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Precisão da estimativa do tamanho do genoma por citometria de fluxo

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Estou trabalhando em um projeto genoma e usando um em sílico k-mer análise para estimar o tamanho do nosso genoma com base nas leituras Illumina disponíveis. o k-estimativa baseada no mercado é consistente em uma ampla gama de k valores, mas é substancialmente menor do que a estimativa anterior com base na citometria de fluxo (descrito em Procedimentos experimentais deste artigo). Quão precisas são as estimativas do tamanho do genoma com base na citometria de fluxo?


A cada dia, conforme aumenta a quantidade de dados genômicos e recursos de bioinformática, os pesquisadores são cada vez mais desafiados a selecionar a abordagem mais adequada para analisar seus dados. Além disso, a oportunidade de realizar análises genômicas comparativas está crescendo rapidamente. Isso é especialmente verdadeiro para fungos devido aos seus pequenos tamanhos de genoma (ou seja, média 1C = 44,2 Mb). Dadas essas oportunidades e com o objetivo de obter novos insights sobre a evolução dos mutualismos, nos concentramos em comparar a qualidade de conjuntos de genomas inteiros para cultivares de formigas cultivadoras de fungos (Hymenoptera: Formicidae: Attini) e um parente de vida livre. Nossas análises revelam que as metodologias e pipelines atualmente disponíveis para analisar os dados da sequência do genoma completo precisam de refinamento. Usando diferentes montadores de genoma, mostramos que o tamanho da montagem do genoma depende de qual software é usado. Isso, por sua vez, impacta as previsões do número do gene, com números de genes mais altos se correlacionando positivamente com o tamanho da montagem do genoma. Além disso, a maioria dos dados de tamanho do genoma fúngico atualmente disponíveis são baseados em estimativas derivadas de conjuntos do genoma inteiro gerados a partir de dados de genoma de leitura curta, em vez da técnica mais precisa de citometria de fluxo. Aqui, estimamos os tamanhos do genoma haplóide de três formigas fúngicas simbiontes por citometria de fluxo usando o fungo Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. (1871) como um padrão de calibração. Descobrimos que os tamanhos de genoma publicados com base em conjuntos de genomas são 2,5 a 3 vezes maiores do que nossas estimativas com base na citometria de fluxo. Portanto, recomendamos que a citometria de fluxo seja usada para pré-calibrar os pipelines de montagem do genoma, para evitar estimativas incorretas dos tamanhos do genoma e garantir montagens robustas.

O sequenciamento e as análises do genoma estão aumentando diariamente devido aos custos decrescentes; no entanto, analisar os dados pode ser difícil às vezes devido à grande disponibilidade de software que pode levar a montagens errôneas do genoma. Em nosso estudo, mostramos que diferentes softwares podem levar a conclusões diferentes para os mesmos dados do genoma, ou seja, quando a montagem do genoma é maior, o número de genes que se pode prever a partir dessa montagem também aumenta. Mostramos que, medindo com precisão o tamanho do genoma usando citometria de fluxo, os dados resultantes podem ajudar como um controle de qualidade para os conjuntos do genoma.


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Análise de tamanhos de genoma de planta usando citometria de fluxo: um estudo de caso demonstrando faixa dinâmica e linearidade de medição

Os citômetros de fluxo foram originalmente projetados para operar com suspensões de células, prototipicamente células sanguíneas, e a maioria das aplicações ainda envolve amostras desse tipo. Apesar de as células vegetais e seus protoplastos serem geralmente maiores do que as células sanguíneas de mamíferos, essas células ainda podem ser analisadas por citometria de fluxo. Na maioria dos estágios de crescimento, as plantas superiores são compostas de tecidos e órgãos, complexos conjuntos tridimensionais de células mantidas juntas por paredes celulares. Consequentemente, antes da análise, as plantas devem ser primeiro processadas para produzir suspensões celulares que sejam compatíveis com a citometria de fluxo. Uma abordagem é dissolver as paredes celulares, usando enzimas que hidrolisam seus componentes de carboidratos, para liberar protoplastos, que podem ser facilmente analisados ​​no citômetro.

A segunda abordagem, detalhada aqui com o CytoFLEX, envolve a análise não de protoplastos, mas de suspensões de núcleos liberados de tecidos e órgãos vegetais por meio de um procedimento simples de corte (2). O procedimento envolve o corte aberto das células dentro dos tecidos usando uma lâmina de barbear de dois gumes padrão. O homogenato é clarificado usando um filtro de malha de náilon através do qual os núcleos liberados são passados. Os núcleos são então corados com fluorocromos específicos para DNA, o que permite a determinação por citometria de fluxo do conteúdo de DNA de cada núcleo. O interesse na medição dos tamanhos do genoma vegetal deriva da observação de que plantas superiores, quando analisadas entre as espécies, exibem uma gama extraordinariamente grande de tamanhos de genoma: um limite inferior atual de cerca de 0,13 pg por núcleo 2C para Genlisea margaretae até um limite superior de 304,40 pg para Paris japonica (3). O último genoma é cerca de 50 vezes maior que o genoma humano, e o DNA de uma única célula de Paris japonica, quando esticado, se estenderia por aproximadamente 91 metros.

A citometria de fluxo juntamente com o procedimento de corte fornece um meio simples de determinar os tamanhos do genoma que é geralmente aplicável em todas as espécies e a metodologia foi amplamente adotada em todo o mundo para resolver vários problemas em biologia básica e aplicada, ecologia e agricultura. Isso inclui aplicações em biotecnologia, como monitoramento da estabilidade genética após transformação e cultura de tecidos, priorização de espécies para sequenciamento de genoma completo, validação da integridade de conjuntos de genoma completo e fornecimento de planejamento apropriado para procedimentos de engenharia genética, como produção de biblioteca de DNA. As aplicações na agricultura que se beneficiam da citometria de fluxo incluem a produção de linhas haplóides e dihaplóides usando cultura de anteras / ovários, seguida de duplicação de colchicina, produção de linhas triplóides estéreis de sementes, produção de plantas com níveis tetraplóides e ploidia mais elevados, associados a características desejadas, como tamanho do fruto, controle de qualidade do status de euploidia para lotes de sementes comerciais, identificação de indivíduos com novos níveis de ploidia e exibindo novos modos de reprodução (incluindo apomixia), caracterização de hibridização interespecífica com base em conteúdos intermediários de DNA nuclear, classificação de distribuições de ploidia em coleções de germoplasma, determinação do sexo em plantas dióicas e identificação de híbridos formados entre espécies silvestres e entre espécies silvestres e cultivadas.

Aplicações em anatomia vegetal, biologia celular, fisiologia e desenvolvimento que se beneficiam da citometria de fluxo incluem o estudo da regulação do ciclo de divisão celular e da endreduplicação no desenvolvimento da planta e os efeitos do estresse abiótico e biótico nesses processos. A citometria de fluxo também levou a investigações generalizadas sobre o conceito de nucleótipo, ou seja, o efeito fenotípico da quantidade de DNA nuclear, independente de seu conteúdo informacional codificado, sobre o volume nuclear, as proporções do núcleo ocupado pelos cromossomos, as durações de mitose e meiose, tamanho da semente e tempo mínimo de geração. A citometria de fluxo também é útil para a detecção de mixoploidia e quimerismo. A análise da expressão gênica em função do tipo de célula, usando núcleos classificados por fluxo, é cada vez mais reconhecida como um importante campo de pesquisa. Em taxonomia e sistemática, a citometria de fluxo é inestimável na triagem de modos de reprodução, identificação de especiação e isolamento reprodutivo, descrição da dinâmica populacional em zonas híbridas, descoberta de novos citótipos e da estrutura do citótipo sobre populações em grande escala, detecção e delimitação de plantas espécies para a biodiversidade e conservação, estudos dos mecanismos de evolução do genoma vegetal com foco nas causas e consequências da variação do conteúdo do DNA nuclear e informações sobre a evolução provenientes do estudo do conteúdo do DNA nuclear entre filogenias. Análises comparativas em larga escala do tamanho do genoma também podem ser usadas para estudar correlações entre o tamanho do genoma e fatores ambientais, entre o tamanho do genoma e a massa da semente, entre o tamanho do genoma e a riqueza de espécies em diferentes grupos de plantas, com a sugestão de que as espécies com grandes genomas podem ser mais suscetíveis à extinção, entre o tamanho do genoma e o potencial invasor, e entre o nicho ecológico e o tamanho mínimo do genoma (principalmente plantas carnívoras).

Como consequência do rápido aumento do nível de interesse em análises de citometria de fluxo deste tipo, e do número cada vez maior de espécies para as quais os dados estão sendo publicados, repositórios pesquisáveis ​​surgiram como um recurso valioso para atribuição de conteúdo de DNA a tamanhos de genoma, por meio fornecendo relacionamentos de calibração, com o consenso sendo abordado de forma coletiva. Um dos mais importantes desses recursos é o banco de dados Kew C-value, com curadoria de especialistas, que fornece valores de conteúdo de DNA nuclear em função de gênero e espécie, de forma pesquisável na internet (3). Os curadores também definem valores de conteúdo de DNA nuclear "padrão Gold", que se acredita serem mais precisos e reproduzíveis (3). No geral, as estimativas de citometria de fluxo dos conteúdos de DNA nuclear são comparáveis ​​aos tamanhos dos conjuntos do sequenciamento do genoma inteiro, embora a presença de DNA cromossômico altamente repetitivo normalmente leve a estimativas de tamanho de genoma mais baixas obtidas a partir de abordagens baseadas em sequência. Vários fatores que têm o potencial de confundir a calibração de citometria de fluxo foram identificados e podem ser evitados. Por exemplo, a ligação e fluorescência resultante de alguns fluorocromos específicos de DNA é específica de par de bases e, portanto, não é uma medida verdadeira da quantidade de DNA em espécies com genomas nucleares com diferentes razões AT: GC.

Neste protocolo, empregamos iodeto de propídio (PI) como o DNA fluorocromo. Na presença de ribonuclease para eliminar contribuições para a fluorescência por RNA de fita dupla, PI intercala a dupla hélice de DNA, produzindo fluorescência intensa com um máximo de excitação em torno de 535 nm e um máximo de emissão em 617 nm. O perfil de emissão é relativamente amplo, tendo uma largura espectral máxima de 50% abrangendo aproximadamente 100 nm (590-690 nm).

PI foi usado para avaliar o conteúdo de DNA de quatro espécies: Arabidopsis thaliana (thale cress) Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (milho) e Capsicum annuum (pimenta). Os órgãos usados ​​para preparar as amostras de Arabidopsis e Capsicum ilustram o interessante fenômeno da endoreduplicação, em que as células somáticas entram em rodadas sucessivas de replicação do genoma (fase S) sem uma mitose intermediária (4). Esse processo endocíclico resulta em poliploidia, comum em plantas (7).

Figura. A citometria de fluxo mede efetivamente a endoreplicação em células vegetais. A imagem certa mostra vários tipos de replicação de genes mitóticos durante o ciclo celular. Esses eventos resultam em tecidos poliplóides. À esquerda, o fluxo de trabalho para a preparação de tecidos vegetais por citometria de fluxo é representado, incluindo os dados que indicam os resultados da endociclagem mitótica.


2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal

Um total de 127 acessos rotulados como Festuca ovina de 20 países foram obtidos da Rede de Informação de Recursos de Germoplasma do USDA (GRIN) em 2016 (Tabela Suplementar S1). As sementes de cada acesso foram semeadas em vasos de estufa (tamanho de dez centímetros) preenchidos com solo BRK Promix (Premier Tech) no Plant Growth Facility da University of Minnesota em St. Paul. Depois de atingir o estágio de quatro a cinco folhas, cinco mudas por acesso foram selecionadas aleatoriamente e transplantadas para um recipiente de cone individual de uma polegada. As plantas foram cultivadas com 16 horas de dia e 8 horas de noite com irrigação biliar e fertilização semanal usando fertilizante Peat-lite 20-10-20 (J.R. Peters Inc.) com sulfato de amônio suplementar e ferro quelado mais Mn (BASF). Os cinco genótipos de cada acesso foram clonados vegetativamente em seis replicações de cada genótipo e transplantados para um viveiro de campo na Estação Experimental de Minnesota em St. Paul, MN. Festuca ovina ‘Quatro’ e F. brevipila ‘Beacon’ também foram plantados no campo como padrões.

2.2 Procedimento de citometria de fluxo

Para determinar o conteúdo de DNA nuclear dos acessos, foi realizada citometria de fluxo pelo método descrito por Arumuganathan e Earle (1991). Como as sementes utilizadas neste estudo resultaram de polinização aberta, avaliamos três genótipos para cada acesso para obter uma representação mais precisa da ploidia da população. Quando os três genótipos selecionados não estavam no mesmo nível de ploidia, um quarto genótipo foi avaliado. O nível de ploidia do acesso foi determinado pela ploidia da maioria dos genótipos (75%).

Fresco, maduro F. ovina as amostras de folhas no campo do viveiro foram colhidas entre 9h00 e 11h00 e aparadas para 1–2 cm e usadas para citometria de fluxo. O tecido da folha do azevém perene foi colhido ao mesmo tempo na estufa. Para cada amostra, a solução de coloração de citometria de fluxo continha 4,29 μl de iodeto de propídio, 0,71 ml de tampão de coloração CyStain UV Precise P e 2,14 μl de RNAseA. Para preparar o tecido da planta, uma amostra de folha de 0,5 por 0,5 cm foi excisada em pequenos pedaços usando uma lâmina de barbear em 500 μl de tampão de extração CyStain UV Precise P (Sysmex) e passada por um filtro de 50 μl (Sysmex). A solução de coloração foi adicionada ao fluxo para colorir os núcleos em cada amostra. As amostras foram armazenadas em gelo antes de carregar o citômetro de fluxo. A citometria de fluxo foi realizada usando o instrumento BD LSRII H4760 (BD Biosciences) com detector a laser PI usando 480 V com um mínimo de 1.000 eventos no recurso de citometria de fluxo da Universidade de Minnesota. Os dados foram visualizados e analisados ​​no software BD Biosciences FACSDiva 8.0.1.

2.3 Estimativa do conteúdo de DNA e determinação do nível de ploidia

2.4 Medição e comparação do tamanho da semente

Para medições do tamanho das sementes, coletamos sementes de acessos com níveis comuns de ploidia para realizar a comparação do tamanho das sementes (um total de 92 acessos). Tetraploid Quatro e hexaplóide Beacon também foram incluídos como referências. As sementes foram espalhadas em um scanner digital (scanner de mesa Epson perfection v6, Nagano, Japão) e escaneadas a 600 pontos por polegada com o tamanho de 2.169 por 7.019 pixels. As imagens foram processadas com um script Python personalizado (https://github.com/joanmanbar/seed_morphology) que transformou as imagens originais para medir o comprimento e a largura da semente, respectivamente, como o comprimento (em pixels) dos eixos maior e menor de um elipse ajustada, enquanto a área foi calculada como o número de pixels na semente. A área de sementes foi calculada para pelo menos 10 sementes para cada uma das 92 entradas. A área da semente foi usada para analisar a correlação entre o nível de ploidia e o tamanho da semente e visualizada usando o pacote ggplot2 em R (Kahle & Wickham, 2013).


Resumo

Clusterbean (C. tetragonoloba) é uma importante cultura leguminosa vegetal e industrial com vasta diversidade genética, mas escassa informação genética, citológica e genômica. No presente estudo, um procedimento otimizado de citometria de fluxo foi utilizado para estimar o tamanho do genoma de três espécies de feijoeiro, representado por C. tetragonoloba (cv. RGC-936) e dois parentes selvagens (C. serreta e C. senegalensis) Para uma estimativa precisa do conteúdo genômico, singleto G0/ G1 populações de múltiplos tecidos, como folhas, hipocótilo e sementes maduras foram determinadas e usadas junto com três espécies de plantas diferentes viz. Pisum sativum (como primário), Oryza sativa, e Glicina max (secundário), como padrões de referência externos e internos. Tecido de semente da amostra de teste e G. max forneceu a melhor estimativa do conteúdo de DNA nuclear em comparação com outros tecidos de amostra e padrões de referência. O tamanho do genoma de C. tetragonoloba foi determinado em 580,9 ± 0,02 Mbp (1C), enquanto o de C. serreta e C. senegalensis foi estimado em 979,6 ± 0,02 Mbp (1C) e 943,4 ± 0,03 Mbp (1C), respectivamente. Assim, os parentes selvagens abrigam quase o dobro do conteúdo do genoma do feijão de cacho cultivado. Os resultados deste estudo irão enriquecer o banco de dados genômico da família das leguminosas e podem servir como ponto de partida para estudos evolutivos e genômicos do feijão cluster.


Análise de tamanhos de genoma de planta usando citometria de fluxo: um estudo de caso demonstrando faixa dinâmica e linearidade de medição

Os citômetros de fluxo foram originalmente projetados para operar com suspensões de células, prototipicamente células sanguíneas, e a maioria das aplicações ainda envolve amostras desse tipo. Apesar de as células vegetais e seus protoplastos serem geralmente maiores do que as células sanguíneas de mamíferos, essas células ainda podem ser analisadas por citometria de fluxo. Na maioria dos estágios de crescimento, as plantas superiores são compostas de tecidos e órgãos, complexos conjuntos tridimensionais de células mantidos juntos por paredes celulares. Consequentemente, antes da análise, as plantas devem ser primeiro processadas para produzir suspensões celulares que sejam compatíveis com a citometria de fluxo. Uma abordagem é dissolver as paredes celulares, usando enzimas que hidrolisam seus componentes de carboidratos, para liberar protoplastos, que podem ser facilmente analisados ​​no citômetro.

A segunda abordagem, detalhada aqui com o CytoFLEX, envolve a análise não de protoplastos, mas de suspensões de núcleos liberados de tecidos e órgãos vegetais por meio de um procedimento simples de corte (2). O procedimento envolve o corte aberto das células dentro dos tecidos usando uma lâmina de barbear de dois gumes padrão. O homogenato é clarificado usando um filtro de malha de náilon através do qual os núcleos liberados são passados. Os núcleos são então corados com fluorocromos específicos para DNA, o que permite a determinação por citometria de fluxo do conteúdo de DNA de cada núcleo. O interesse na medição dos tamanhos do genoma vegetal deriva da observação de que plantas superiores, quando analisadas entre as espécies, exibem uma gama extraordinariamente grande de tamanhos de genoma: um limite inferior atual de cerca de 0,13 pg por núcleo 2C para Genlisea margaretae até um limite superior de 304,40 pg para Paris japonica (3). O último genoma é cerca de 50 vezes maior do que o genoma humano, e o DNA de uma única célula de Paris japonica, quando esticado, se estenderia por aproximadamente 91 metros.

A citometria de fluxo juntamente com o procedimento de corte fornece um meio simples de determinar os tamanhos do genoma que é geralmente aplicável em todas as espécies e a metodologia foi amplamente adotada em todo o mundo para resolver vários problemas em biologia básica e aplicada, ecologia e agricultura. Isso inclui aplicações em biotecnologia, como monitoramento da estabilidade genética após transformação e cultura de tecidos, priorização de espécies para sequenciamento de genoma completo, validação da integridade de conjuntos de genoma completo e fornecimento de planejamento apropriado para procedimentos de engenharia genética, como produção de biblioteca de DNA. As aplicações na agricultura que se beneficiam da citometria de fluxo incluem a produção de linhas haplóides e dihaplóides usando cultura de anteras / ovários, seguida de duplicação de colchicina, produção de linhas triplóides estéreis de sementes, produção de plantas com níveis tetraplóides e ploidia mais elevados, associados a características desejadas, como tamanho do fruto, controle de qualidade do status de euploidia para lotes de sementes comerciais, identificação de indivíduos com novos níveis de ploidia e exibindo novos modos de reprodução (incluindo apomixia), caracterização de hibridização interespecífica com base em conteúdos intermediários de DNA nuclear, classificação de distribuições de ploidia em coleções de germoplasma, determinação do sexo em plantas dióicas e identificação de híbridos formados entre espécies silvestres e entre espécies silvestres e cultivadas.

Aplicações em anatomia vegetal, biologia celular, fisiologia e desenvolvimento que se beneficiam da citometria de fluxo incluem o estudo da regulação do ciclo de divisão celular e da endreduplicação no desenvolvimento da planta e os efeitos do estresse abiótico e biótico nesses processos. A citometria de fluxo também levou a investigações generalizadas sobre o conceito de nucleótipo, ou seja, o efeito fenotípico da quantidade de DNA nuclear, independente de seu conteúdo informacional codificado, sobre o volume nuclear, as proporções do núcleo ocupado pelos cromossomos, as durações de mitose e meiose, tamanho da semente e tempo mínimo de geração. A citometria de fluxo também é útil para a detecção de mixoploidia e quimerismo. A análise da expressão gênica em função do tipo de célula, usando núcleos classificados por fluxo, é cada vez mais reconhecida como um importante campo de pesquisa. Em taxonomia e sistemática, a citometria de fluxo é inestimável na triagem de modos de reprodução, identificação de especiação e isolamento reprodutivo, descrição da dinâmica populacional em zonas híbridas, descoberta de novos citótipos e da estrutura do citótipo sobre populações em grande escala, detecção e delimitação de plantas espécies para a biodiversidade e conservação, estudos dos mecanismos de evolução do genoma vegetal com foco nas causas e consequências da variação do conteúdo do DNA nuclear e informações sobre a evolução provenientes do estudo do conteúdo do DNA nuclear entre filogenias. Análises comparativas em larga escala do tamanho do genoma também podem ser usadas para estudar correlações entre o tamanho do genoma e fatores ambientais, entre o tamanho do genoma e a massa da semente, entre o tamanho do genoma e a riqueza de espécies em diferentes grupos de plantas, com a sugestão de que as espécies com grandes genomas podem ser mais suscetíveis à extinção, entre o tamanho do genoma e o potencial invasor, e entre o nicho ecológico e o tamanho mínimo do genoma (principalmente plantas carnívoras).

Como consequência do rápido aumento do nível de interesse em análises de citometria de fluxo deste tipo, e do número cada vez maior de espécies para as quais os dados estão sendo publicados, repositórios pesquisáveis ​​surgiram como um recurso valioso para atribuição de conteúdo de DNA a tamanhos de genoma, por meio fornecendo relacionamentos de calibração, com o consenso sendo abordado de forma coletiva. Um dos mais importantes desses recursos é o banco de dados Kew C-value, com curadoria de especialistas, que fornece valores de conteúdo de DNA nuclear em função de gênero e espécie, de forma pesquisável na internet (3). Os curadores também definem valores de conteúdo de DNA nuclear "padrão Gold", que se acredita serem mais precisos e reproduzíveis (3). No geral, as estimativas de citometria de fluxo dos conteúdos de DNA nuclear são comparáveis ​​aos tamanhos dos conjuntos do sequenciamento do genoma inteiro, embora a presença de DNA cromossômico altamente repetitivo normalmente leve a estimativas de tamanho de genoma mais baixas obtidas a partir de abordagens baseadas em sequência. Vários fatores que têm o potencial de confundir a calibração de citometria de fluxo foram identificados e podem ser evitados. Por exemplo, a ligação e fluorescência resultante de alguns fluorocromos específicos de DNA é específica de par de bases e, portanto, não é uma medida verdadeira da quantidade de DNA em espécies com genomas nucleares com diferentes razões AT: GC.

Neste protocolo, empregamos iodeto de propídio (PI) como o DNA fluorocromo. Na presença de ribonuclease para eliminar contribuições para a fluorescência por RNA de fita dupla, PI intercala a dupla hélice de DNA, produzindo fluorescência intensa com um máximo de excitação em torno de 535 nm e um máximo de emissão em 617 nm. O perfil de emissão é relativamente amplo, tendo uma largura espectral máxima de 50% abrangendo aproximadamente 100 nm (590-690 nm).

PI foi usado para avaliar o conteúdo de DNA de quatro espécies: Arabidopsis thaliana (thale cress) Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (milho) e Capsicum annuum (pimenta). Os órgãos usados ​​para preparar as amostras de Arabidopsis e Capsicum ilustram o interessante fenômeno da endoreduplicação, em que as células somáticas entram em rodadas sucessivas de replicação do genoma (fase S) sem uma mitose intermediária (4). Esse processo endocíclico resulta em poliploidia, comum em plantas (7).

Figura. A citometria de fluxo mede efetivamente a endoreplicação em células vegetais. A imagem certa mostra vários tipos de replicação de genes mitóticos durante o ciclo celular. Esses eventos resultam em tecidos poliplóides. À esquerda, o fluxo de trabalho para a preparação de tecidos vegetais por citometria de fluxo é representado, incluindo os dados que indicam os resultados da endociclagem mitótica.


Sobre a aplicação da citometria de fluxo na determinação do tamanho genômico de plantas de bambu

Doi: 10.11833 / j.issn.2095-0756.20200212
  • Data de recebimento: 2020-03-18
  • Data de registro de rev: 2020-09-28
  • Disponível: 2021-01-21
  • Data de publicação: 2021-01-21

Resumo: Objetivo Esta pesquisa tem como objetivo estudar os efeitos do tecido material e do método de tratamento no tamanho do genoma de plantas de bambu com o objetivo final de melhorar a precisão da determinação do tamanho do genoma de plantas de bambu. Método Com as folhas e brotos de diferentes espécies de bambu selecionados como materiais, e o arroz usado como padrão de referência, enquanto o tempo de coloração nuclear definido para 9 gradientes diferentes, ou seja, 1, 3, 5, 7, 9, 12, 18, 24 e 30 minutos, foi realizada uma investigação dos locais de tecido e materiais de coloração de diferentes plantas de bambu com o emprego de citometria de fluxo. Resultado (1) Com a mesma espécie de bambu, as folhas e os brotos eram semelhantes no pico de fluorescência e no tamanho do genoma, com a diferença de tamanho do genoma variando tão estreita quanto 0,04

0,20 pág. (2) As 12 espécies de bambu são diferentes em seu tempo de coloração nuclear, com a intensidade de fluorescência de Sinobambusa tootsik, Sinobambusa tootisik f. albo-estriata, Pseudosasa japonica var. tsutsumiana, Pseudosasa japonica f. Akebono, Indocalamus decorus, Sasaella glabra f. albo-estriata e Chimonobambusa mamorea f. Variegata atingindo o máximo em 1 minuto, o de Bambusa multiplex e Phyllostachys sulphurea atingindo o máximo em 3 minutos, o de Pseudosasa amabilis var. amabilis e Thyrsostachy ssiamensis atingindo o máximo em 5 minutos, enquanto o de Phyllostachys sulphurea (folha) atingindo o máximo em 7 minutos. (3) A intensidade de fluorescência dos 12 bambus varia muito de 1 a 30 minutos, todos excedendo 5%, exceto para a folha de P. amabilis var. amabilis, T. ssiamensis, B. multiplex e o tiro de S. tootsik. Na verdade, a intensidade de fluorescência de P. japonica var. tsutsumiana e S. glabra f. albo-estriata atingiram 12,93% e 12,88%, respectivamente. (4) Quanto ao tamanho do genoma de 12 espécies de bambu, 2 espécies de bambu lenhosas tropicais de B. multiplex e T. ssiamensis mudou de (2,64 ± 0,54) pg para (2,69 ± 1,01) pg, no entanto, o das 10 espécies de bambu lenhoso temperado mudou de (3,76 ± 1,51) pg para (5,73 ± 1,85) pg das 10 espécies de bambu temperado, o genoma tamanho de Phyllostachys mudou de (3,76 ± 1,51) pg para (3,91 ± 0,95) pg, mas o do outro gênero de bambu mudou de (4,82 ± 0,54) pg para (5,73 ± 1,85) pg, que é obviamente maior do que Phyllostachys. Conclusão (1) As folhas e os brotos do bambu podem ser usados ​​como materiais experimentais para determinar os tamanhos do genoma por citometria de fluxo. O tempo de coloração nuclear tem um certo efeito na determinação do tamanho do genoma do bambu com 3 a 5 minutos como o tempo de coloração ideal. (2) O tamanho do genoma das espécies de bambu lenhoso tropical é obviamente menor do que o das espécies de bambu lenhoso temperado, enquanto entre as espécies de bambu lenhoso temperado, o tamanho do genoma de Phyllostachys é obviamente menor do que o das outras espécies de bambu do gênero. [Ch, 1 fig. 5 guia. 29 ref.]

流式细胞 术 是 指 利用 流式细胞 仪 对 悬浮 细胞 或 微粒 等 进行 分析 的 现代 分析 技术, 该 技术 可 对 一些 特异 的 细胞 和 染色体 等 进行 分析 和 分 选, 还可 对 动植物 基因 组 大小 倍.性 水平 等 进行 测定 和 分析 [1 - 3]。 在 分析 植物 基因 组 大小 过程 中, 与 传统 的 福尔 根 根 技术 相比, 流式细胞 术 具有 速度 快 、 准确性 高等 优点。 因此 , 目前 流.细胞 术 在 植物 基因 组 大小 研究 中 发挥 了 重要 的 作用, 约 265 种 菊 科 Asteraceae 植物 、 157 种 莎草 科 Cyperaceae 植物 及 191 种 毛茛.Ranúnculo植物 的 基因 组 大小 已 通过 流式细胞 仪 被 测定 [2, 4 - 7], 大量 植物 的C值 (指 单倍体 细胞核 的 DNA 含量) 数据库 已 建立 [8]。 基因 组 大小 信息 可 为 植物 系统 分类 、 基因 组 测序 及 重 测序 等 研究 提供 参考, 因此 , 提高 植物 基因 组 大小 测量 精度 至关重要 [9 - 10]。 竹类 植物 是 重要 的 森林 资源 , 全世界 约 119 属 1 482 种 , 在 中国 分布 的 约 37 属 500 余 种 , 变种 变 型 100 余 种 [11 - 13]。 在 竹类 植物 基因 组.研究 中 , 目前 仅有 毛竹Phyllostachys Edulis、 莪 莉 竹Olyra latifolia、 芸香 竹Raddia guianensis及 瓜 多 竹Guadua angustifolia等 竹 种 完成 了 全 基因 组 测序 工作, 在 整个 竹类 植物 中 所占 比例 还 不足 0,2% [10, 14 - 15]。 另外, 在 竹类 植物 基因 组 大小 研究 中, 目前 约 200 个 竹 种 的 基因.大小 通过 流式细胞 仪 被 测定 ,, 但 由于 不同 研究者 所 用 实验 内参 、 仪器 类型 及 实验 方法 不同, 部分 竹 种 在 测量 结果 间 间 存在 一定 差异 [16 - 19]。 流 式 样品 制作 主要 分为 细胞核 提取和 染色 2 个 步骤, 因 不同 植物 细胞 内含 物 及 代谢 物 成分 不同, 所 用 细胞核 提取 液 在 组成 上 存在 较大 差异。 研究者 们 往往 会 重点 关注 细胞核 提取 液 , 而 忽略 染色 时间 对 实验 的.影响。 因此, 为了 进一步 提高 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 精度, 本 研究 分析 了 样品 采集 部位 及 染色 时间 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 影响, 并 在 此 基础 上 揭示 了 种 对基因 组 大小, 以 期 为 竹类 植物 系统 分类 及 基因 组 测序 等 提供 参考.

1.1.材料

以 已 测序 的 水稻Oryza sativa为 参照 。12 个 竹 种 清单 及 采样 信息 见 表 1。 流式细胞 仪 分析 的 植物 材料 要求 是 新鲜 新鲜 幼嫩 的 组织 部位, 不能 进行 冷冻 和 干燥 等 处理。 竹类 植物 叶片 和 笋 均可 满足.要求 , 而且 方便 采集, 特别 是 竹笋 更 适合 长时间 保存。 唐.Sinobambusa tootsik、 茶 竿 竹Pseudosasa amabilis var. amabilis、 孝顺 竹Bambusa multiplex及 黄皮 刚 竹Phyllostachys sulphurea等 4 个 竹 种 同时 以 叶片 和 笋 为 材料, 花叶 唐 竹Sinobambusa tootisik f. albo-estriata、 黄皮 绿 筋 竹Phyllostachys sulphurea、 平安 竹Pseudosasa japonica var. tsutsumiana、 柳叶 细竹Thyrsostachy ssiamensis、 花叶 赤 竹Sasaella glabra f. albo-estriata、 美丽 箬竹Indocalamus decorus、 曙 筋 矢 竹Pseudosasa japonica f. Akebono及 红 秆 寒竹Chimonobambusa mamorea f. Variegata等 8 个 竹 种 主要 是 从 国内外 一些 竹 种 园 收集 而来。 这些 竹 种 数量 有限, 目前 尚无 笋, 因此 , 这 8 个 竹 种 均以 叶片 为 材料.

竹 种材料 来源经纬度竹 种材料 来源经纬度
孝顺 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E茶 竿 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
柳叶 细竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E平安 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
黄皮 刚 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E曙 筋 矢 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
黄皮 绿 筋 竹浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E花叶 赤 竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E美丽 箬竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E
花叶 唐 竹 浙江 农林 大学 翠竹 园 30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E红 秆 寒竹 浙江 农林 大学 智能 温室30 ° 09′14 ″ N, 119 ° 26′00 ″ E

Tabela 1. Descrição da distribuição geográfica de 12 espécies de bambu

1.2.方法

1.2.1.流式细胞 仪 样品 制备

对于 竹类 植物 叶片 样品, 选取 顶端 尚未 展开 的 心 叶 或 紧邻 心 叶 已 完全 展开 的 嫩叶 ; 对于 竹笋 样品 , 选择 新鲜 无 病虫害 的 嫩 笋 , 实验 过程 中 剥去 笋 壳。 用 双面 刀片 切.一段 面积 约 1 cm 2 或 厚度 约 1,0 mm 的 叶片 , 面积 约 0,25 cm 2 的 嫩 笋 置于 干净 的 培养皿 中 , 然后 向 培养皿 中 加入 500 μL 细胞核 提取 液 (cistain UV preciso P Nuclei Extraction Buffer , PARTEC , 编号 5003) 润湿 样品 , 用 锋利 的 双面 刀片 迅速 将 样品 样品 剁碎, 将 培养皿 倾斜 静置 1

2 min , 使 细胞核 提取 充分 充分 , 之后 向 培养皿 中 加入 2 mL DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) 染色液 (tampão de coloração de UV preciso de cistain UV , PARTEC , 编号 5003) 对 细胞核 进行 染色 , 然后 用30 目的 滤 头 将 样品 过滤 到 进 样 管 中, 准备 上 机 测 样.

1.2.2.流式细胞 仪 样品 测定

根据 前期 多次 预 实验 结果 , 设置 样品 染色 时间 为 1、3、5、7、9、12、18、24 和 30 min 共 9 个 梯度, 利用 流式细胞 仪 (Analisador de ploidia Partec CyFlow) 对 样品 进行测定。 为了 确保 测量 结果 的 准确性, 每次 实验 先 以 水稻 为 参照, 分析 已 测序 毛竹 的 基因 组 大小, 在 此 基础 上 再 对 其他 竹 种 基因 组 大小 进行 测量 和 分析。 为了 减少.种 设置 3 个 不同 重复, 变异 系数 控制 在 5% 以内。

1.2.3.不同 竹 种 的 DNA 含量 分析

登录C值 数据库 网站 (http://www.rbgkew.org.uk/cval/homepage.html) , 查出 水稻 二倍体 基因 组 对应 的 DNA 含量 2C为 1.0 pg , 并 推算 待测 竹 种 的 2C值 : 待测 竹 种 2C 值 (pg) = (待测 竹 种 峰值 / 水稻 峰值) × 水稻 2C 值 (1,0 pg) , 水稻 单倍体 基因 组 大小 为 466 Mb [20]。 据此 可以 推算 出 相应 竹 种 基因 组 对应 的 碱基 数.

2.1.竹类 植物 叶片 和 笋 基因 组 大小 测量 结果 分析

利用 流式细胞 仪 测定 植物 基因 组 大小 过程 中, 样品 峰 形状 是 判断 实验 结果 是否 可靠 的 重要 依据。 样品 处理 过程 中 细胞核 提取 质量 越好 , 相应 的 细胞 碎片 及 杂质 越. , 样品 峰 往往 表现 得 尖 而 细, 测量 误差 也 较小, 实验 结果 较为 可靠 ; 反之, 样品 处理 过程 中 产生 的 细胞 碎片 越 多 , 对应 的 杂 峰 也会 随之 增多 , 进而 影响 甚至 改变 ,.形状 , 实验 结果 往往 不 可靠。 从 图 1 可以 看出 : 孝顺 竹 、 唐 竹 、 茶 竿 竹 及 黄皮 刚 竹 等 4 个 竹 种 叶片 和 笋 所 呈现 的 峰 在 形状 上 均 尖 而 细.非常 少。 另外, 同一 竹 种 的 叶片 和 笋 对应 的 峰 形 和 峰值 也 十分 相似, 如 孝顺 竹 的 叶片 和 笋 均 表现 出 双峰 , 其中 左侧 较高 的 峰 为 2C细胞 所 对应 的 峰, 右侧 较低 的 峰 为 4C细胞 所 对应 的 峰, 且 相同 类型 细胞 对应 的 荧光 强度 值 也 几乎 一致 (图 1A1

Figura 1. Valor de pico do citômetro de fluxo de algumas folhas e brotos de bambu

理论上 , 荧光 强度 值 达到 最大, 说明 此时 细胞核 染色 最 充分, 获得 的 基因 组 大小 与其 真实 值 也 最接近。 为了 更 科学 地 对 竹类 植物 叶片 和 笋 对应 的 基因 组 大小 进行 比较 分析 , 以. 4)对应 的 基因 组 大小 并非 完全 吻合, 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 及 黄皮 刚 竹叶 片 对应 的 2C值 分别 为 (5,03 ± 2,33) 、 (4,82 ± 0,54) 、 (2,64 ± 0,50) 和 (3,76 ± 1,51) pg , 而 笋 对应 的 2C值 分别 为 (4,99 ± 1,56) 、 (5,02 ± 1,99) 、 (2,72 ± 0,59) 和 (3,86 ± 2,31) pg , 其中 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 及 黄皮 刚 竹叶 片 2C值 略 小于 笋 对应 的 2C值 , 差值 分别 为 0,20、0,10 和 0,08 pg , 而 唐 竹叶 片 2C值 比 其 笋 略大 0,04 pg (表 2)。 虽然 4 个 竹 种 叶片 和 笋 所获 基因 组 大小 并不 完全 吻合, 但是 差值 非常 小, 在 误差 允许 范围 内。 因此 , 对 竹类 植物.其 叶片 和 笋 均可 作为 其 基因 组 大小 研究 的 材料.

物种材料 部位2C值 ± 标准 差 / pg基因 组 大小 ±
标准 差 / Mb
水稻 叶片1.00±0.00860.00±0.00
唐 竹 叶片5.03±2.334 325.80±2.33
4.99±1.564 291.40±1.56
茶 竿 竹 叶片4.82±0.544 145.20±0.54
5.02±1.994 317.20±1.99
孝顺 竹 叶片2.64±0.542 270.40±0.54
2.72±0.592 339.20±0.59
黄皮 刚 竹叶片3.76±1.513 233.60±1.51
3.86±2.313 319.60±2.31

Mesa 2. Tamanho do genoma de folhas e brotos de 4 espécies de bambu

2.2.染色 时间 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 影响

表 3 表明 : 12 个 竹 种 在 一定 时间 内 达到 最大 荧光 强度 值 后, 随着 染色 时间 延长, , 荧光 强度 值 均有 不同 程度 的 减少 , 当 染色 时间 延长 到 30 min 时 , 大部分 竹 的 的 荧光强度 值 基本 减少 到 最小。 首先, 同一 竹 种 的 叶片 和 笋 的 染色 时 长 及 荧光 强度 变化 也不 完全相同。 以 唐 竹 为例, 叶片 染色 1 min.荧光 强度 值 不断 减少 , 当 染色 时间 延长 到 30 min 时 , 荧光 强度 值 减少 到 最小 , 约 减少 6,23%, 而 唐 竹笋 最大 荧光 强度 则 出现 在 3 min, 之后 随着 染色 时间 延长, 荧光 强度 不断. , 染色 30 min 时 , 其 荧光 强度 减少 到 119,75 ± 1,40 , 约 减少 2,67% (表 3 和 表 4)。 其次 , 12 个 竹 种 荧光 在 0

物种部位不同 染色 时间 对应 的 荧光 强度 峰值
1357912182430 minutos
水稻 24.67±0.3824.42±0.4824.2±0.5224.16±0.4224.07±0.3623.94±0.3823.8±0.3423.47±0.2723.15±0.24
唐 竹 123.98±2.33123.32±2.68122.24±3.14121.48±3.27120.81±2.72119.83±2.84118.59±3.08117.32±2.55116.25±2.19
121.85±1.51123.04±1.56122.77±1.23122.11±1.51121.86±0.78120.82±0.35120.67±0.09119.75±1.40119.87±0.60
茶 竿 竹 118.13±1.24118.81±0.59118.97±0.54118.52±1.03117.99±0.92116.27±1.73115.82±2.62115.75±2.24115.31±2.43
123.39±1.90123.67±2.00123.75±2.00123.18±2.09122.57±1.57121.37±1.87119.56±2.31118.80±1.68118.85±1.24
孝顺 竹 64.07±0.4465.20±0.5464.92±0.5964.63±0.2264.88±0.4464.54±0.8363.85±0.8363.70±0.8663.35±0.74
67.22±0.5966.90±1.1565.60±1.9764.72±2.0763.71±2.9062.85±3.1764.79±1.6460.61±5.9059.81±6.10
黄皮 刚 竹 91.20±1.8392.27±1.6092.50±1.5292.70±1.3692.54±1.3691.98±1.9190.64±2.2790.11±1.9387.70±1.09
95.21±1.8395.35±2.3194.46±3.3292.72±3.2292.09±2.8191.10±2.2889.01±2.7488.30±2.0387.66±1.87
黄皮 绿 筋 竹95.84±1.1996.37±0.9595.66±1.2295.74±1.2395.10±1.5394.68±1.8593.47±1.8192.32±2.2591.27±3.96
平安 竹 134.17±0.93133.44±0.57132.43±1.18131.34±1.49130.17±1.63129.10±1.93125.12±4.50122.36±6.36116.82±8.22
花叶 唐 竹 126.61±1.96125.97±1.71125.58±2.88124.25±2.10123.76±1.86122.98±2.18120.92±2.30118.80±3.17117.99±2.33
花叶 赤 竹 132.17±1.58131.67±1.67131.36±1.46129.64±2.47127.77±3.32124.73±3.37122.08±3.05118.56±3.82115.14±3.52
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85141.20±1.47140.06±2.06139.30±2.20138.50±1.63137.64±1.84135.40±2.90133.01±2.20129.62±3.47
美丽 箬竹 133.08±1.14132.59±2.03130.98±3.10130.03±2.85127.63±2.80125.61±3.61121.71±4.26119.82±5.21116.67±6.85
柳叶 细竹 65.67±1.4765.88±0.8366.25±1.0166.23±0.6866.09±0.4066.14±0.4266.39±0.8365.12±1.4763.30±0.96
红 秆 寒竹 132.82±0.97132.29±1.73131.62±1.88131.36±2.02130.12±2.22130.10±2.21127.39±3.91126.18±3.35123.87±3.58

Tabela 3. Valor médio sob diferentes tempos de tingimento de 12 espécies de bambu

竹 种材料 部位最大 荧光 强度最小 荧光 强度荧光 强度 减少 值变化 比例 /%
唐 竹 123.98±2.33116.25±2.197.736.23
123.04±1.56119.75±1.403.292.67
茶 竿 竹 118.97±0.54115.31±2.433.653.07
123.75±2.00118.80±1.684.954.00
孝顺 竹 65.20±0.5463.35±0.741.852.84
67.22±0.5959.81±6.107.4111.02
黄皮 刚 竹 92.70±1.3687.70±1.095.005.39
95.35±2.3187.66±1.877.698.07
黄皮 绿 筋 竹96.37±0.9591.27±3.965.105.30
平安 竹 134.17±0.93116.82±8.2217.3512.93
花叶 唐 竹 126.61±1.96117.99±2.338.626.81
花叶 赤 竹 132.17±1.58115.14±3.5217.0312.88
曙 筋 矢 竹 141.29±1.85129.62±3.4711.678.26
美丽 箬竹 133.08±1.14116.67±6.8516.4112.33
柳叶 细竹 66.39±0.8363.30±0.962.954.45
红 秆 寒竹 132.82±0.97123.87±3.588.956.74

Tabela 4. Mudança de intensidade de fluorescência de 12 bambus

另外 , 不同 竹 种 甚至 同一 竹 种 不同 组织 部位 对 染色 时间 反应 也不 完全相同。 以 叶片 材料 为例, 唐 竹 、 花叶 唐 竹 、 平安 竹 、 曙 筋 矢 竹 、 美丽 箬竹 、 花叶 赤 竹 红寒竹 染色 1 min 即 达到 最大 荧光 强度, 染色 时间 延长 到 3 min 时, 荧光 强度 略有 衰减, 但 减少 不明显 (表 3) ; 孝顺 竹 和 黄皮 绿 筋 竹 最大 荧光 强度 出现 在 3 min.与 1、5 min 对应 的 荧光 强度 相差 不明显 (表 3) ; 茶 竿 竹 和 柳叶 细竹 最大 荧光 强度 出现 在 5 min, 其中 茶 竿 竹 最大 荧光 强度 与其 3 min 时 的 荧光 强度 最接近 , 而.叶 细竹 最大 荧光 强度 强度 与其 7 min 时 的 荧光 强度 最接近 , 只有 黄皮 刚 竹 最大 荧光 强度 出现 在 7 min, 但 与 5、9 min 对应 的 峰值 十分 接近 (表 3)。 以 笋 为 材料. , 荧光 强度 随 染色体 时间 变化 情况 与 叶片 相似 , 其中 孝顺 竹 的 笋 最大 荧光 强度 出现 在 1 min, 唐 竹 和 黄皮 刚 竹 2 个 竹 种 笋 的 最大 荧光 强度 出现 在 3 min, 茶 竹 最大.出现 在 5 min (表 3)。 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 孝顺 竹 和 黄皮 刚 竹 竹 4 个 竹 种 同时 以 以 叶片 和 笋 为 材料, 但是 叶片 和 笋 对应 的 荧光 曲线 图 也不 完全相同 , 例如.刚 竹笋 的 最大 荧光 强度 出现 在 3 min, 叶片 最大 荧光 强度 却 出现 在 7 min (表 3)。 综上所述, 无论 是 叶片 还是 竹笋, 当 染色 时间 延长 到 3 min 时, 75% 的 竹.已 达到 最大 荧光 强度 值 , 延长 到 5 min 时 , 已有 91,67% 的 竹 种 达到 最大 荧光 强度 值。 因此, 为 确保 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 的 准确性, 竹类 植物 染色 时间 最好 控制. 7 min 以内 , 以 3

2.3. 12 个 不同 属 种 竹 种 的 基因 组 大小.

表 5 表明 : 孝顺 竹 和 柳叶 细竹 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (2,64 ± 0,54) 和 (2,69 ± 1,01) pg , 明显 小于 其他 10 个 竹 竹 种 ; 其次 为 刚 竹.Phyllostachys的 黄皮 刚 竹 和 黄皮 绿 筋 竹, 对应 的 2C值 分别 为 (3,76 ± 1,51) 和 (3,91 ± 0,95) pg , 明显 小于 其他 一些 竹 属 的 竹 种 ; 再次 为 唐 竹 属Sinobambusa的 唐 竹 和 花叶 唐 竹, 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (5,03 ± 2,33) 和 (5,13 ± 1,96) pg。 赤 竹 属Sasaella的 花叶 赤 竹 、 箬竹 属Indocalamus的 美丽 箬竹 及 寒竹 属Chimonobambusa的 红 秆 寒竹 3 个 竹 种 基因 组 大小 比较 相近 , 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (5,36 ± 1,58) 、 (5,39 ± 1,14) 和 (5,38 ± 0,97) pg。 茶 竿 竹 、 平安 竹 和 曙 筋 矢 竹 在上 虽然 为 同一 属 , 但 彼此 间 差异 较大 , 这 3 个 竹 种 的 基因 组 大小 分别 为 (4,82 ± 0,54) 、 (5,44 ± 0,93) 和 (5,73 ± 1,85) pg。

物种2C值 ± 标准 差 / pg基因 组 大小 ± 标准 差 / Mb物种2C值 ± 标准 差 / pg基因 组 大小 ± 标准 差 / Mb
水稻 1.00±0.00860.00±0.00茶 竿 竹 4.82±0.544 145.20±0.54
孝顺 竹 2.64±0.542 270.40±0.54平安 竹 5.44±0.934 678.40±0.93
柳叶 细竹 2.69±1.012 313.40±1.01曙 筋 矢 竹5.73±1.854 927.80±1.85
黄皮 刚 竹 3.76±1.513 233.60±1.51花叶 赤 竹5.36±1.584 609.60±1.58
黄皮 绿 筋 竹3.91±0.953 362.60±0.95美丽 箬竹5.39±1.144 635.40±1.14
唐 竹 5.03±2.334 325.80±2.33红 秆 寒竹5.38±0.974 626.80±0.97
花叶 唐 竹 5.13±1.964 411.80±1.96
说明 : 以 12 个 竹 种 叶片 对应 的 最大 荧光 强度 值为 依据, 对其 基因 组 大小 进行 了.

Tabela 5. Tamanho do genoma de 12 espécies diferentes de bambu

KUMAR 等 [18] 研究 表明 : 分布 在 新加坡 的 孝顺 竹 基因 大小 为 为 (3,11 ± 0,02) pg , 而 ZHOU 等 [19] 研究 表明 : 分布 在 中国 的 孝顺 竹 基因 组 大小 为 (2,78 ± 0,02) pg。研究 中 孝顺 竹叶 片 和 笋 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (2,64 ± 0,54) 和 (2,72 ± 0,59) pg , 与 ZHOU 等 [19] 研究 结果 较为 接近 , 与 KUMAR 等 [18] 研究 结果 存在 一定 差异。 流式 细胞 仪 测定 植物 基因 组 大小 过程 中, 细胞核 提取 液 种类 、 染色液 浓度 、 染色液 类型 及 染色 时间 等均 会对 基因 组 大小 测定 结果 结果 产生 一定 影响 [21 - 23] 。KUMAR 等 [18] 以 烟草Nicotiana tabacum为 对照 , 采用 碘化 丙 啶 (PI) 荧光 染料 对 细胞核 进行 染色, 为了 去除 烟草 等 植物 细胞 中 一些 特殊 的 内含 物, 细胞核 提取 液 中 加入 了 一定 量 的 聚乙烯 吡咯烷酮 (PVP)。 如果浓度 过 大, 在 一定 程度 上 会 影响 细胞核 与 荧光 染料 的 结合, 进而 影响 细胞核 染色 效果 [24]。 本 研究 与 ZHOU 等 [19] 的 实验 方法 相似, 均以 水稻 为 对照 , 用 DAPI 对 细胞核.染色 , 这 可能 是 本 研究 结果 与 ZHOU 等 [19] 较为 接近 而 与 KUMAR 等 [18] 有 差异 的 主要原因。 另外, 本 研究 中 红 秆 寒竹 和 茶 竿 竹 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (5,38 ± 0,97 ) 和 (4,82 ± 0,54) pg , 比 ZHOU 等 [19] 研究 的 2 个 竹 种 的 基因 组 略大。 这种 差异 可能 是 由于 染色 时间 不同 而 造成 的。 本 研究 表明 的 染色 组 略大。 这种 差异 可能 是 由于 染色 时间 不同 而 造成 的。 本 研究 表明 表明 染色 时间 对 竹类 植物 基因 组大小 测定 结果 存在 一定 影响, 且 不同 竹 种 对 染色 时间 要求 并不 完全相同, 大部分 竹 种 的 细胞核 可以 被 快速 染色, 如 红 秆 寒竹 、 美丽 箬竹 及 曙 筋 矢 竹 等 1 min.最大 荧光 值 ; 还有 少量 竹 种 染色 较慢, 如 茶 竿 竹 和 黄皮 刚 竹 等 需 5

7 min 才可 达到 最大 荧光 值 。ZHOU 等 [19] 对 竹类 植物 基因 组 大小 进行 分析 过程 中, 所有 竹 种 均 采用 相同 的 染色 时间, 这 可能 是 造成 这种 差异 的 中.

利用 流式细胞 仪 分析 植物 基因 组 大小 过程 时, 一般 需要 选择 基因 组 大小 已知 的 物种 做 对照, 然后 根据 流式细胞 仪 测量 结果 对待 对待 测 物种 基因 组 大小 进行 估算 [24 - 25]。 对照 物种 一般 需遵循 以下 几个 原则 : ① 对照 物种 已 测序, 且 基因 组 大小 与 待测 物种 基因 组 大小 间 存在 显 著 差异 , 以便 区分 对照 峰 和 样品 峰 ; ② 对照 样品 与 待测 样 具有 一定 的 生物学 性.对照 材料 方便 采集 且 易 大量 获取。 目前 , 虽然 毛竹 、 莪 莉 竹 、 芸香 竹 及 瓜 多 竹 等 已 完成 测序 [10, 14 - 15], 但 其中 大部分 竹 种 主要 分布 在 南方 热带 地区 , 这些竹 种 在 经过 长时间 、 长距离 运输 后, 部分 材料 萎蔫 或者 细胞核 结构 改变 已达 不到 实验 要求。 为了 检测 不同 对照 对 竹类 植物 基因 组 大小 测定 结果 是否 存在 影响, 本 研究 尝试 同时 利用 水稻 和为 参照 , 对 孝顺 竹 、 柳叶 竹 、 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋 竹 、 唐 竹 及 曙 筋 矢 竹 等 竹 种 基因 组 组 大小 进行 比较 分析 , 表明 2 种 参照 所获 基因 组 大小 十分 接近 , ,毛竹基 因 组 大小 与 待测 竹 种 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋 竹 、 茶 竿 竹 及 唐 竹 等 竹 种 的 基因 组 相差 较小 , 因此 测量 过程 中 对照 毛竹 的 峰 和 待测 竹 种 的 峰.大 区域 的 重叠 和 干扰。 水稻 与 竹类 植物 同属 禾本科 Poaceae, 其 种子 通过 催芽 2

竹类 植物 主要 分为 草本 竹 种 和 木本 竹 种 2 个 基本 类型。 根据 分布 区域, 木本 竹 种 又 分为 温带 木本 竹 种 和 和 热带 木本 竹 种 2 个 类型 [11, 26]。温带 木本 竹 种 染色体 数目 比较 稳定, 基本上 为 2n=48(2n代表 体 细胞 染色体 数 , 即 是 单倍体 的 2 倍) , 热带 木本 竹 种 染色体 染色体 数目 表现 比较 复杂, 主要 有 2n=64,2n=70±2,2n=96,2n= 104 等 多种 类型 [19, 27 - 29]。 本 研究所 分析 的 12 个 木本 竹 种 中, 孝顺 竹 和 柳叶 细竹 为 为 木本 竹 种, 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿.竹 、 唐 竹 、 花叶 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 平安 竹 、 曙 筋 矢 竹 、 花叶 赤 竹 、 美丽 箬竹 及 红 秆 秆 寒竹 均为 温带 木本 竹 种。 本 研究 表明 :: 12 个 木本 竹 种 基因 基因染色体 数目 并不 呈 正 相关 ,, 虽然 孝顺 竹 和 柳叶 细竹 2 个 竹 种 染色体 数目 多于 另外 10 个 温带 木本 竹 种, 但 基因 组 大小 却 明显 小于 温带 木本 竹 种 , 这 与 一些 温带 竹 种和 热带 竹 种 研究 的 情况 类似 [16, 18 - 19, 25]。 部分 竹 种 测序 结果 表明 : 竹类 植物 是 异 源 多倍体 植物 , 基因 组 主要 分为 A 、 B 、 C 和 D 等 4 个不同 的 亚基 因 组, 长期 进化 过程 中 C 基因 组 竹 种 分别 与 B 和 D 基因 组 竹 种 杂交 形成 形成 染色体 类型 分别 为 为 BBCC 和 CCDD 的 异 源 四倍体 竹 种 (2n= 48) , 之后 A 基因 组 竹 种 又 与 基因 组 类型 为 BBCC 的 异 源 四倍体 竹 种 杂交 形成 染色体 组 类型 为 AABBCC 的 异 源 六倍 体 竹 种 (2n= 72) [14]。 本 研究 中 : 黄皮 刚 竹 、 黄皮 绿 筋 竹 、 唐 竹 、 花叶 唐 竹 、 茶 竿 竹 、 平安 竹 、 曙 筋 矢 竹 、 花叶 赤 竹 、 美丽 箬竹 及 、 茶 竿 竹 、 平安 平安 竹 、 曙 筋 矢 竹 、 花叶 赤 竹 、.温带 竹 种 虽然 染色体 数目 相同, 但 基因 组 大小 却 存在 较大 差异, 2C值为 3,76

5,73 pg , 相差 近 1,52 倍。 这些 竹 种 中 , 刚 竹 属 的 黄皮 刚 竹 和 黄皮 绿 筋 竹 对应 的 基因 组 大小 分别 为 (3,76 ± 1,51) 和 (3,91 ± 0,95) pg , 小于 其他 竹属 中 的 一些 竹 种。 另外, 唐 竹 属 、 矢 竹 属 、 赤 竹 属 、 箬竹 属 及 寒竹 属 中 的 一些 竹 种 在 基因 组 大小 上 差异 不大 , 特别 是 花叶 刺 竹 、.红 秆 寒竹 3 个 竹 种 基因 组 大小 十分 接近。 因此, 根据 12 个 不同 竹 种 的 基因 组 大小 测定 结果 推测, 赤 竹 属 、 箬竹 属 及 寒竹 属 等 属 竹 种 在 染色体 组 组成 类型.相近 , 与 刚 竹 属 竹 种 在 染色体 组 类型 上 存在 较大 差异.

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Discussão

Nossa análise revela que o FCM fornece dados precisos sobre a composição da base, que são correlacionados com os resultados de métodos bioquímicos independentes. Embora não tenhamos sido capazes de determinar se as diferenças observadas entre as estimativas de FCM e TMA foram causadas por um viés metodológico de FCM ou TMA, a diferença observada de c. 2% no conteúdo de GC estimado fornece uma estimativa prática dos limites de resolução dos dados FCM obtidos a partir de medições de espécies filogeneticamente distantes com uma estrutura de genoma previamente desconhecida. Notavelmente, essa previsão foi baseada nos resultados de um experimento cuidadosamente projetado em que um padrão individual foi usado para todas as medições, e as medições foram realizadas com os mesmos instrumentos e dentro de alguns dias consecutivos. Com modificações neste design e a introdução de outras fontes de possível viés, o desvio pode ocasionalmente aumentar. Nossa experiência atual com medições de conteúdo de GC em numerosos táxons, incluindo diversos acessos de diferentes Oryza espécies (Šmarda et al., 2008 P. Šmarda et al., não publicado), indica que esse viés seria em grande parte de origem metodológica, enquanto fatores biológicos, como a possível presença de variação intraespecífica, teriam apenas um efeito muito menor na precisão e repetibilidade das estimativas de conteúdo de GC das espécies.

Nossos experimentos revelaram que o comprimento de ligação DAPI mais apropriado para as medições de FCM do conteúdo de GC é ligeiramente inferior a 4, o que está dentro dos limites dos comprimentos de ligação DAPI (entre 3 e 4) geralmente previstos em estudos experimentais de oligonucleotídeos (ver a Introdução). Apesar da incerteza geral em relação ao valor exato do comprimento de ligação do DAPI específico de AT usado, a alteração deste parâmetro teve um efeito limitado nas faixas de conteúdo de GC da planta estudadas e na correspondência geral entre as estimativas obtidas usando FCM e outros métodos alternativos. Portanto, o comprimento de ligação DAPI de 4 recomendado por Barow & Meister (2002) ainda pode ser usado como uma aproximação universal e suficientemente robusta, permitindo uma análise FCM confiável do conteúdo de GC em uma variedade de espécies de plantas. No entanto, algum cuidado ainda deve ser tomado ao comparar táxons distantemente relacionados com composições de genoma e conteúdos de GC extremamente diferentes, para os quais a importância de usar o comprimento de ligação correto pode ser substancial. Tais diferenças podem ser esperadas, por exemplo, ao comparar genomas de plantas com os genomas estruturados de isótopos de vertebrados de sangue quente (por exemplo, humanos, camundongos e galinhas Eyre-Walker & Hurst, 2001 Constantini et al., 2009), o que não pode, portanto, ser recomendado atualmente como padrões de referência seguros para calcular o conteúdo de GC da planta com FCM. Este é um ponto crítico, pois os padrões atualmente utilizados no FCM para o cálculo da composição de base são baseados na comparação com a sequência de humano ou frango (Doležel et al., 1992 Marie & Brown, 1993 Barow & Meister, 2002 Doležel & Greilhuber, 2010), e o efeito da padronização de base diferente nas estimativas de conteúdo de GC resultantes para padrões de referência de plantas não é conhecido. Como o efeito do teor de GC do padrão parece ser mais importante do que o conhecimento do comprimento de ligação para a estimativa correta do teor de GC em plantas, preferimos que os cálculos do teor de GC da planta com FCM sejam baseados em O. sativa‘Nipponbare’ (GC = 43,6%) como o padrão de referência primário. Quatro grupos diferentes (Vij et al., 2006) sequenciaram de forma independente O. sativa‘Nipponbare’, e c. 95% de sua sequência genômica é conhecida, incluindo o número de regiões centroméricas altamente repetitivas (International Rice Genome Sequencing Project, 2005), que está frequentemente ausente em projetos genômicos "completos" realizados em outras plantas (por exemplo, em Arabidopsis Bennett et al., 2003 Meister, 2005).

Em contraste com a grande variação nas medições de FCM obtidas pela comparação de espécies filogeneticamente distantes com organizações de genoma contrastantes, o experimento com Oryza e algumas de nossas análises anteriores com espécies de gramíneas relacionadas (Šmarda et al., 2008) demonstraram claramente que o FCM é um método sensível que permite a detecção de pequenas diferenças no conteúdo de GC entre táxons intimamente relacionados com estruturas de genoma semelhantes e provavelmente com padrões de base semelhantes. Em comparações entre espécies estreitamente relacionadas, com uso consistente de um único padrão, a resolução de FCM pode ser da ordem de décimos de GC%. Experimentos em que uma série de amostras são comparadas com um único padrão não requerem nenhum conhecimento do conteúdo de GC do padrão, e as estimativas podem simplesmente ser calculadas usando apenas o fator de corante, permitindo o uso de qualquer espécie como padrão (Barow & Meister, 2002 Meister & Barow, 2007). Assim, o cálculo do valor absoluto de GC parece ser um problema técnico que não deve impedir um pesquisador de tirar conclusões sobre o significado da variação da composição de base observada, mesmo que o conteúdo exato de GC do padrão permaneça desconhecido.

A pesquisa sobre composição de base tem uma longa tradição em pesquisa microbiológica, na qual a composição de base representa um critério de classificação significativo (Stackebrandt & Liesack, 1993 Stackebrandt et al., 2002), e, semelhante ao tamanho do genoma, é um importante preditor da ecologia das espécies (Rocha & Danchin, 2002 Musto et al., 2006 Mann & Phoebe-Chen, 2010). Pesquisas semelhantes sobre a magnitude e a dinâmica da evolução do genoma com respeito à composição de bases (qualidade do DNA) e seu significado para a ecologia e distribuição de espécies estão amplamente ausentes nas plantas devido à ausência de dados de composição de bases de DNA suficientes. Portanto, o FCM fornece uma ferramenta útil para o futuro preenchimento de dados de composição de base em plantas e a elucidação da dinâmica evolutiva da composição de base e sua relevância biológica.

Nossos dados de FCM atuais sobre o conteúdo de GC representam os conteúdos de GC mais baixos e mais altos observados em plantas vasculares (Tabela 1) e indicam que a faixa de conteúdo de GC em monocotiledôneas é de pelo menos 14%. Esta ampla gama resulta em parte do conteúdo extremamente alto de GC encontrado para gramíneas, consistente com todos os estudos FCM anteriores (Barow & Meister, 2002 Meister & Barow, 2007) e dados de sequência (cf. Šmarda & Bureš, 2012). O conteúdo extremamente alto de GC de Poaceae é consistente com o padrão incomum de composição de GC de genes de gramíneas (Kuhl et al., 2004 Guo et al., 2007), e a elucidação das forças de seleção que medeiam a função desses genes pode ajudar a melhorar significativamente o nosso conhecimento da função do conteúdo de GC (Šmarda & Bureš, 2012). Evidências recentes indicam que esses aumentos de conteúdo global de GC podem coincidir com a divergência intragenômica na regulação do gene e na melhora geral da resposta ao estresse (Tatarinova et al., 2010), que pode ser parcialmente responsável pelo extremo sucesso evolutivo das gramíneas nos tempos geológicos modernos (Šmarda & Bureš, 2012). Estudos em genomas de bactérias e vertebrados sugeriram várias hipóteses sobre as forças motrizes da composição de bases de DNA e o efeito que a alteração do conteúdo de GC pode ter na ecologia das espécies (revisado em Šmarda & Bureš, 2012). Uma das hipóteses mais amplamente discutidas é a hipótese de termoestabilidade, que sugere um aumento da tolerância de organismos ricos em GC para temperaturas mais altas devido à maior estabilidade térmica do DNA rico em GC vs AT (Galtier et al., 1999 Vinogradov, 2003 Musto et al., 2006 Bernardi, 2007 Bucciarelli et al., 2009). Pelo fato de a síntese de pares de bases GC ser mais exigente energeticamente (Rocha & Danchin, 2002), organismos de crescimento rápido, por exemplo, podem ser preferencialmente compostos por nucleotídeos AT, que possuem menor custo e são fáceis de sintetizar, e uma diminuição no conteúdo de GC genômico (em comparação com parentes próximos) pode ser esperada em espécies parasitas e de crescimento rápido, espécies com genomas extremamente grandes ou espécies que vivem em ambientes com recursos limitados (por exemplo, limitados em termos de nutrientes, luz ou competidores Šmarda & Bureš, 2012). Seria útil testar essas hipóteses em plantas em um futuro próximo.

A medição do conteúdo de GC é facilmente acessível para laboratórios que realizam medições de FCM de conteúdo de DNA e que possuem pelo menos duas fontes independentes de luz de excitação (incluídas na mesma ou situadas em citômetros de fluxo diferentes). A medição FCM do conteúdo de GC requer apenas pequenas modificações nos procedimentos padrão para medições de conteúdo de DNA e tem os mesmos requisitos para qualidade e quantidade de tecido (cf. Doležel et al., 2007 Greilhuber et al., 2007). As únicas diferenças estão no uso de outro corante específico de base (Barow & Meister, 2002) e na medição da amostra em um citômetro de fluxo separado em paralelo ao procedimento padrão de medição do conteúdo de DNA. Nossa modificação deste procedimento para fins de medições de conteúdo GC consiste apenas em dividir a amostra e o padrão para ambos os corantes juntos em uma única placa de Petri e cálculos em pares dos resultados correspondentes (em vez de comparar as médias das medições DAPI e PI ao longo vários dias), o que ajuda a limitar os possíveis efeitos dos metabólitos secundários e a variação diária nos instrumentos / operadores. Tendo em vista a simplicidade das modificações utilizadas, e as reduções alcançadas no tempo necessário para realizar as medições e nos custos associados, esperamos que a medição do teor de GC em plantas por FCM encontre uma aplicação mais ampla em um futuro próximo. .


Análise de tamanhos de genoma de planta usando citometria de fluxo: um estudo de caso demonstrando faixa dinâmica e linearidade de medição

Os citômetros de fluxo foram originalmente projetados para operar com suspensões de células, prototipicamente células sanguíneas, e a maioria das aplicações ainda envolve amostras desse tipo. Apesar de as células vegetais e seus protoplastos serem geralmente maiores do que as células sanguíneas de mamíferos, essas células ainda podem ser analisadas por citometria de fluxo. Na maioria dos estágios de crescimento, as plantas superiores são compostas de tecidos e órgãos, complexos conjuntos tridimensionais de células mantidos juntos por paredes celulares. Consequentemente, antes da análise, as plantas devem ser primeiro processadas para produzir suspensões celulares que sejam compatíveis com a citometria de fluxo. Uma abordagem é dissolver as paredes celulares, usando enzimas que hidrolisam seus componentes de carboidratos, para liberar protoplastos, que podem ser facilmente analisados ​​no citômetro.

A segunda abordagem, detalhada aqui com o CytoFLEX, envolve a análise não de protoplastos, mas de suspensões de núcleos liberados de tecidos e órgãos vegetais por meio de um procedimento simples de corte (2). O procedimento envolve o corte aberto das células dentro dos tecidos usando uma lâmina de barbear de dois gumes padrão. O homogenato é clarificado usando um filtro de malha de náilon através do qual os núcleos liberados são passados. Os núcleos são então corados com fluorocromos específicos para DNA, o que permite a determinação por citometria de fluxo do conteúdo de DNA de cada núcleo. O interesse na medição dos tamanhos do genoma vegetal deriva da observação de que plantas superiores, quando analisadas entre as espécies, exibem uma gama extraordinariamente grande de tamanhos de genoma: um limite inferior atual de cerca de 0,13 pg por núcleo 2C para Genlisea margaretae até um limite superior de 304,40 pg para Paris japonica (3). O último genoma é cerca de 50 vezes maior do que o genoma humano, e o DNA de uma única célula de Paris japonica, quando esticado, se estenderia por aproximadamente 91 metros.

A citometria de fluxo juntamente com o procedimento de corte fornece um meio simples de determinar os tamanhos do genoma que é geralmente aplicável em todas as espécies e a metodologia foi amplamente adotada em todo o mundo para resolver vários problemas em biologia básica e aplicada, ecologia e agricultura. Isso inclui aplicações em biotecnologia, como monitoramento da estabilidade genética após transformação e cultura de tecidos, priorização de espécies para sequenciamento de genoma completo, validação da integridade de conjuntos de genoma completo e fornecimento de planejamento apropriado para procedimentos de engenharia genética, como produção de biblioteca de DNA. As aplicações na agricultura que se beneficiam da citometria de fluxo incluem a produção de linhas haplóides e dihaplóides usando cultura de anteras / ovários, seguida de duplicação de colchicina, produção de linhas triplóides estéreis de sementes, produção de plantas com níveis tetraplóides e ploidia mais elevados, associados a características desejadas, como tamanho do fruto, controle de qualidade do status de euploidia para lotes de sementes comerciais, identificação de indivíduos com novos níveis de ploidia e exibindo novos modos de reprodução (incluindo apomixia), caracterização de hibridização interespecífica com base em conteúdos intermediários de DNA nuclear, classificação de distribuições de ploidia em coleções de germoplasma, determinação do sexo em plantas dióicas e identificação de híbridos formados entre espécies silvestres e entre espécies silvestres e cultivadas.

Aplicações em anatomia vegetal, biologia celular, fisiologia e desenvolvimento que se beneficiam da citometria de fluxo incluem o estudo da regulação do ciclo de divisão celular e da endreduplicação no desenvolvimento da planta e os efeitos do estresse abiótico e biótico nesses processos. A citometria de fluxo também levou a investigações generalizadas sobre o conceito de nucleótipo, ou seja, o efeito fenotípico da quantidade de DNA nuclear, independente de seu conteúdo informacional codificado, sobre o volume nuclear, as proporções do núcleo ocupado pelos cromossomos, as durações de mitose e meiose, tamanho da semente e tempo mínimo de geração. A citometria de fluxo também é útil para a detecção de mixoploidia e quimerismo. A análise da expressão gênica em função do tipo de célula, usando núcleos classificados por fluxo, é cada vez mais reconhecida como um importante campo de pesquisa. Em taxonomia e sistemática, a citometria de fluxo é inestimável na triagem de modos de reprodução, identificação de especiação e isolamento reprodutivo, descrição da dinâmica populacional em zonas híbridas, descoberta de novos citótipos e da estrutura do citótipo sobre populações em grande escala, detecção e delimitação de plantas espécies para a biodiversidade e conservação, estudos dos mecanismos de evolução do genoma vegetal com foco nas causas e consequências da variação do conteúdo do DNA nuclear e informações sobre a evolução provenientes do estudo do conteúdo do DNA nuclear entre filogenias. Análises comparativas em larga escala do tamanho do genoma também podem ser usadas para estudar correlações entre o tamanho do genoma e fatores ambientais, entre o tamanho do genoma e a massa da semente, entre o tamanho do genoma e a riqueza de espécies em diferentes grupos de plantas, com a sugestão de que as espécies com grandes genomas podem ser mais suscetíveis à extinção, entre o tamanho do genoma e o potencial invasor, e entre o nicho ecológico e o tamanho mínimo do genoma (principalmente plantas carnívoras).

Como consequência do rápido aumento do nível de interesse em análises de citometria de fluxo deste tipo, e do número cada vez maior de espécies para as quais os dados estão sendo publicados, repositórios pesquisáveis ​​surgiram como um recurso valioso para atribuição de conteúdo de DNA a tamanhos de genoma, por meio fornecendo relacionamentos de calibração, com o consenso sendo abordado de forma coletiva. Um dos mais importantes desses recursos é o banco de dados Kew C-value, com curadoria de especialistas, que fornece valores de conteúdo de DNA nuclear em função de gênero e espécie, de forma pesquisável na internet (3). Os curadores também definem valores de conteúdo de DNA nuclear "padrão Gold", que se acredita serem mais precisos e reproduzíveis (3). No geral, as estimativas de citometria de fluxo dos conteúdos de DNA nuclear são comparáveis ​​aos tamanhos dos conjuntos do sequenciamento do genoma inteiro, embora a presença de DNA cromossômico altamente repetitivo normalmente leve a estimativas de tamanho de genoma mais baixas obtidas a partir de abordagens baseadas em sequência. Vários fatores que têm o potencial de confundir a calibração de citometria de fluxo foram identificados e podem ser evitados. Por exemplo, a ligação e fluorescência resultante de alguns fluorocromos específicos de DNA é específica de par de bases e, portanto, não é uma medida verdadeira da quantidade de DNA em espécies com genomas nucleares com diferentes razões AT: GC.

Neste protocolo, empregamos iodeto de propídio (PI) como o DNA fluorocromo. Na presença de ribonuclease para eliminar contribuições para a fluorescência por RNA de fita dupla, PI intercala a dupla hélice de DNA, produzindo fluorescência intensa com um máximo de excitação em torno de 535 nm e um máximo de emissão em 617 nm. O perfil de emissão é relativamente amplo, tendo uma largura espectral máxima de 50% abrangendo aproximadamente 100 nm (590-690 nm).

PI foi usado para avaliar o conteúdo de DNA de quatro espécies: Arabidopsis thaliana (thale cress) Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (milho) e Capsicum annuum (pimenta). Os órgãos usados ​​para preparar as amostras de Arabidopsis e Capsicum ilustram o interessante fenômeno da endoreduplicação, em que as células somáticas entram em rodadas sucessivas de replicação do genoma (fase S) sem uma mitose intermediária (4). Esse processo endocíclico resulta em poliploidia, comum em plantas (7).

Figura. A citometria de fluxo mede efetivamente a endoreplicação em células vegetais. A imagem certa mostra vários tipos de replicação de genes mitóticos durante o ciclo celular. Esses eventos resultam em tecidos poliplóides. À esquerda, o fluxo de trabalho para a preparação de tecidos vegetais por citometria de fluxo é representado, incluindo os dados que indicam os resultados da endociclagem mitótica.


Assista o vídeo: Introdução à citometria de fluxo (Agosto 2022).