cruzamento com BMEC humano (bar +) ou sem BMEC humano (bar -). (B) TEER expresso como médias ± erros padrão das médias para os experimentos mostrados no painel A. Cont, controle. FIGO. 3 B. burgdorferi cruza diferencialmente as monocamadas BMEC e HUVEC (EA.hy926) humanas. Um total de 10 6 B. burgdodrferi 297 (Bb) as células foram incubadas durante a noite com BMEC humano ou HUVEC (EAhy.926) cultivadas até a confluência em inserções Transwell. (A) A microscopia de campo escuro foi usada para determinar o número de espiroquetas que cruzaram as monocamadas BMEC ou HUVEC humanas. (B) PCR em tempo real com base na cópia única B. burgdorferi sensu stricto fla gene (50) foi usado para determinar o número de espiroquetas que cruzaram monocamadas de BMEC ou HUVEC humanos nos experimentos cujos resultados são mostrados no painel A. Os dados de determinações em triplicado são expressos como as porcentagens de B. burgdorferi (médias ± erros padrão das médias) que cruzaram em relação ao número total de espiroquetas em poços de controle sem inserções. (C) TEER medido como resistência média (médias ± erros padrão das médias) para os experimentos cujos resultados são mostrados nos painéis A e B, conforme descrito em Materiais e Métodos. o P valores (conforme determinado por um aluno emparelhado t teste) para as mudanças de TEER nas amostras de HUVEC de 5 e 18 h foram 0,019 e 0,017, respectivamente (indicado por asteriscos). Cont, controle. FIGO. 4 Ativação de plasminogênio por coculturas de B. burgdorferi e BMEC humano. BMEC humanos foram cultivados em placas de 96 poços até atingirem a confluência (aproximadamente 10 5 células). O meio foi trocado por meio DMEM — F-12 e, no dia seguinte, quantidades crescentes de B. burgdorferi Adicionou-se N40 (0, 10 3, 10 4, 10 5 células). (A) Ativação de plasminogênio por BMEC humano em resposta à adição de espiroquetas. Vinte e quatro horas após a adição das espiroquetas, os sobrenadantes das culturas foram coletados e incubados com 1 μg de plasminogênio humano por ml e 5 mM de Spectrozyme PL. O aumento da absorvância a 405 nm foi diretamente proporcional à quantidade de plasmina em uma determinada amostra. As barras de erro indicam os desvios padrão com base em seis experimentos realizados em duplicata. (B) Ligação do ativador de plasminogênio do tipo uroquinase exógeno a BMEC humano após adição de espiroquetas. As culturas foram lavadas três vezes com PBS antes da adição de 125 U de uPA humano recombinante por ml. Após uma incubação de 60 min, as culturas foram novamente lavadas três vezes com PBS. Após a lavagem, 200 μl de PBS contendo 1 μg de plasminogênio por ml foram adicionados junto com 5 mM Spectrozyme PL. O aumento da absorbância em 405 nm foi determinado após 3 h. Observe o aumento da capacidade de B. burgdorferi N40 para estimular a ligação de BMEC humano a uPA e ativação de plasminogênio em comparação com culturas de controle incubadas com espiroquetas. As barras de erro indicam os desvios padrão com base em três experimentos realizados em duplicata. FIGO. 5 Papel das proteases em B. burgdorferi (Bb) transmigração através do BMEC humano. Condições de redução de soro foram usadas para examinar o papel das proteases do hospedeiro na transmigração de espiroquetas através de BMEC humano, conforme descrito em Materiais e Métodos e a legenda da Fig. 4. A travessia de BMEC humano por B. burgdorferi O N40 foi examinado na presença de 1 μg de plasminogênio por ml. A travessia do BMEC humano por B. burgdorferi N40 com 50 nM BB-94 sozinho, com 200 μM EACA sozinho, com ambos BB-94 e EACA, ou com 40 μg de α2-antiplasmina por ml é mostrado. Os resultados são as médias de dois experimentos realizados em duplicata. As barras de erro indicam os desvios padrão. FIGO. 6 Expressão de MMP-1 em resposta a B. burgdorferi. Um total de 10 5 BMEC humanos foram inoculados com quantidades crescentes de B. burgdorferi N40. Após 24 h, os sobrenadantes da cultura celular foram colhidos e testados por análise de imunotransferência com o anticorpo criado contra MMP-1. Observe os níveis aumentados de MMP-1 com o aumento do número de B. burgdorferi células.



Comentários:

  1. Byram

    Eu aceito com prazer.

  2. Nigrel

    Sinto muito, mas, em minha opinião, você está enganado. Eu posso defender a posição. Escreva para mim em PM, vamos conversar.

  3. Garwood

    Eu parabenizo, você foi visitado com uma ideia notável

  4. Stanwood

    Que palavras certas ... super

  5. Maktilar

    Parabéns, acho que essa é uma ideia brilhante.

  6. Mojag

    Autor, muito obrigado. Por favor, faça a fonte no blog um pouco maior. E então os olhos já doem.



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