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O que é complexo aberto na replicação do DNA de E. coli?

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A E.coli DnaB helicase é essencial para o início da replicação da origem cromossômica de replicação (oriC) e está presente in vivo como um complexo de proteínas com seis monômeros da proteína DnaC ATPase e seis moléculas de ATP (Wickner e Hurwitz, 1975; Lanka e Schuster, 1983). A iniciação da replicação do DNA em oriC começa com a ligação de várias moléculas da proteína iniciadora de DnaA bacteriana a repetições de 9 bp (caixas de DnaA). Esta ligação promove a desestabilização de sequências ricas em AT próximas, resultando no desenrolamento da dupla hélice do DNA e na formação de um complexo aberto.

Procurei em DNA Replication, de Arthur Kornberg, Tania A. Baker (os autores que provavelmente cunharam esse termo), Google e Google.Scholar, mas não tropecei em nenhuma definição.

O que é realmente?


A frase em si é na verdade a definição de complexo aberto: É a estrutura criada quando a dupla hélice do DNA é desenrolada devido às proteínas DnaA.

Esta ligação promove a desestabilização de sequências ricas em AT próximas, resultando no desenrolamento da dupla hélice do DNA e na formação de um complexo aberto.

Eu também encontrei um papeluma coautor do próprio Arthur Kornberg, onde os autores também definem "complexo aberto":

Três repetições em tandem de um 13-mer na região rica em AT são essenciais para a origem de replicação única de E. coli e de Enterobacteriaceae remotamente relacionadas. Essas sequências iteradas são identificadas por análise de deleção e sensibilidades às endonucleases como o local para a abertura do duplex inicial pela proteína dnaA iniciadora. Este “complexo aberto” requer ATP e 38% para formação e estabilidade ideais.

Existem vários papéisb, c que usam "complexo aberto" da mesma maneira.

Referências:

uma David Bramhill, Arthur Kornberg, Duplex abrindo pela proteína dnaA em novas sequências na iniciação da replicação na origem do cromossomo de E. coli, Cell, Volume 52, Issue 5, 1988, Pages 743-755, ISSN 0092-8674, http: //dx.doi.org/10.1016/0092-8674(88)90412-6. (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0092867488904126)

b Ozaki, Shogo, et al. "Um mecanismo comum para a formação dependente de ATP-DnaA de complexos abertos na origem de replicação." Journal of Biological Chemistry 283.13 (2008): 8351-8362. (http://www.jbc.org/content/283/13/8351.full)

c Mukhopadhyay, Gauranga, et al. "Formação de complexo aberto pelo iniciador hospedeiro, DnaA, na origem da replicação do plasmídeo P1." The EMBO journal 12.12 (1993): 4547. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC413885/)


Um complexo aberto é o complexo de RNA polimerase e uma fita de DNA (fita anti-sentido) Considerando que a fita fechada significa que a RNA ploymerase está ligada a ambas as fitas do DNA.

Procedimento: A RNA Polimerase cria primeiro o compex fechado.

Então complexo aberto é criado quando o DNA de fita dupla é separado em duas fitas.


14.5 Replicação de DNA em Eucariotos

Ao final desta seção, você será capaz de fazer o seguinte:

  • Discuta as semelhanças e diferenças entre a replicação do DNA em eucariotos e procariotos
  • Declare o papel da telomerase na replicação do DNA

Os genomas eucarióticos são muito mais complexos e maiores em tamanho do que os genomas procarióticos. Os eucariotos também têm vários cromossomos lineares diferentes. O genoma humano tem 3 bilhões de pares de bases por conjunto haplóide de cromossomos e 6 bilhões de pares de bases são replicados durante a fase S do ciclo celular. Existem múltiplas origens de replicação em cada cromossomo eucariótico, os humanos podem ter até 100.000 origens de replicação em todo o genoma. A taxa de replicação é de aproximadamente 100 nucleotídeos por segundo, muito mais lenta do que a replicação procariótica. Na levedura, que é um eucarioto, sequências especiais conhecidas como sequências de replicação autônoma (ARS) são encontradas nos cromossomos. Estes são equivalentes à origem de replicação em E. coli.

O número de DNA polimerases em eucariotos é muito maior do que em procariotos: 14 são conhecidos, dos quais cinco são conhecidos por terem papéis principais durante a replicação e foram bem estudados. Eles são conhecidos como pol α, pol β, pol γ, pol δ, e pol ε.

As etapas essenciais de replicação são as mesmas dos procariotos. Antes que a replicação possa começar, o DNA deve ser disponibilizado como um modelo. O DNA eucariótico é ligado a proteínas básicas conhecidas como histonas para formar estruturas chamadas nucleossomos. As histonas devem ser removidas e então substituídas durante o processo de replicação, o que ajuda a contabilizar a taxa de replicação mais baixa em eucariotos. A cromatina (o complexo entre DNA e proteínas) pode sofrer algumas modificações químicas, de modo que o DNA pode ser capaz de deslizar para fora das proteínas ou ser acessível às enzimas do mecanismo de replicação do DNA. Na origem da replicação, um complexo de pré-replicação é feito com outras proteínas iniciadoras. Helicase e outras proteínas são então recrutadas para iniciar o processo de replicação (Tabela 14.2).

PropriedadeProcariontesEucariotos
Origem de replicaçãoSolteiroMúltiplo
Taxa de replicação1000 nucleotídeos / s50 a 100 nucleotídeos / s
Tipos de DNA polimerase514
TelomeraseNão presentePresente
Remoção de primer de RNADNA pol IRNase H
Alongamento do fioDNA pol IIIPol α, pol δ, pol ε
Grampo deslizanteGrampo deslizantePCNA

Uma helicase usando a energia da hidrólise do ATP abre a hélice do DNA. Bifurcações de replicação são formadas em cada origem de replicação conforme o DNA se desenrola. A abertura da dupla hélice causa enrolamento excessivo, ou superenrolamento, no DNA à frente da bifurcação de replicação. Estes são resolvidos com a ação de topoisomerases. Os primers são formados pela enzima primase e, usando o primer, o DNA pol pode iniciar a síntese. Três principais DNA polimerases estão então envolvidas: α, δ e ε. O DNA pol α adiciona um fragmento de DNA curto (20 a 30 nucleotídeos) ao primer de RNA em ambas as fitas e, em seguida, transfere-se para uma segunda polimerase. Enquanto a fita principal é continuamente sintetizada pela enzima pol ε, a fita retardada é sintetizada por pol δ. Uma proteína de grampo deslizante conhecida como PCNA (antígeno nuclear de célula em proliferação) mantém o DNA pol no lugar para que ele não deslize para fora do DNA. À medida que pol δ corre para o RNA primer na fita retardada, ele o desloca do molde de DNA. O primer deslocado de RNA é então removido por RNase H (AKA flap endonuclease) e substituído por nucleotídeos de DNA. Os fragmentos de Okazaki na fita retardada são unidos após a substituição dos primers de RNA por DNA. As lacunas que permanecem são seladas pela DNA ligase, que forma a ligação fosfodiéster.

Replicação de telômero

Ao contrário dos cromossomos procarióticos, os cromossomos eucarióticos são lineares. Como você aprendeu, a enzima DNA pol pode adicionar nucleotídeos apenas na direção 5 'para 3'. Na fita principal, a síntese continua até que o final do cromossomo seja alcançado. Na fita retardada, o DNA é sintetizado em trechos curtos, cada um dos quais é iniciado por um primer separado. Quando a bifurcação de replicação atinge o final do cromossomo linear, não há como substituir o primer na extremidade 5 'da fita em atraso. O DNA nas extremidades do cromossomo, portanto, permanece desemparelhado e, ao longo do tempo, essas extremidades são chamadas de telômeros, pode ficar progressivamente mais curto à medida que as células continuam a se dividir.

Os telômeros compreendem sequências repetitivas que não codificam para nenhum gene em particular. Em humanos, uma sequência de seis pares de bases, TTAGGG, é repetida de 100 a 1000 vezes nas regiões dos telômeros. De certa forma, esses telômeros protegem os genes de serem excluídos conforme as células continuam a se dividir. Os telômeros são adicionados às extremidades dos cromossomos por uma enzima separada, a telomerase (Figura 14.16), cuja descoberta ajudou na compreensão de como essas extremidades cromossômicas repetitivas são mantidas. A enzima telomerase contém uma parte catalítica e um modelo de RNA embutido. Ele se liga ao final do cromossomo e os nucleotídeos de DNA complementares ao modelo de RNA são adicionados na extremidade 3 'da fita de DNA. Uma vez que a extremidade 3 'do molde da fita retardada é suficientemente alongada, a DNA polimerase pode adicionar os nucleotídeos complementares às extremidades dos cromossomos. Assim, as extremidades dos cromossomos são replicadas.

A telomerase é normalmente ativa em células germinativas e células-tronco adultas. Não é ativo nas células somáticas adultas. Por sua descoberta da telomerase e sua ação, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider e Jack W. Szostak (Figura 14.16) receberam o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 2009.

Telomerase e envelhecimento

As células que sofrem divisão celular continuam a ter seus telômeros encurtados porque a maioria das células somáticas não produz telomerase. Isso significa essencialmente que o encurtamento do telômero está associado ao envelhecimento. Com o advento da medicina moderna, cuidados preventivos de saúde e estilos de vida mais saudáveis, a expectativa de vida humana aumentou e há uma demanda crescente para que as pessoas pareçam mais jovens e tenham uma melhor qualidade de vida à medida que envelhecem.

Em 2010, os cientistas descobriram que a telomerase pode reverter algumas condições relacionadas à idade em ratos. Isso pode ter potencial na medicina regenerativa. 2 Camundongos com deficiência de telomerase foram usados ​​nesses estudos, esses camundongos apresentam atrofia do tecido, depleção de células-tronco, falha do sistema de órgãos e respostas prejudicadas à lesão do tecido. A reativação da telomerase nesses camundongos causou extensão dos telômeros, reduziu o dano ao DNA, reverteu a neurodegeneração e melhorou a função dos testículos, baço e intestinos. Assim, a reativação dos telômeros pode ter potencial para o tratamento de doenças relacionadas à idade em humanos.

O câncer é caracterizado pela divisão celular descontrolada de células anormais. As células acumulam mutações, proliferam incontrolavelmente e podem migrar para diferentes partes do corpo por meio de um processo chamado metástase. Os cientistas observaram que as células cancerosas têm telômeros consideravelmente encurtados e que a telomerase está ativa nessas células. Curiosamente, só depois que os telômeros foram encurtados nas células cancerosas é que a telomerase se tornou ativa. Se a ação da telomerase nessas células pode ser inibida por drogas durante a terapia do câncer, então as células cancerosas poderiam ser potencialmente impedidas de divisão posterior.


Primosome

Em biologia molecular, um primosome é um complexo de proteínas responsável pela criação de primers de RNA em DNA de fita simples durante a replicação do DNA.

O primossoma consiste em sete proteínas: DnaG primase, DnaB helicase, DnaC helicase Assistant, DnaT, PriA, Pri B e PriC. Em cada bifurcação de replicação, o primossoma é utilizado uma vez na fita principal de DNA e repetidamente, iniciando cada fragmento de Okazaki, na fita final de DNA. Inicialmente, o complexo formado por PriA, PriB e PriC se liga ao DNA. Em seguida, o complexo de helicase DnaB-DnaC é anexado junto com o DnaT. Essa estrutura é conhecida como pré-primasoma. Finalmente, o DnaG se ligará ao pré-primossoma formando um primossoma completo. O primossoma anexa 1-10 nucleotídeos de RNA ao DNA de fita simples, criando um híbrido de DNA-RNA. Esta sequência de RNA é usada como um iniciador para iniciar a DNA polimerase III. As bases de RNA são finalmente substituídas por bases de DNA por nuclease RNase H (eucariotos) ou nuclease de DNA polimerase I (procariotos). A DNA Ligase então atua para unir as duas extremidades.

Assembleia do Escherichia coli o primossoma requer seis proteínas, PriA, PriB, PriC, DnaB, DnaC e DnaT, atuando em um local de montagem do primossoma (pas) em um DNA de fita simples revestido com SSB (8s). A montagem é iniciada por interações de PriA e PriB com ssDNA e o pas. PriC, DnaB, DnaC e DnaT então atuam no complexo PriAPriB-DNA para produzir o primossoma. [1]

Primosomes são conjuntos de nucleoproteínas que ativam bifurcações de replicação de DNA. Seu papel principal é recrutar a helicase replicativa para o DNA de fita simples. O primosome "reinício de replicação", definido em Escherichia coli, está envolvido na reativação de bifurcações de replicação interrompidas. A ligação da proteína PriA ao DNA bifurcado desencadeia sua montagem. PriA é conservado em bactérias, mas seus parceiros primossomais não. Em Bacillus subtilis, a análise genética revelou três proteínas primossomais, DnaB, DnaD e DnaI, que não têm homólogos óbvios em E. coli. Eles estão envolvidos na função do primossoma tanto nas bifurcações de replicação interrompidas quanto na origem cromossômica. Nossa análise bioquímica das proteínas DnaB e DnaD desvenda seu papel na montagem de primossomas. Ambos são multiméricos e se ligam individualmente ao DNA. Além disso, o DnaD estimula as atividades de ligação do DnaB. DnaD sozinho e o par DnaD / DnaB interagem especificamente com PriA de B. subtilis em vários substratos de DNA. Isso sugere que a montagem da nucleoproteína é sequencial na ordem PriA, DnaD, DnaB. O substrato de DNA preferido imita uma forquilha de replicação de DNA interrompida com uma cadeia retardada não replicada, estruturalmente idêntica a um produto de reparo recombinacional de uma forquilha de replicação interrompida.

  1. ^ Allen, GC Kornberg, A (1993). "Montagem do primosome da replicação do DNA em Escherichia coli". J. Biol. Chem. 268: 19204–9. PMID8366072.

Este artigo é um esboço sobre bioquímica. Você pode ajudar a Wikipedia expandindo-a.


INTRODUÇÃO

Para responder à pergunta & # x02018 o que é a vida? & # X02019, devemos primeiro aprender a construir uma célula viva. Pelo menos três etapas distintas foram exploradas para a construção de vida celular: identificação dos requisitos genéticos mínimos pela construção de uma célula mínima (1,2), modificação de células vivas pela introdução de circuitos genéticos artificiais (3) e reconstrução de sistemas em células vivas a partir de elementos purificados (4 & # x020137). A tecnologia de expressão de proteínas livres de células combina essas três abordagens sintéticas. Circuitos genéticos artificiais foram sintetizados pela expressão de proteínas livres de células (8,9), a abordagem de reconstituição resultou na criação de um sistema de expressão mínima de proteínas por elementos purificados (sistema PURE) (6) e vários subsistemas biológicos foram reconstituídos usando o Sistema PURE (10,11). No entanto, essas tentativas não tiveram sucesso na reconstrução de células vivas a partir de fatores definidos, e muitos problemas ainda precisam ser resolvidos, principalmente a integração desses estudos.

Um método simples para integrar esses estudos sintéticos é reconstituir um em vitro sistema que consiste em elementos definidos e que podem progredir através dos processos centrais do dogma várias vezes (Figura Suplementar S1A). O sistema PURE contém & # x0003e100 elementos definidos que são essenciais para a transcrição e tradução em Escherichia coli, mas carece de um sistema de replicação de DNA (6). Assim, a expressão do sistema de replicação de DNA cromossômico para o sistema PURE é uma abordagem chave para reconstituir em vitro ciclos de dogma central (Figura Suplementar S1B).

O processo de E. coli a replicação do DNA cromossômico ocorre da seguinte forma (Figura Suplementar S2A) (12). As moléculas de DnaA se reúnem na origem da replicação cromossômica (oriC) e separar as duas fitas de DNA. DnaC carrega helicase DnaB para a região separada. O DnaB carregado se move em uma direção 5 & # x02032 a 3 & # x02032 enquanto separa a região duplex e recruta um primase (DnaG). DnaG sintetiza primers de RNA para alongamento com a holoenzima DNA polimerase III (Pol III HE). Além desses elementos, várias proteínas, incluindo DNA topoisomerase e DNA ligase, também estão associadas ao sistema de replicação. No entanto, as cinco proteínas descritas acima são essenciais para a replicação do DNA do tipo cromossômico. Nesse ponto, o sistema de replicação para DNA de fita simples de sítio A (ssDNA ABC primosome system) (13) é um bom material para confirmar a atividade de proteínas para a replicação de DNA do tipo cromossômico. O ssDNA do local A é um ssDNA circular com um duplex em forma de gancho de cabelo que possui um local de ligação ao DnaA (Figura Suplementar S2B). Semelhante ao DNA cromossômico, o ssDNA do local A requer DnaA, DnaB, DnaC, DnaG e Pol III HE para replicação. A replicação bem-sucedida do ssDNA do local A deve indicar a existência de um sistema de replicação de DNA do tipo cromossômico.

Neste estudo, reconstituímos um ciclo dogma central em E. coli pela produção de um sistema de replicação de DNA do tipo cromossômico usando o sistema PURE (Figura Suplementar S1B). o em vitro O ciclo do dogma central estabelecido aqui fornece uma estrutura fundamental para a reconstituição do sistema de dogma central multifacetado.


Sandwalk

Em uma postagem anterior, descrevi um problema que costumamos usar para encorajar o pensamento crítico em nossos alunos de graduação. O problema é como pode E. coli dividir mais rápido que o tempo que leva para replicar seu cromossomo? [Replicação de DNA em E. coli: O problema]

Lembre-se de que a replicação do DNA sempre começa na origem da replicação. Nas bactérias, geralmente há uma origem por cromossomo ou plasmídeo. (Os cromossomos eucarióticos têm origens múltiplas.)

Os replissomos se reúnem na origem e se movem em direções opostas ao redor do cromomomo até se encontrarem na região de terminação. Cada replissomo se move a uma taxa de 1000 nucleotídeos por segundo e leva cerca de 38 minutos para completar uma rodada de replicação. Mas E. coli pode dividir a cada 20 minutos. Esse é o problema.

O disparo de uma origem é controlado por proteínas reguladoras. Essas proteínas desencadeiam a montagem de replissomos nas sequências de origem. Quando a maioria de nós é confrontado pela primeira vez com esse problema, pensamos em termos dos eventos que ocorrem sequencialmente. Assim, um cromossomo é copiado, os cromossomos filhos segregam e uma nova rodada de replicação começa.

Não é o que acontece quando as células se dividem rapidamente. Em vez disso, uma nova rodada de replicação começa na "origem futura" antes que a rodada atual de replicação seja concluída. Em qualquer dado instante, pode haver seis ou oito bifurcações de replicação sintetizando DNA simultaneamente dentro da célula.

Para que a célula se divida a cada 20 minutos, tudo o que é necessário é que uma rodada de replicação termine a cada 20 minutos. Isso significa que as origens disparam a cada 20 minutos. Quando o cromossomo filho segregar em células filhas, elas já serão parcialmente replicadas em preparação para a próxima divisão celular.

Veja como Fossum et al. (2007) descreve a solução em um artigo recente em EMBO Journal.

A bactéria Escherichia coli possui um único cromossomo que é replicado de uma única origem (oriC), bidirecionalmente ao terminal, uma vez por ciclo de divisão (Kornberg e Baker, 1992).O ciclo celular das bactérias de crescimento lento é bastante semelhante ao das células eucarióticas (Boye et al, 1996), com as fases G1, S e G2 / M das bactérias denominadas B, C e D, respectivamente. E. coli (e algumas outras bactérias) é capaz de um crescimento muito rápido em meio rico, com tempos de duplicação tão curtos quanto 20 min. O tempo de replicação, no entanto, permanece longo, com aproximadamente 60 & # 821190 minutos necessários para replicar e segregar o cromossomo. Portanto, o ciclo celular é mais complicado durante o crescimento rápido (Figura 1). Se o tempo que leva para sintetizar e segregar os cromossomos filhos (C + D) exceder o tempo de uma geração, uma nova rodada de replicação deve ser iniciada antes que a rodada anterior seja concluída (Cooper e Helmstetter, 1968). Assim, a iniciação ocorre em duas origens na célula "mãe". Pode até ocorrer na célula da "avó" em quatro origens se o tempo que leva para se replicar e segregar o cromossomo exceder duas gerações. Essas iniciações em duas ou quatro origens ocorrem simultaneamente, como um evento por ciclo de divisão (Skarstad et al, 1986). Enquanto E. coli e Bacillus subtilis são dois exemplos de bactérias capazes de realizar a replicação multifork, outras bactérias, como Caulobacter crescentus, não são. As células eucarióticas não se replicam com ciclos de sobreposição, mas iniciam a replicação do DNA em múltiplas origens de replicação e, portanto, realizam um tipo diferente de replicação multifork, com as várias forquilhas na mesma cópia do genoma (Diffley, 2004).

Figura 1:Padrão de replicação de crescimento rápido E. coli células de tipo selvagem. Células (amarelo) com cromossomos (linhas azuis) e origens (quadrados pretos) são desenhados esquematicamente para mostrar o número de bifurcações de replicação e origens em diferentes estágios do ciclo celular. Neste exemplo, o início da replicação ocorre em quatro origens ao mesmo tempo que a divisão celular (parte inferior). Uma célula jovem, portanto, contém quatro origens e seis bifurcações de replicação (canto superior esquerdo). À medida que a replicação prossegue, o par mais antigo de garfos atinge o término e os dois cromossomos irmãos segregam. A célula contém quatro origens e quatro forquilhas de replicação (canto superior direito). A iniciação ocorre novamente em 4 origens e gera 8 novos garfos, dando um total de 12 garfos, conforme a divisão celular se aproxima (parte inferior). Como haverá variabilidade célula a célula, algumas células conterão oito origens antes de se dividirem, enquanto as células que se dividem antes do início da replicação conterão apenas duas origens (não mostradas). No entanto, a maioria das células na cultura conterá quatro origens.


Aula 7: Replicação

Tendo apresentado os ácidos nucléicos na aula anterior, o Professor Imperiali agora se concentra em seu papel no armazenamento e transferência de informações, começando com o processo de replicação.

Instrutor: Barbara Imperiali

Aula 1: Bem-vindo, Introdução.

Aula 2: Ligação Química.

Aula 3: Estruturas da Am.

Aula 4: Enzimas e Meta.

Aula 5: Carboidratos e.

Aula 9: Remodelação da Cromatina.

Aula 11: Células, o Simples.

Aula 16: DNA recombinante.

Aula 17: Genomas e DNA.

Aula 18: SNPs e humanos.

Aula 19: Traffickin celular.

Aula 20: Sinalização Celular.

Aula 21: Sinalização Celular.

Aula 22: Neurônios, Ação.

Aula 23: Ciclo Celular e.

Aula 24: Células-tronco, Apo.

Aula 27: Visualizando Lif.

Aula 28: Visualizando Lif.

Aula 29: Cell Imaging Te.

Aula 32: Morte Infecciosa.

Aula 33: Bactérias e An.

Aula 34: Vírus e Ant.

Aula 35: Cl Reprodutiva.

BARBARA IMPERIALI: Então, vamos começar. Esta é uma aula complicada para coreografar, mas farei o meu melhor, porque acho que há algumas coisas incríveis que temos que explicar que são realizadas na natureza. E uma dessas coisas é como replicamos todo o genoma dos organismos de uma só vez quase perfeitamente - às vezes há pequenos erros - e rápido.

Então, vamos nos referir a esses números em um momento. Mas, antes de tudo, eu só quero que você volte à imagem de onde estávamos no final da última seção, a seção de bioquímica. E nas próximas aulas abordaremos questões relacionadas ao dogma central e ao uso de ácidos nucléicos para armazenamento e transferência de informações.

E antes de fazer isso, quero apenas destacar algumas coisas, apenas alguns termos que você deve lembrar e recapitular da seção de bioquímica sobre ácidos nucléicos. Assim, os ácidos nucléicos formam fitas duplas complementares por meio do par de bases, e esse par de bases envolve ligações de hidrogênio entre as nucleobases, uma purina para uma pirimidina, e o par de bases AT vale duas ligações de hidrogênio. O par de bases GC vale três ligações de hidrogênio.

E esses são fatos muito úteis para lembrar, porque nos falam sobre a estabilidade do DNA de fita dupla, onde é mais fácil separá-lo, e outras características. Portanto, é uma coisa útil para se manter em mente. Então, o par de bases entre o que-- o par de purina-pirimidina, que define o registro exato, segue o DNA de fita dupla. A espinha dorsal é a distância exata uma da outra, porque você sempre combina uma pequena pirimidina com uma purina muito maior. Portanto, isso é algo com o qual você deve se sentir confortável.

Os componentes são organizados em uma orientação antiparalela, de forma que uma das extremidades vá de 5 'a 3'. A outra extremidade vai de 3 a 5 primos. E eu mostrei a você da última vez uma imagem que nos permite afirmar claramente que a orientação anti-paralela é significativamente mais estável do que a orientação paralela porque você não pode fazer todas aquelas grandes ligações de hidrogênio bem na organização paralela, exceto tudo o mais que fica complicado.

Outra coisa importante que você vai ter que lembrar, especialmente nesta aula, é que adicionamos novos nucleotídeos à extremidade 3 de um ácido nucléico. E então vou colocar esse carinha aqui no canto. Este é o açúcar ribose. Isso seria onde a nucleobase está ligada. E é um açúcar desoxi, então não há substituinte nesse carbono. Esta é a única posição onde está a base. a posição 2, onde é desoxi, a posição 3. E todos esses são números primos. Lembre-se de que os açúcares têm números primos. As próprias bases têm números sem primos para distinguir do que estamos falando. Portanto, 3, 4, 5 e são todos primos.

E quando cultivamos a fita simples de DNA, sempre adicionamos uma nova base à extremidade 3 primos. Esse é um sistema de numeração importante. Não gosto desse pedaço de giz. Portanto, sempre crescemos de 5 para 3 primos. E isso será importante para você à medida que prosseguirmos com a discussão de hoje.

E, finalmente, uma característica do DNA de fita dupla, bem diferente das proteínas, que às vezes você derrete termicamente ou com pH e muitas vezes terá problemas para reformar sua estrutura confiável porque, em vez de redobrar a estrutura, elas se agregam. O DNA de fita dupla não se agrega porque tem todas as cargas negativas que seriam bastante repulsivas. Portanto, seria muito difícil para os filamentos de DNA se agregarem, porque há muita concentração de cargas negativas. Isso seria repulsão entre cargas do mesmo tipo.

Portanto, o DNA pode ser separado com o calor e reannealizará fielmente ao parceiro uma fita complementar. Quando você chega a seis, sete, oito pares de bases, é uma boa interação entre os fios e se forma fielmente. Se tivermos um erro nas fitas, a estabilidade da fita dupla será um pouco menor, e podemos medir isso por meio de medições físicas que fazemos no laboratório. Assim, podemos medir a desnaturação ou a temperatura de fusão térmica.

Então, chamamos esse processo, depois de separar o DNA de fita dupla, chamamos de reanexamento, ou também é designado como hibridização para formar um híbrido, que é o composto das duas estruturas. Esses termos são usados ​​de forma bastante intercambiável.

Tudo bem. Portanto, os objetivos nas próximas quatro aulas são mostrar como as estruturas dos ácidos nucléicos realmente são projetadas para os tipos de processos que eles sofrem. Assim, a replicação do DNA, a conversão de uma fita de DNA em RNA mensageiro complementar, uma vez que o processo de síntese de proteínas precisa ser iniciado, essa segunda etapa.

A primeira etapa é chamada de replicação. A segunda etapa, quando você transcreve o DNA em RNA, é chamada de transcrição. E, finalmente, quando você traduz o RNA mensageiro em proteínas. Então, indo para um idioma completamente novo, nós o chamamos de tradução. E essa é a base dessas palestras. Há um pouco de material nessas palestras sobre questões mais complicadas na célula de mamíferos, onde temos que processar um pouco o RNA mensageiro antes de fazer com que ele deixe o núcleo. E vou explicar na hora que vier. Portanto, esta é a programação para as quatro palestras.

Tudo bem. Bem, eu já falei com você quando você adiciona - eu mencionei aqui - quando você adiciona trifosfato de citidina, GTP, ATP, TTP, essas são as nucleobases ativadas, então são os trifosfatos de nucleosídeo desoxi. Eles são nucleotídeos porque incluem fosfato, mas quando os descrevermos, vamos chamá-los de trifosfatos de nucleosídeo se formos mencionar a parte do fosfato. Eu sei que provavelmente não faz nenhum sentido. Todos estão bem com isso?

Se você está apenas descrevendo genericamente algo com um fosfato, você o chama de nucleotídeo. Se quiser ser um pouco mais específico, diga nucleosídeo e depois diga quantos fosfatos. Tudo bem? E então, para os blocos de construção, é um trifosfato de nucleosídeo. E acredite em mim, eu fico isso errado o tempo todo, e meus alunos me corrigem. Portanto, não tenho problema se você não for perfeito com essa nomenclatura.

Então, esses são os blocos de construção do DNA, da polimerização. E eu acabei de mostrar como você cresce a partir da extremidade 5 primos - esse número não é mostrado lá, mas é mostrado aqui - e você adiciona à extremidade 3 primos. E a convenção, lembre-se, quando descrevemos uma fita de DNA, porque a tornamos 5 'a 3', nós a escrevemos de 5 'a 3' apenas para que sejamos todos consistentes e saibamos do que estamos falando.

Agora eu quero falar sobre dois experimentos que envolvem o uso de isótopos porque eles foram bastante úteis no início para descrever algumas das características da replicação, portanto, alguns dos detalhes da replicação e também o fato de que o DNA era o material genético.

Portanto, isótopos são elementos que compartilham o mesmo número de prótons e elétrons, mas diferem no número de nêutrons. Então, os isótopos comuns dos elementos que estão em todas as estruturas covalentes do corpo são hidrogênio, carbono, e o que estou colocando como o número próximo a ele é o isótopo comum, então esse número designa a soma do número de nêutrons e prótons. Então, carbono-12, fósforo-31. Eu deveria ter colocado nitrogênio aqui. Vamos ver. Espere um minuto. Vou colocá-los em ordem porque faz mais sentido. Fósforo-31, nitrogênio-14, PS, fósforo-31 e enxofre. Qual é o isótopo de enxofre? 32

Portanto, esses são os isótopos comuns que compreendem a maioria desses elementos dentro do corpo. Mas muitos experimentos feitos têm diferentes isótopos desses átomos que podemos usar como traços ou marcadores, quase a mesma coisa. Mas você verá que quando menciono a palavra traçador, para mim, ela traz à tona os isótopos radioativos porque usamos muito pouco deles. Então, quando falamos sobre esses elementos, existem diferentes isótopos que usamos comumente. Existe o hidrogênio que tem um nêutron extra. Isso também é chamado de deutério.

E então há o hidrogênio que é radioativo. É metaestável. Ele decairá e emitirá uma partícula radioativa. Este, nós o chamaríamos de isótopo pesado, e este nós o chamaríamos de isótopo radioativo. Assim, poderíamos rastrear certos hidrogênios em biomoléculas tornando-os os mais pesados ​​ou os radioativos.

O carbono também tem isótopos úteis. O carbono-13 é o isótopo pesado e o carbono-14 é o isótopo radioativo. Portanto, eles são usados ​​com bastante frequência. E então as coisas ficam um pouco diferentes para o nitrogênio. Usamos um isótopo pesado de nitrogênio, que é o N-15, apenas um nêutron extra. Mas embora haja um isótopo radioativo de nitrogênio, sua meia-vida é muito curta para funcionar em laboratório. Não é útil para nós, então nunca falamos sobre isso. Mas vou descrever para vocês um experimento com o pesado N-15 quando falarmos sobre o mecanismo de replicação.

E então, para fósforo e enxofre, os mais importantes são P-32, que é um fósforo radioativo, e S-35, que é um enxofre radioativo. Existe outro fósforo radioativo que é o P-33. Tem uma meia-vida ligeiramente mais longa. É meio útil de trabalhar se você tiver certos experimentos. A meia-vida varia muito, mas a meia-vida do trítio C-14 é longa. É por isso que fazemos datação por carbono. As meias-vidas do P-32 são curtas, menos durante o dia, e o enxofre 35 é um pouco mais longo. Mas essas são nuances com as quais você não precisa se preocupar.

Agora, como esses isótopos são úteis como traços e marcadores para nos falar sobre biologia e detalhes da biologia? Portanto, o que vou mostrar aqui é um experimento específico realizado com o que é conhecido como baculovírus. Portanto, os vírus infectam células eucarióticas. Os baculovírus infectam bactérias. Portanto, há algo em comum aí.

E quando os baculovírus infectam bactérias, assim como ocorre com as células eucarióticas, eles depositam material na bactéria para que possam se replicar e sequestrar a bactéria para produzir novos baculovírus. Assim, um experimento inicial foi feito para perguntar qual é o material genético que transfere a informação do baculovírus para a célula bacteriana a fim de produzir mais baculovírus.

Assim, eles foram capazes de demonstrar, neste experimento de Hershey e Chase, que era possível rotular proteínas e DNA com isótopos específicos e descobrir qual parte do baculovírus era importante para a transferência de informações para a produção de novos baculovírus. Eles queriam rotular a proteína do capsídeo, o material proteico que está do lado de fora deste módulo lunar. Este é um baculovírus. É incrível como parece.

Então, eles queriam rotular a proteína. Mas eles também queriam rotular o conteúdo do baculovírus, o DNA, com radioisótopos traçadores. Então, quais seriam os melhores isótopos para usar se você quisesse diferenciar entre proteína e ácido nucléico?

E o que você quer pensar é: o que a proteína tem que os ácidos nucléicos não têm, e o que os ácidos nucléicos têm que as proteínas não têm? Quais são os elementos importantes para a diferenciação? Sim. Lá.

BARBARA IMPERIALI: Sim, fósforo. Você quer dar um pouco mais de -

BARBARA IMPERIALI: OK. Portanto, a resposta é que usaríamos o fósforo para marcar os ácidos nucléicos porque essa estrutura de fosfodiéster é rica em fósforo. Existem alguns fosfatos nas proteínas, mas são muito transitórios. Eles fazem parte da sinalização. Mas cada nucleotídeo tem um fósforo em cada bloco de construção. E então, nas proteínas, eles têm enxofre, onde os ácidos nucléicos não. E o enxofre está em dois aminoácidos cistina e metionina. Portanto, você pode usar esses dois rastreadores para os blocos de construção.

E a forma como o experimento funciona é se você rotulou a proteína com enxofre, você infectou uma célula, o vírus se replica. E o que você vai fazer é centrifugar as células bacterianas para ver o que está na célula, e então você pode, alternativamente, rotular o DNA - e neste caso, eu mostrei como verde, mas isso seria o outro isótopo - deixe ele infectar a célula e depositar seu conteúdo na célula, centrifugar as células para fora. E você quer saber onde está a radioatividade, e a radioatividade está estritamente associada ao fósforo-32 porque o material genético que codificou para a produção do novo baculovírus é o que fica associado à célula bacteriana.

Em contraste, não há radioatividade associada quando você rotula as células com S-35. Tudo bem? Bom experimento. Maneira fácil de fazer isso. Uma maneira bastante agradável de fazer isso.

O outro experimento que eu quero descrever para você brevemente porque ele depende de uma tecnologia de irrigação central que é muito poderosa. E é um método que utiliza o N-15 muito, muito bem. Então, deixe-me contar a você sobre esse experimento. Tem coisas no laboratório que usamos todos os dias, ultracentrífugas e centrífugas regulares, que giram a uma velocidade muito rápida onde podemos realmente diferenciar as coisas pela massa molecular, que se relaciona com os coeficientes de sedimentação. Com que rapidez a partícula gira para o fundo do tubo quando está sob alta força centrífuga? Quanto mais pesado for, mais rápido girará.

Então, a questão que surgiu muito cedo - parece uma questão sem sentido agora, porque parece tão óbvio que replicamos o DNA da maneira que o fazemos. Mas, originalmente, não era absolutamente certo se o DNA era replicado por meio de um mecanismo semiconservador, onde as fitas se separavam e você fazia duas cópias, uma cópia de cada fita, para fazer duas filhas idênticas de DNA de fita dupla.

Alternativamente, você poderia ter um mecanismo que fosse bastante conservador, manter seu DNA e, de alguma forma, fazer uma cópia dele. Um pouco mais difícil de entender. Portanto, seus dois novos fios, um seria parecido com o original, mas o outro seria muito diferente. Ou dispersivo, onde você está apenas copiando pedaços do DNA e de alguma forma remontando este gigantesco quebra-cabeça.

O experimento de centrifugação permitiu que as pessoas declarassem absoluta e claramente que a replicação ocorre por meio de um processo semiconservador. Então, vamos examinar isso. E o que foi feito é que os nucleotídeos dentro do DNA foram todos marcados com nitrogênio pesado. Então, para cada ácido nucléico - digamos, por exemplo, quando há uma adenina na estrutura, há cinco nitrogênios, então isso seria cinco unidades de massa atômica mais pesadas do que o nitrogênio-14 nessa nucleobase.

Portanto, a N-15 nucleobase, cinco unidades de massa mais pesada do que a N-14 nucleobase. Faz sentido para todos? Tudo bem. Portanto, é um pouco mais pesado. Não é uma quantidade enorme, mas é o suficiente para diferenciar em um experimento de centrifugação. Portanto, as bactérias foram inicialmente cultivadas em nitrogênio pesado, de modo que todos os sedimentos de DNA em uma determinada taxa e local. E tudo tem N-15, então é o mais pesado que pode sedimentar.

E então eles permitem que a bactéria se replique na presença de N-14, o isótopo mais leve do nitrogênio. E o que se espera que aconteça é que, sempre que você replica, você separa os dois fios pesados ​​e cada um emparelha com um fio leve. Então agora você tem duas cópias, duas novas cópias idênticas de DNA, onde metade de uma fita tem N-15, uma fita tem N-14.Portanto, ele sedimentará menos rapidamente porque tem uma densidade diferente, uma densidade mais leve do que todo o N-15. Portanto, você obteria uma faixa de peso intermediária no tubo de centrífuga quando estiver sedimentando.

Se você separar esses dois fios novamente, terá um pesado e um leve. Se você estiver crescendo no N-14, a luz se combinará com outra luz, e há duas delas. E então o pesado se combinará com a luz. Então você terá uma nova sedimentação onde ainda tem uma banda que é a combinação do leve e do pesado. Mas então você começa a ter algum material que é todo luz. Então este seria este ciclo. Então, dois que ainda são leves e pesados, e dois que são exclusivamente leves. Você continua replicando e diluindo o pesado. Esse experimento faz sentido?

É um experimento legal. Você mal pode acreditar que é viável, mas a capacidade de centrifugação para se diferenciar com esses isótopos é realmente valiosa. Então, eu só quero colocar um plugue para o uso de isótopos. Obviamente, eles são usados ​​na física nuclear. Usamos muitos isótopos radioativos por diferentes razões. Mas em biologia, eles são indispensáveis ​​para alguns desses experimentos. E até hoje, você pode fazer coisas com isótopos que não pode por outros experimentos, sejam radioativos ou pesados.

Há muito trabalho feito hoje em dia em proteômica usando espectrometria de massa e isótopos pesados, onde você pode realmente rastrear para onde as coisas vão e tratar as células cancerosas de forma diferente das células saudáveis, mas na verdade rastrear o que está acontecendo colocando isótopos pesados ​​em um dos pratos de cultivo de células.

Então, eu gosto muito desses dois experimentos. Eu os colocaria na categoria de oldies, mas goodies.

Tudo bem. Agora eu tenho alguns detalhes aqui que temos que explicar conforme avançamos. E eu só quero, em primeiro lugar, começar com alguns detalhes que quero destacar neste quadro.

Em primeiro lugar, procariontes, como bactérias, E. Coli, e eucariotos, como células humanas. Têm algumas diferenças em seu DNA. Portanto, o tamanho do genoma bacteriano é de cerca de cinco milhões de pares de bases. O tamanho do genoma humano não é exatamente 1.000 vezes maior, mas muito maior. O DNA das bactérias é circular, enquanto o DNA das células eucarióticas é linear.

E está realmente na forma - você vê todas essas pequenas imagens onde você vê os pares de cromossomos meio que grudados no centro, e esse é o DNA linear de uma extremidade à outra. Nas bactérias, o DNA é circular, por isso não tem fim. Então eles são diferentes, certo?

Portanto, a replicação do DNA circular é um pouco diferente da replicação do DNA linear. Agora, em ambos os casos, o DNA precisa ser empacotado para caber na célula. Caso contrário, é uma coisa muito desordenada. No caso das bactérias, o DNA circular é embrulhado e superenrolado com o que é conhecido como poliaminas, compostos que têm carga muito positiva para neutralizar toda a carga negativa do DNA. E no homem e em outros eucariotos, os cromossomos estão envolvidos em proteínas com carga muito, muito positiva, conhecidas como histonas. Eles são princípios semelhantes, mas são entidades diferentes.

Então, quando começamos a falar sobre a replicação de uma célula procariótica, aqui está o DNA circular típico. Então você pode ver o DNA de fita dupla. E coloquei um pequeno símbolo aqui que chamo de ORI. Então essa é a origem da iniciação. Então esse é o lugar onde você começa a copiar seu DNA. E vamos falar sobre como localizar esses lugares nos genomas em um momento.

E assim o genoma bacteriano é copiado bidirecionalmente, então você pode ir em ambas as direções copiando na direção apropriada - falaremos sobre isso em um momento - para fazer todo o DNA circular e uma cópia perfeita do DNA com cópia bidirecional . E isso não é ruim para genomas pequenos, porque você tem apenas uma origem de replicação. Você tem que dar a volta ao redor do DNA circular. É um pouco menor que o humano.

Mas o que você faz com genomas gigantescos como aquele que é cerca de 1.000 vezes maior que o bacteriano? Como você consegue catalisar a replicação de todo o genoma com rapidez suficiente para fazer a cópia do DNA em um período de tempo razoável? E isso também levando em consideração que a velocidade de replicação bacteriana é de 1.000 pares de bases por segundo. Muito impressionante - 1.000 dessas ligações feitas a cada segundo - enquanto nos eucariotos, fica em algum lugar abaixo de 50 pares de bases por segundo, dependendo das condições. Esses não são números muito explícitos. Existe um pouco de variabilidade.

Então, como você faria isso? Se você tivesse esse pedaço enorme de gene e precisasse copiá-lo muito rapidamente para replicar o conteúdo de uma célula inteira em oito horas, o que você faria? Como você pode agilizar as coisas? Sim.

sim. Portanto, a resposta aqui é começar em muitos lugares diferentes, então há muito trabalho colaborativo acontecendo ao longo desse grande genoma. E assim, quando ocorre a replicação dos longos cromossomos lineares que estão nas células eucarióticas, você acaba com muitas origens de replicação. Então, você está basicamente começando do zero para que possa concluir o trabalho com rapidez suficiente para que faça sentido. Isso faz sentido para todos? Portanto, comece em vários lugares. É uma coisa muito fácil.

Tudo bem. Mencionei muito brevemente que, antes de copiar o DNA, você precisa desempacotar. Agora pensamos muito sobre como empacotar o DNA, menos sobre como desempacotá-lo. Então, eu tenho essas fotos na direção oposta. Portanto, é apenas essa forma de DNA esticada que pode ser copiada, enquanto o DNA em suas células é agrupado de forma muito compacta em cromossomos.

Como eles são colocados juntos? Esses cromossomos são feitos de cromatina, que é um monte de bolas que são proteínas histonas com DNA enrolado em volta delas. Essa é a cromatina compacta. Desculpem rapazes. Deixe-me voltar, não ir para a frente. Portanto, esta é a cromatina em uma forma compacta. Esta é a cromatina agora desvendada. Eles se parecem mais com contas em um fio, DNA enrolado em cada proteína histona para formar essas estruturas de nucleossomos.

E então cada nucleossomo se parece com isso. Tem proteína no meio e DNA em volta dela. Portanto, para avançar e replicar, temos que desempacotar o DNA. Existem muitos sinais para desvendar o DNA, sobre os quais falaremos mais tarde. Os nucleossomos são assim. Assim, você pode rastrear o DNA e as proteínas agrupadas no meio.

E se tivermos tempo no final, vou mostrar o vídeo da embalagem do DNA e o vídeo da replicação do DNA. Eles têm cerca de um minuto e meio cada, então não é um monte.

Mais adiante, falaremos sobre o que acontece quando há a determinação de que uma célula precisa replicar seu genoma. Um monte de coisas tem que acontecer como sinais para fazer o desembrulhamento. E uma dessas coisas é alterar o estado de carga das proteínas histonas para neutralizar as cargas positivas para que o DNA possa se desfazer. Faz sentido. Ainda é apenas uma velha interação eletrostática.

Portanto, a síntese de DNA é conhecida como polimerização dirigida por modelos. OK. Então, polimerização dirigida por modelo. Você terá uma noção exata do que isso significa. Sabemos que as duas fitas são complementares e vamos usar uma fita como código para fazer uma nova fita complementar. Então, quando estamos fazendo DNA, temos uma fita ali. Isso é conhecido como vertente de modelo. Quero fazer uma cópia complementar dessa vertente.

Então, o que a DNA polimerase vai fazer é adicionar sistematicamente nucleotídeos ao 3 OH principal da ribose, e então você continua crescendo. Mas a base que é colocada é aquela que é complementar à base da vertente do molde. Portanto, se for tiamina na fita modelo, é adenina colocada na nova fita e assim por diante.

E apenas para obter esses números novamente, a nova vertente é aumentada de 5 primos para 3 primos. A linha antiga é lida de 3 a 5 primos. Então você está lendo uma fita e está lendo de 3 a 5, e está fazendo de 5 a 3. É assim que você acaba com fitas anti-paralelas complementares. Tudo bem com isso, pessoal?

Tudo bem. E quando você forma a ligação, você entra com trifosfatos de nucleosídeo, você forma um novo fosfodiéster com apenas um desses fósforo, e você expulsa o fosfato de fosfato, que nós chamaríamos de pirofosfato ou difosfato.

OK. Então aqui você pode apenas ver, apenas verificar se você sabe o que está fazendo. Vou apenas dizer que isso é realmente uma coisa muito simples. Vamos colocar um T, depois vamos colocar um a e então vamos colocar um C porque nosso modelo está nos dizendo para colocar a purina ou pirimidina apropriada que forma um bom par de base com isso.

Portanto, há uma questão aqui. Mas eu já dei a você a resposta para isso. Portanto, deve ser muito simples para você olhar para uma fita do modelo e decidir o que estaria na fita complementar, e também decidir sobre a direcionalidade da fita complementar.

Agora, origens de replicação. Como eles se parecem? É o velho por onde começo o problema. Por onde eu começo? Qual é o melhor lugar para começar? Alguém? Você não. Você não. Alguém mais deseja responder aqui? Eu tenho todo esse genoma. Eu tenho que ir. Tenho que começar a fazer uma cópia disso. Qual é o melhor lugar para invadir e começar a fazer cópias? Sim. Lá.

BARBARA IMPERIALI: Correto. É simples. É a diferença entre dois e três. Se você for para a área onde há muitos Gs e Cs, cada GC tem três ligações de hidrogênio. Se você for para uma área diferente onde há muitos A's e T's seguidos, cada par vale apenas duas ligações de hidrogênio. Você vai escolher o trecho que tem mais A's e T's porque é o lugar onde o par de bases é mais fraco.

Na verdade, é um conceito muito simples. Portanto, seria a região rica em AT é o lugar onde as origens de replicação são mais predominantes. OK. Então, o que vamos fazer agora - e isso vai ser complicado, mas vou fazer isso funcionar - é falar sobre replicar um pedaço inteiro de gene. E o que fiz aqui foi colocar as peças que vamos discutir aqui. Esse é o meu menu. E vamos trabalhar o que precisamos para copiar um grande pedaço de DNA.

Tudo bem? Todo mundo comigo?

Então eu redesenhei isso esta manhã. Eu prometi a mim mesma que vou ficar super arrumada neste quadro-negro, o que é um exagero para mim. Portanto, a replicação, sabemos onde a replicação começa, região rica em AT. Podemos identificá-los no genoma. Sabemos que temos que desenrolar o DNA para fazer uma cópia dele, então devemos ter que desembrulhar o DNA de antemão. Todas essas são coisas conhecidas. Então, vamos agora dar uma olhada no DNA de fita dupla e tentar descobrir como usamos todos os componentes.

Na verdade, vou derrubar este quadro porque não o vejo muito bem lá em cima. Como utilizamos todos esses componentes que fazem parte do cardápio de que precisamos para fazer a nova fita de DNA? Portanto, temos DNA de fita dupla e pares de bases. Esse é o típico DNA de fita dupla. É disso que estamos começando, desembrulhados. Eu não fiz helicoidal porque minhas hélices ficarão confusas.

E então precisamos começar. Portanto, a primeira coisa que acontecerá é que enzimas importantes como a helicase farão a varredura para encontrar uma origem de replicação, então em algum lugar para o processo começar, porque é aí que elas vão entrar.

Portanto, David, um de seus TAs, trabalha no laboratório de Steve Bell. E eles estudam o complexo de origem de replicação dos mamíferos, que é uma situação muito mais complicada do que a que vou descrever para vocês hoje. Mas eles fazem um trabalho fabuloso de uma única molécula para mostrar como essas peças são montadas.

Mas vou te dizer a verdade. Por mais idiota que eu seja, o que eu acho mais legal sobre o complexo de origem de replicação é que ele soletra ORC. E se algum de vocês é senhor do a argolas fãs, que não podem ficar animados com um complexo chamado complexo ORC?

Portanto, haverá a triagem do genoma para ORI. E eu quero que você lembre que o que está aqui é o resto do cromossomo. Não é apenas um final confuso. É algo que tem um monte de coisas que ainda estão emparelhadas básicas.

Portanto, a primeira coisa que acontece é que a helicase precisa começar a descompactar o DNA de fita dupla, para que você obtenha um novo intermediário. Vamos desenhar assim.

E a helicase vai interceptar para basicamente começar a separar essas duas fitas de DNA para fazer a replicação. Mas não se esqueça de que eles ainda têm pares de bases e agora são fios simples. Vou precisar de algo desse menu. Vou precisar disso rapidamente.

O que você acha que é a próxima coisa de que realmente precisaremos para seguir em frente em nosso trabalho? O que precisamos daqui? Já estamos usando o DNA de fita dupla. Não vai ser muito difícil descobrir os NTPs. Já estamos usando as matrizes de descompactação, a helicase. O que vamos precisar? Sim.

Primase. Ah, primase em breve. Mas realmente temos que fazer algo para estabilizar nosso material aberto.

Portanto, essas duas fitas simples estão bem próximas uma da outra e são complementares. O que vai impedi-los de voltar a ficar juntos e não permitir a replicação? Portanto, há proteínas que basicamente ficam nas partes de fita simples do DNA, como são conhecidas proteínas de ligação de fita simples que estabilizam esse complexo transitoriamente feito por tempo suficiente para que ele seja copiado.

Até agora, usamos a helicase. Usamos as proteínas de ligação de fita simples. E vou desenhá-los lá, ainda lembrando que tenho um cromossomo inteiro aqui em cima. Agora, o trabalho pesado tem que começar em breve, então precisamos da enzima que vai começar a fazer uma cópia de uma dessas fitas simples.

Isso vai ser uma DNA polimerase, que está bem aqui. Mas a DNA polimerase é uma espécie de enzima enjoada porque não gosta de começar a esfriar no genoma, na fita simples, e começar a fazer uma cópia. A DNA polimerase precisa de algum tipo de primer. Vou apenas colocar isso como uma nota aqui. A DNA polimerase precisa do que é chamado de primer.

E o que é uma cartilha? Um primer é uma sequência - acho que tenho algo aqui - um primer é uma seqüência que é complementar a um pouco de DNA, de modo que quando a DNA polimerase surge, ela está realmente pegando uma fita dupla e, em seguida, preenchendo o resto da fita simples. Portanto, esta seria uma representação típica de uma cartilha. Aqui está uma vertente que queremos copiar. Mas o azul é um fio de primer, dando a você algo de fita dupla para se segurar.

E então, nesta situação, a DNA polimerase ficaria feliz em preencher o resto da sequência. Portanto, para o propósito desta discussão começar, vamos apenas fornecer uma cartilha que é complementar ao DNA apenas para nos dar uma chance. Temos uma alternativa na célula, onde é realmente usar um primase e blocos de construção de RNA para construir um primer. Mas vamos manter as coisas simples por um minuto e continuar com grande parte do trabalho principal. E então voltaremos a isso em um segundo.

Portanto, esta parte é uma cartilha. E aquele primer - se esta é a extremidade 3 ', é 5' 3 '. Portanto, o primer é complementar ao DNA nessa direção. É anti-paralelo. E então a DNA polimerase pode prosseguir e preencher a fita. E vou desenhá-lo tracejado, e ele vai continuar crescendo.

E o que eu quero que você observe é que a DNA polimerase cresce de 5 para 3 primeiros. Essa é uma regra fundamental, a direcionalidade na qual fazemos crescer o novo DNA. Então, basicamente, olhando para esta imagem, está indo nesta direção porque o 3 OH está livre, e você está construindo sobre ele. Então você usa um primer primeiro, e então você usa a DNA polimerase mais trifosfatos de desoxinucleosídeo. Então, todos aqueles blocos de construção AT CG.

Então, estamos usando isso. Usamos as proteínas de ligação de fita simples. Usamos um primer, mas há uma alternativa. Vou chegar nisso em apenas um segundo. Mas agora temos um complexo onde vou desviá-lo brevemente para falar sobre, na célula, o que mais você poderia usar como um primer. E então teremos que lidar com a cópia dessa outra vertente.

Mas esta primeira fita que é feita é chamada de fita principal. É o mais fácil. Eu retiro o DNA. Eu tenho uma cartilha lá, e posso simplesmente construir. Vai muito bem. Estou construindo na direção certa. Se você olhar para o outro lado da cerca, você tem um problema porque não posso construir deste lado daqui, certo? Por que não?

BARBARA IMPERIALI: Sim. Eu estaria fazendo na direção errada. Eu seria uma bagunça total, francamente. Haveria uma crise na célula. Então, vamos ter que lidar com isso. Então, deixe-me tirá-lo da cartilha, apenas lidar com essa questão da cartilha. Na célula, não é como se pudéssemos microinjetar todos esses pequenos primers para sintetizar nosso DNA.

Portanto, a RNA polimerase, acredite ou não, não precisa de um primer. Então você pode construir pequenos pedaços de primer com RNA. Você não constrói muito, apenas constrói segmentos curtos. E então, quando você tiver o suficiente, a DNA polimerase pode começar a polimerizar.

Então você usa RNA polimerase e trifosfatos de nucleosídeo, não os desoxi. Então, mais tarde, temos esta peça aqui que pode ser feita de RNA desoxi, e é por isso que, vindo aqui para o meu menu - eu a tenho? sim. Precisamos de uma primase de RNA, e precisamos de RNAs para cortá-los para que a DNA polimerase possa voltar, porque agora há material de fita dupla e preencher a lacuna. E então precisamos de mais uma enzima para costurar as lacunas. E essa é a ligase. A lógica dessas coisas é ótima. Eu acho que é realmente incrível porque todas essas partes móveis evoluíram para fazer todas essas funções se encaixarem.

Agora precisamos falar sobre essa outra vertente incômoda. Portanto, temos um problema aqui porque entendemos a direcionalidade errada. Portanto, o que acontece na natureza é que, assim que houver alongamento suficiente, um primer é colocado no lugar, fazendo o DNA crescer na direção certa. É de onde a helicase está sendo descompactada. Então, colocamos outra cartilha. E então a DNA polimerase - que é a branca - pode construir sua fita complementar, construindo na direção apropriada para ser consistente.

Então, você basicamente preenche um pedaço e tem que esperar um pouco até que mais seja descompactado, coloque outro primer e, em seguida, faça crescer o DNA. Então, nessa outra parte, você está fazendo pequenos segmentos de DNA intervencionados por primers de RNA. Mais tarde, esses pequenos primers serão mastigados por RNAs. A DNA polimerase vai preenchê-los e a ligase vai se juntar a eles.Isso faz sentido? É muito para entender.

E esse outro lado é chamado de fita retardada. E há pedaços de DNA curtos que são feitos temporariamente e têm seu próprio nome. Você pode se lembrar disso ou não. Só sinto que não estou sendo completo se não mencionar o nome deles. Eles são chamados de fragmentos de Okazaki em homenagem ao cara que os descobriu. E eles são mais longos em bactérias do que em humanos. Portanto, os fragmentos de Okazaki são os pequenos trechos transitórios de DNA que são feitos na fita retardada e, em seguida, eles são compactados juntos.

Então esse é o tipo de história para replicar o DNA. Deixe-me ter certeza de que descrevi tudo para você. Fio principal, fio retardado. Oh, não posso acreditar que quase esqueci isso. Tudo bem. Agora temos um problema. Então, viemos até aqui. Usamos todas as peças. Não usamos nenhuma das peças.

Então, estamos com um pequeno problema porque o que vai acontecer quando você, por exemplo, tentar descascar seu DNA? Que problema você vai encontrar? Quem quer vir aqui e se envolver na minha demonstração? E você precisa estar ciente de que estará na tela. Você e você aí em cima. Você tem sua mão levantada primeiro. OK.

Preciso de alguém que agarre isso como se sua vida dependesse disso. Você não pode deixar os amarelos escaparem. Então você é o resto do cromossomo, então certifique-se de realmente segurar - e de não deixar as coisas se desfazerem.

Agora você é helicase, ok? OK. Então vamos lá. Comece helicasing e realmente puxe o mais forte que puder. Ele vai segurá-lo. Não, não quero que você o desenrole porque estamos no meio de um cromossomo. Então você literalmente tem que fazer o que a helicase faz. Sim, continue puxando. Vamos lá você consegue. Você pode ir muito mais longe? Quero dizer, seus braços não estão mais. Mas é quase impossível, certo? Chegamos a um estágio em que precisamos de ajuda.

A ajuda que recebemos é da topoisomerase. A topoisomerase faz alguma coisa - então dê apenas um passo nesta direção. Sim. A topoisomerase surge e corta o DNA. Ele segura as peças em suas mãos, se você quiser, deixa o superenrolamento relaxar e depois as junta novamente. Então topoisomerase - muito obrigado, pessoal. É isso. Cromossomo, helicase, obrigado. Nós realmente temos um DNA bem enrolado aqui.

Portanto, topoisomerase é o cartão livre para sair da prisão porque permite que você lide com toda essa tensão que você conseguiu e que não pode desvendar. Então você precisa de alguém que vai literalmente cortar, segurar, deixar a coisa relaxar, juntar-se a ela. E existem algumas topoisomerases chamadas girases de DNA.

Mas o que é realmente legal sobre a topoisomerase é que ela é um maravilhoso alvo de drogas tanto em células de mamíferos quanto em células bacterianas, porque elas são bastante diferentes nos dois tipos de organismos. Portanto, nas bactérias, o antibiótico ciprofloxacina é um inibidor da topoisomerase que na verdade interrompe a divisão das bactérias porque, se a topografia não funcionar, você não pode continuar.

E na biologia humana e na biologia do câncer, também existem topoisomerases - há uma chamada [INAUDÍVEL] - que faz a mesma coisa na topoisomerase eucariótica para impedir que as células cancerosas se dividam rapidamente para que não possam continuar e formar tumores maiores.

Então, eu quero te mostrar uma coisa. E estou realmente certo de que tenho tempo. Vamos. Agora vou mostrar a você.

- Nesta animação, veremos a maneira notável como nosso DNA é compactado de modo que seis pés dessa longa molécula se encaixam no núcleo microscópico de cada célula.

O processo começa quando o DNA é envolvido em moléculas de proteínas especiais chamadas histonas. A alça combinada de DNA e proteína é chamada de nucleossomo.

Em seguida, os nucleossomos são empacotados em um segmento. O resultado final é uma fibra conhecida como cromatina. Essa fibra é então enrolada e enrolada novamente, levando finalmente às formas familiares conhecidas como cromossomos, que podem ser vistas no núcleo das células em divisão.

BARBARA IMPERIALI: Agora vou levar vocês adiante no DNA, sobre o que acabamos de falar aqui.

- Usando animação por computador baseada em pesquisa molecular, agora somos capazes de ver como o DNA é realmente copiado em células vivas. Você está olhando para uma linha de montagem de incríveis máquinas bioquímicas em miniatura que estão separando a dupla hélice do DNA e produzindo uma cópia de cada fita.

O DNA a ser copiado entra na linha de produção do canto inferior esquerdo. A máquina molecular giratória azul é chamada de helicase. Ele gira o DNA tão rápido quanto um motor a jato enquanto desenrola a dupla hélice em duas fitas. Uma fita é copiada continuamente e pode ser vista enrolando à direita.

As coisas não são tão simples para a outra vertente porque ela deve ser copiada de trás para frente. Ele é desenhado repetidamente em loops e copiado uma seção de cada vez. O resultado final são duas novas moléculas de DNA.

BARBARA IMPERIALI: Tudo bem. OK. Isso é o que você viu hoje, replicação, muita mecânica, muitas partes móveis. Existe uma coisa complicada com primers. Você vai se acostumar com isso. Mas este é realmente o conjunto de peças por excelência para replicar o DNA.

É um processo incrível. Veja a velocidade. 1.000 pares de bases por segundo. Você pode ao menos acreditar? Um cromossomo circular inteiro copiado em 20 minutos. Portanto, essas são coisas em que realmente devemos pensar, porque são tão impressionantes que é um prazer poder ensiná-las a você.


9.6 Telômeros e senescência replicativa

O problema da replicação final

Em humanos, telômerosconsistem em centenas a milhares de sequências repetitivas de TTAGGG nas extremidades cromossômicas para manter a integridade genômica. Como a replicação do DNA é assimétrica ao longo das fitas duplas, a sequência do pímero do RNA na extremidade 3'-hidroxila não pode ser substituída pela DNA polimerase I, pois não há grupo de iniciador 3 & # 8242-OH presente para a polimerase para estender a cadeia do DNA. Isso causa a perda de 30–200 nucleotídeos com cada replicação de DNA e divisão celular e é conhecido como o problema de replicação final. Telômeros fornecer uma sequência não codificadora repetitiva de DNA na extremidade 3 'para evitar a perda de informações geneticamente codificadas críticas durante a replicação. Além disso, os telômeros são revestidos com um complexo de seis proteínas de capeamento, também conhecido como proteínas shelterin, que são embalados em um compacto Estrutura T-loopque esconde as extremidades dos cromossomos. Isso evita que o mecanismo de reparo do DNA confunda as extremidades cromossômicas com quebras de DNA de fita dupla (Figura 9.25). Portanto, os telômeros foram propostos como um relógio mitóticoque mede quantas vezes uma célula se dividiu e, em essência, dá a uma célula um tempo de vida definido.

Figura 9.25 Estrutura do telômero. (A) Os telômeros estão localizados no final dos cromossomos, onde ajudam a proteger contra a perda de DNA durante a replicação. (B) quadruplex de DNA formado por repetições de telômeros. A conformação em loop da estrutura do DNA é muito diferente da hélice de DNA típica, isso é conhecido como Formação T-loop. As esferas verdes no centro representam íons de potássio.

O humano enzima telomerase é responsável por manter e alongar telômeros e consiste em um Componente de RNA (TERC) e um transcriptase reversa (TERT), que serve como componente catalítico (Figura 9.26). o TERT usa o TERC como um modelo para sintetizar novas repetições de DNA telomérico em uma saliência de fita única para manter o comprimento do telômero (Figura 9.26). Algumas células, como células germinativas, células-tronco, células progenitoras hematopoiéticas, linfócitos ativados e a maioria das células cancerosas, expressam telomerase constitutivamente e mantêm a atividade da telomerase para superar o encurtamento dos telômeros e a senescência celular. No entanto, a maioria das outras células somáticas geralmente tem um nível baixo ou indetectável de atividade telomerase e longevidade concomitantemente limitada. Curiosamente, a atividade global da telomerase diminui com a idade, mas aumenta acentuadamente em resposta à lesão, sugerindo um papel da telomerase na regeneração celular durante a cicatrização. O comprimento e a integridade do telômero são regulados através da interação entre o telomerase e proteínas shelterin.

Figura 9.26 Modelo conceitual de atividade da telomerase. O sítio ativo da enzima telomerase contém o modelo de RNA, TERC (mostrado em vermelho) e se alinha com as últimas bases teloméricas no final do cromossomo (mostrado em azul). Isso cria uma saliência de fita única que pode ser usada como um modelo pela transcriptase reversa TERT para estender a sequência do telômero.

Na Vivo, telômeros encurtados e telômeros danificados geralmente causados ​​por espécies reativas de oxigênio (ROS) são geralmente considerados os principais marcadores de envelhecimento celular e são considerados a principal causa de senescência replicativa. eun vitro, os telômeros perdem aproximadamente 50–200 bp em cada divisão devido ao problema de replicação final. Acredita-se que cerca de 100 mitoses sejam suficientes para atingir o Limite de Hayflick, ou o número máximo de eventos mitóticos permitidos antes de entrar na senescência replicativa. Células em renovação contínua, como as células do sangue, compensam a erosão do telômero pela expressão da telomerase, a única enzima capaz de polimerizar sequências teloméricas de novo na extremidade dos telômeros. A eliminação dos componentes da telomerase, como a subunidade catalítica (TERT) ou o modelo de RNA (TERC), induz várias características do envelhecimento em camundongos. Em humanos, as mutações da linha germinativa nas subunidades da telomerase são responsáveis ​​por síndromes de progeroide, como a disqueratose congênita, uma forma genética rara de falência da medula óssea. Além disso, a expectativa de vida saudável em humanos está positivamente correlacionada com o comprimento dos telômeros mais longos e os pacientes que sofrem de doenças relacionadas à idade e envelhecimento prematuro têm telômeros mais curtos em comparação com indivíduos saudáveis. Um acúmulo de danos não reparados nas regiões teloméricas também demonstrou se acumular em camundongos e primatas não humanos, sugerindo que os danos dos telômeros com a idade também podem estar contribuindo para estados de doença causados ​​pela idade e redução da expectativa de saúde.

Assim, pode-se argumentar que a ativação e expressão da telomerase pode ser uma forma de reduzir as doenças relacionadas à idade e aumentar a longevidade geral. No entanto, a expressão constitutiva da telomerase, infelizmente, é uma característica de quase todas as células cancerosas. Portanto, não é surpresa que animais transgênicos superexpressam a subunidade catalítica da telomerase (mTERT), desenvolvam câncer mais cedo na vida. No entanto, a superexpressão de telomerase em camundongos que são altamente resistentes ao câncer mostrou grandes aumentos na expectativa de vida média e redução significativa dos distúrbios associados à idade. Uma vez que os humanos não são altamente resistentes ao câncer, esta não é uma opção viável para os humanos. No entanto, estudos adicionais em camundongos, onde a expressão constitutiva da telomerase é apenas introduzida em uma pequena porcentagem de células hospedeiras usando técnicas de terapia genética de adenovírus, produziram resultados mais promissores. Os adenovírus são um grupo de vírus que formam um capsídeo de proteína icosaédrica que abriga um genoma de DNA de fita dupla linear. As infecções em humanos geralmente causam sintomas de resfriado comum e geralmente são de natureza leve. Esses são um bom alvo para terapia genética, pois o DNA que carregam pode sofrer mutação, de modo que são deficientes em sua capacidade de replicação depois de infectar o hospedeiro. Eles também podem ser transformados para transportar um gene de interesse para o hospedeiro, onde esse gene pode então se integrar ao genoma do hospedeiro. Experimentos em camundongos infectados com um adenovírus portador do gene mTERT mostraram que o mTERT foi entregue a uma ampla gama de tecidos dentro do corpo e aumentou o comprimento dos telômeros dentro desses tecidos. Além disso, os camundongos que expressam mTERT eram mais saudáveis ​​do que seus irmãos da mesma ninhada e exibiam uma redução nas condições incapacitantes associadas ao envelhecimento fisiológico, como osteoporose e resistência à insulina (Figura 9.27). Habilidades cognitivas e funções metabólicas também foram melhoradas. Visivelmente, os camundongos tratados com terapia gênica não aumentaram a incidência nas taxas de câncer, sugerindo que, pelo menos nas espécies de camundongos de vida curta, uma abordagem de terapia gênica para aumentar a atividade da telomerase é segura. Nestes animais, o tempo médio de vida aumentou em 24% quando os animais foram tratados com 1 ano de idade e em 13% se tratados com 2 anos de idade.

Figura 9.27 Promoção de Healthspan em camundongos usando uma telomerase Gene Therapy. A entrega da subunidade catalítica da telomerase (TERT) usando um vetor de adenovírus modificado (rAAV) suprime a erosão dos telômeros associada ao envelhecimento e estende os telomeros curtos em uma variedade de tecidos. Conseqüentemente, os animais apresentam melhor expectativa de saúde e vida útil prolongada.

Replicação e reparo de sequências de telômeros

Além do problema de replicação final, a replicação e o reparo do DNA telomérico (telDNA) são um verdadeiro desafio devido às diferentes características estruturais dos telômeros. Em primeiro lugar, a própria sequência nucleotídica consiste em um motivo hexanucleotídico (TTAGGG) repetido em quilobases, com a fita 5′-3 ′ chamada de “fita G” devido ao seu alto conteúdo em guanina. Durante a progressão da bifurcação de replicação, a fita atrasada, correspondente à fita G, forma estruturas G-quadruplex (G4), que devem ser resolvidas para permitir a progressão da bifurcação e completar a replicação (Figura 9.28a). Em segundo lugar, os R-loops correspondentes a híbridos de RNA: DNA altamente estáveis, envolvendo o transcrito telomérico longo não codificador TERRA (RNA contendo repetição telomérica) também devem ser dissociados. Em terceiro lugar, a extremidade dos telômeros adota uma estrutura de loop específica, o T-loop, que deve ser desvendado. Este é o loop que esconde a extremidade da fita dupla dos sensores de danos ao DNA e é bloqueado pela hibridização da extremidade saliente da fita simples 3 ′ com a fita 3′-5 ′ acima, deslocando assim a fita 5′-3 ′ correspondente para formar uma estrutura D-loop (loop de deslocamento) (Figura 9.28a). Por fim, a replicação também precisa lidar com barreiras encontradas em outras partes do genoma, como torções e um ambiente heterocromático condensado.

Figura 9.28 Obstáculos e soluções para replicar telômeros. (a) A sequência telomérica, com a fita G em linha vermelha sólida e a fita C em linha verde sólida, é representada. O terminal D-loop estruturando o T-loop muito maior é estabilizado pelo complexo shelterin. O replissomo (PCNA, pol ε, etc) polimeriza uma nova fita G (representada na linha vermelha pontilhada) e libera a fita G parental, permitindo a formação da estrutura secundária G4. R-loops correspondentes à hibridização TERRA (em linhas pretas pontilhadas) com a fita 3 & # 8242-5 & # 8242 e torções devido à progressão do garfo também são mostrados. (b) Auxiliares de replicação, como helicases, ajudando no desenrolamento do G4 ou no destravamento do D-loop são descritos. Os DNAses (Top2a, DNA2) e RNAses (RNAse H1 e FEN1) ajudam na resolução de torções e RNA: heteroduplexes de DNA, enquanto Timeless estimula o replissomo e POT1 compete com RPA1 pela ligação da fita simples e ajuda na dissolução de G4. Os componentes da shelterin, POT1, TRF1 e TRF2 ajudam no carregamento das proteínas auxiliares (setas verdes finas)

Uma vez que os telômeros enfrentam uma série de obstáculos para completar o processo de replicação, conforme discutido na Figura 9.28, a célula possui um conjunto de maquinários especializados para atingir totalmente sua replicação, como as proteínas RTEL1, TRF1 e TRF2, DNAses, RNAsses e Timeless . O recrutamento desses fatores é orquestrado pelo complexo de abrigos.

No nível molecular, as repetições teloméricas GGG são particularmente sensíveis a ROS, que produzem trechos de 8-oxoguanina que são especialmente difíceis de reparar. Juntamente com o reparo ineficiente do telômero, essas lesões induzidas por ROS produzem quebras de fita simples e dupla e / ou geram estresse replicativo, resultando em encurtamento do telômero. A presença de 8-oxoguanina única ou em tandem não reparada inibe drasticamente a ligação de TRF1 e TRF2 e prejudica o recrutamento de telomerase, especialmente quando o dano de ROS está localizado na saliência 3 '. Este tipo de dano contribui para a desproteção e encurtamento dos telômeros. Surpreendentemente, ROS (e outros estresses metabólicos) também induzem a realocação de TERT para mitocôndrias, conforme observado (i) em neurônios primários após estresse oxidativo (ii) em neurônios expostos à proteína tau (iii) em neurônios de Purkinje submetidos a excitotoxicidade e ( iv) em linhas de células cancerosas tratadas com um ligante G4. O TERT mitocondrial aumenta o potencial da membrana interna, bem como o número de cópias do mtDNA e diminui a produção de ROS com um efeito protetor sobre o mtDNA. As mitocôndrias também são sensores críticos de danos celulares e contribuem para os processos de autofagia e apoptose (morte celular programada). A realocação de TERT após dano cromossômico no núcleo pode indicar um mecanismo que a mitocôndria utiliza para monitorar o estresse e o dano celular.

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Dominar o conteúdo

Qual das alternativas a seguir é a enzima que substitui os nucleotídeos do RNA em um primer pelos nucleotídeos do DNA?

[revelar-resposta q = ”628075 ″] Mostrar resposta [/ revelar-resposta]
[resposta oculta a = ”628075 ″] Resposta b. A DNA polimerase I é a enzima que substitui os nucleotídeos do RNA em um primer com os nucleotídeos do DNA.

Qual das opções a seguir não está envolvida no início da replicação?

[revelar-resposta q = ”820951 ″] Mostrar resposta [/ revelar-resposta]
[resposta oculta a = ”820951 ″] Resposta a. Ligase não está envolvida no início da replicação. [/ Hidden-answer]

Qual das seguintes enzimas envolvidas na replicação do DNA é exclusiva dos eucariotos?

[revelar-resposta q = ”650146 ″] Mostrar resposta [/ revelar-resposta]
[resposta oculta a = ”650146 ″] Resposta d. A telomerase é exclusiva dos eucariotos. [/ Hidden-answer]

Qual dos seguintes seria sintetizado usando 5′-CAGTTCGGA-3 ′ como um modelo?

[revelar-resposta q = ”429167 ″] Mostrar resposta [/ revelar-resposta]
[resposta oculta a = ”429167 ″] Resposta c. 3′-GTCAAGCCT-5 ′ [/ resposta oculta]

A enzima responsável por relaxar o DNA superenrolado para permitir o início da replicação é chamada de ________.
[revelar-resposta q = ”855893 ″] Mostrar resposta [/ revelar-resposta]
[resposta oculta a = ”855893 ″] A enzima responsável por relaxar o DNA superenrolado para permitir o início da replicação é chamadaDNA girase ou topoisomerase II. [/ resposta-oculta]

A replicação unidirecional de uma molécula de DNA circular como um plasmídeo que envolve cortar uma fita de DNA e deslocá-la enquanto sintetiza uma nova fita é chamada de ________.
[revelar-resposta q = ”378861 ″] Mostrar resposta [/ revelar-resposta]
[resposta oculta a = ”378861 ″] A replicação unidirecional de uma molécula de DNA circular como um plasmídeo que envolve cortar uma fita de DNA e deslocá-la enquanto sintetiza uma nova fita é chamadareplicação de círculo rolante. [/ resposta-oculta]

Mais primers são usados ​​na síntese da cadeia principal do que na síntese da cadeia principal.
[revelar-resposta q = ”25479 ″] Mostrar resposta [/ revelar-resposta]
[resposta oculta a = ”25479 ″] Verdadeiro [/ resposta oculta]


A importância da inclinação do GC

Como a sequência de nucleotídeos pode ser usada para encontrar origens de replicação? Na maioria das eubactérias, há uma super-representação estatística de guanina (G) no DNA da fita principal e mais citosina (C) no DNA da fita retardada. Essa distorção do GC muda o sinal na origem e no término da replicação (Figura 2), embora essa alteração seja mais notável na origem, pois o término pode ocorrer em uma região mais ampla. O que cria o enviesamento de GC é mal compreendido, mas pode incluir diferenças em erros, danos e / ou reparo para a síntese do fio condutor versus retardamento. A distribuição distorcida de sequências curtas pode ser ainda mais preditiva de origens bacterianas do que apenas a distorção GC [9]. Myllykallio et al. [1] mediu a distribuição da fita do tetrâmero GGGT em vários genomas de archaea para procurar uma singularidade onde a inclinação de GGGT mudou de sinal. Isso ocorreu no mesmo lugar nos genomas de três Pyrococcus espécies analisadas, sugerindo que essa região pode ser a origem da replicação desses organismos.

Vários genomas de archaea carecem de distorção GC óbvia que indicaria uma única origem de replicação de DNA [10,11]. Isso alimentou a especulação de que as arquéias usam origens múltiplas para replicação de DNA e podem fornecer pistas para a seleção e uso de muitas origens de replicação em eucariotos. Mas a inclinação de GC não é clara para todas as eubactérias e pode ser obscurecida por restrições biológicas de locais de ligação de fator e sequências de codificação de genes (e ver McLean et al. [11] para uma discussão dessas questões e uma análise de enviesamento clara e cuidadosa de 12 procariontes, incluindo três arquéias). Ao praticar em bactérias com origens conhecidas, cientistas e matemáticos estão encontrando inúmeras maneiras de contar Gs e Cs e previram origens únicas para algumas arquéias [9,10,11,12,13]. Então, o que há de especial no relatório de Myllykallio et al.?

Myllykallio et al. fez três coisas importantes. Primeiro, eles obtiveram um sinal revelando a distribuição distorcida da fita de nucleotídeos e a distorção mudou de sinal abruptamente em uma posição no genoma (a origem putativa). O uso de um tetrâmero (GGGT) e matemática para suavizar as variações locais foram necessários para ver um sinal. Uma vez que não é entendido exatamente o que causa a distorção de nucleotídeos e é ainda menos claro o que causa a distribuição distorcida de sequências curtas, encontrar um sinal foi apenas o primeiro passo.

Em segundo lugar, eles exploraram o incrível poder da genômica comparativa. Eles compararam três totalmente sequenciados Pyrococcus espécies. A distorção de nucleotídeos, bem como outras propriedades, prevêem a localização de origem no mesmo lugar em todos os três genomas. Por exemplo, uma previsão para a replicação semelhante à da bactéria é que os genes que codificam os fatores de replicação serão agrupados em torno da origem da replicação. Mais notavelmente, o gene para o iniciador de replicação bacteriana dnaA está tão consistentemente vinculado à origem que é preditivo do local de origem. Vários dos Pyrococcus Os fatores de replicação agrupam-se em torno da origem prevista, incluindo Orc1 / Cdc6, que se assemelha ao complexo de reconhecimento de origem do iniciador eucariótico putativo e, portanto, é análogo ao DnaA. Finalmente, o término da replicação bacteriana é um ponto quente para o rearranjo [14,15] e a genômica comparativa revela que isso é verdade para os três Pyrococcus espécies estudadas por Myllykallio et al. [1].

Terceiro e mais importante, eles testaram a hipótese derivada por computador ou em sílico experimentos usando experimentos de laboratório antiquados. Eles cultivaram essas criaturas do terceiro reino - mantendo-as aquecidas a 95 ° C - com DNA recém-sintetizado rotulado na Vivo, e então determinou quais regiões do genoma se replicam primeiro e por último. Como em qualquer boa história, todas as peças se encaixam. A análise de inclinação do tetrâmero previu origens no mesmo lugar para todas as três espécies: a região identificada tem uma sequência intergênica altamente conservada que pode ligar fatores de replicação [8] e, finalmente, a replicação do DNA foi mostrada para começar nesta região de origem putativa.


Replicação de DNA

Após a descoberta do DNA como material genético (ver célula, se é uma levedura, uma bactéria ou uma célula humana, se divide em duas, ambas as células resultantes são geneticamente idênticas entre si e à célula-mãe original. Assim, antes para a divisão, uma célula deve de alguma forma copiar todo o seu DNA para que ambas as células resultantes tenham o complemento total do material genético. Na verdade, cientistas como Edwin Chargaff e outros observaram que a quantidade de DNA em uma célula dobra antes da divisão celular. O pool de DNA é então dividido igualmente entre as duas células-filhas, de modo que ambas tenham a mesma quantidade de DNA que a célula-mãe original. Mas como exatamente essa duplicação do DNA ocorre era inicialmente um mistério, e os cientistas começaram a propor vários possíveis mecanismos, ou "modelos" de replicação do DNA?

Seguindo a proposta e eventual aceitação do modelo Watson-Crick da estrutura do DNA, os biólogos moleculares acreditavam que cada fita de DNA servia de alguma forma como um modelo de cópia para a síntese de uma nova molécula de DNA (veja nossos laços que os mantêm unidos. Alguns imaginaram a replicação como procedendo em trechos curtos, enquanto outros imaginavam um processo contínuo semelhante a um zíper. Esse paradoxo até mesmo fez alguns cientistas proeminentes da época duvidarem totalmente da estrutura de dupla hélice do DNA. No entanto, os cientistas começaram a trabalhar em possíveis soluções teóricas para a separação. de duas fitas de DNA entrelaçadas e, no final dos anos 1950, três modelos hipotéticos para a síntese de DNA estavam sendo calorosamente debatidos: o modelo conservador, o modelo semiconservador e o modelo dispersivo. A Figura 1 abaixo fornece um diagrama de cada um desses mecanismos.

Figura 1: Três modelos concorrentes de replicação de DNA. Este diagrama mostra os três modelos concorrentes de replicação de DNA nas décadas de 1950 e 1960. imagem e cópia N. Lents

Resumidamente, o modelo conservador de replicação de DNA afirma que quando o DNA é replicado antes da divisão celular, uma das fitas duplas de DNA recebe todo o DNA recém-replicado em ambas as fitas, enquanto a outra recebe apenas as duas fitas originais de DNA na célula-mãe . O modelo semiconservador (também chamado de "modelo zíper" por James Watson), no entanto, sustenta que as duas fitas originais de DNA são separadas uma da outra e que as duas moléculas filhas são compostas, cada uma, por uma "velha" fita de DNA. da célula-mãe, e uma fita recém-replicada. Finalmente, o modelo dispersivo sustenta que o DNA é copiado em trechos curtos e que ambas as fitas de DNA filhas receberão uma mistura do DNA parental original e do DNA recém-replicado. Cada um desses três modelos possíveis foi proposto por cientistas diferentes e cada um tinha certas vantagens para explicar a separação do DNA parental entrelaçado. No entanto, as evidências para refutar ou apoiar qualquer um dos modelos eram escassas.

Na década de 1950, os cientistas não tinham certeza


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Comentários:

  1. Tuktilar

    Pensamento muito útil

  2. Xiomar

    E há outra saída?

  3. Jomar

    Eu confirmo. Eu me junto a todos os itens acima. Podemos falar sobre esse tópico. Aqui, ou à tarde.



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