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Problemas de lição de casa - Módulo de aprendizagem de literatura: Ligação 1 - Síndrome respiratória aguda grave Coronavirus 3C-like Proteinase: KEY - Biology

Problemas de lição de casa - Módulo de aprendizagem de literatura: Ligação 1 - Síndrome respiratória aguda grave Coronavirus 3C-like Proteinase: KEY - Biology



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Artigo de Pesquisa: Síndrome Respiratória Aguda Grave O Coronavirus 3C-like Proteinase N Terminus é Indispensável para Atividade Proteolítica, mas Não para Dimerização Enzimática: Investigação Bioquímica e Termodinâmica em Conjunção com Simulações de Dinâmica Molecular. Shuai Chen, Lili Chen, Jinzhi Tan, Jing Chen, Li Du, Tao Sun, Jianhua Shen, Kaixian Chen, Hualiang Jiang e Xu Shen. J. 280, Edição 1, 164-173, 7 de janeiro de 2005


1. Interprete o seguinte CD das proteínas S3 e S3-N. Por que eles realizaram este experimento?

Figura 1. Espectros de CD do SARS 3CL deletado de comprimento total e N-terminalprós. uma, espectros de CD de UV distante do comprimento total () e N-terminal excluídos () SARS 3CLprós a 25ºC. b, desdobramento induzido termicamente monitorado em 222 nm com uma faixa de temperatura de 30 a 75 oC para o comprimento total () e N-terminal excluídos () SARS 3CLprós. As concentrações de proteína utilizadas nas experiências de CD foram de 10 uM, e todas as amostras de proteínas foram preparadas em fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM.

ANS: A Figura 1 mostra os espectros de CD de comprimento total e N-terminalproteinases deletadas. Os espectros de ultravioleta das duas proteínas dãoum pico positivo em 196 nm característico de uma estrutura de folha β,e picos negativos duplos em 209 e 222 nm, respectivamente, típicosde uma estrutura β-helicoidal (Figura 1uma), indicando que o secundárioestrutura do N-terminal excluído SARS 3CLpró é similar ao da proteinase de comprimento total, e também semelhante àquelesde TGEV e HCoV 229E 3CLprós. Isso exclui a possibilidadede dobramento estrutural incorreto causado pela deleção N-terminal (resíduos1-7). O desdobramento induzido termicamente das duas proteínas foirealizado monitorando as mudanças contínuas dos sinais de CDa 222 nm em temperaturas que variam de 30 a 75 oC,os resultados são mostrados na Figura 1b. Conforme Figura 1b indica, oA deleção do terminal N não afeta drasticamente a desnaturaçãocomportamento da proteinase, e a proteinase N-terminal deletadaadota um perfil de desdobramento induzido térmico semelhante ao dea proteinase de comprimento total. A temperatura de transição (Tm)da proteinase N-terminal deletada foi estimada em 60,5oC,que é muito próximo ao da proteinase de comprimento total, 61,4oC. Todos esses resultados implicam que a deleção N-terminal temnão mudou a maneira de dobrar e a estabilidade térmica doproteinase.Eles fizeram o experimento para descartar a possibilidade de que a proteína truncada se dobrasse de uma maneira completamente diferente.


2. A atividade enzimática das duas proteínas foi estudada usando um novo substrato fluorescente (reagente), EDANS-VN_STLQSGLRK (Dabcyl) -M, que é totalmente hidrolisado por protases semelhantes à papaína. Este é um peptídeo curto com um dansil fluoróforo amino terminal e um C terminal Dabcyl grupo que não fluorescente, mas pode ser excitado pelo estado excitado dansil fluoróforo, que pode transferir energia para o grupo Dabcyl em um processo não radiativo, mas apenas se é muito próximo no espaço ao grupo dansil. Um gráfico da atividade enzimática é mostrado abaixo.

Figura 2. Perfis representativos de fluorescência de hidrólise do substrato fluorogênico por SARS 3CLprós. O substrato fluorogênico a uma concentração de 10 uM foi incubado com 1 uM de comprimento total () ou N-terminal deletado () SARS 3CLpró em fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, DTT 5 mM, EDTA 1 mM, a 25 o C. O aumento da intensidade da emissão de fluorescência em comprimento de onda de 490 nm foi registrado em intervalos de 10 minutos, EX = 340 nm. O espectro de emissão foi registrado por mais de 4 h. A velocidade de reação inicial (0) foi determinada a partir da porção linear da curva de progresso, que correspondeu entre 2 e 10% de hidrólise do substrato. A atividade do SARS 3CL completopró foi considerado como 100%.

uma. Dê uma explicação molecular de porque a fluorescência aumenta na clivagem S3 do substrato

ANS. Quando o peptídeo fluorogênico é clivado, o fluoróforo, dansil, é separado no espaço do grupo dabcil, de modo que a energia do estado excitado dansil não pode ser transferida para o grupo dabcil. Conseqüentemente, ele perde energia por meio da fluorescência na ausência desse mecanismo de extinção.

b. Que conclusões você pode tirar sobre a atividade diferente de S3 e S3-N em relação ao substrato?

ANS: Hidrólise do substrato fluorogênico pelo SARS completo3CLpró resulta em um aumento apreciável na emissão de fluorescênciaintensidade no comprimento de onda de 490 nm. O perfil de fluorescênciaa seguir à hidrólise do substrato é ilustrada na Figura 2.Como controle, a incubação do substrato no tampão de ensaiona ausência de 3CLpró não mostra nenhuma mudança de intensidade de fluorescênciaao longo do tempo (dados não mostrados). O resultado implica que o fluorogênicosubstrato poderia ser hidrolisado de forma eficiente pelo corpo inteiroSARS 3CLpró. A velocidade de reação inicial (v0) foi determinadocomo 0,14 uM / min da parte linear do progressocurva.

Como esperado, o aumento da fluorescência após a hidrólisedo substrato pelo N-terminal excluído SARS 3CLpró está abaixoo limite de detecção do ensaio de atividade (Figura 2), sugerindoque o N-terminal deletou 3CLpró está quase completamente inativo.Este resultado demonstra fortemente a indispensabilidade doTerminal N para atividade enzimática de SARS 3CLpró


3. Uma maneira de determinar se uma proteína pode dimerizar é introduzir ligações covalentes entre as subunidades de proteínas adjacentes no dímero ou multímero potencial. Um desses reagentes de reticulação é o glutaraldeído, que é mostrado abaixo.

uma. Desenhe um mecanismo para mostrar como ele poderia reagir com resíduos de Lys em duas proteínas adjacentes para reticulá-los.

Os géis SDS-PAGE foram executados para S3 e S3-N e são mostrados abaixo.

Fig 3. Perfis de SDS-PAGE (10% acrilamida) de SARS 3CL reticulado com glutaraldeídoprós. uma, análises de reticulação do SARS 3CL de comprimento totalpró. Lane 1, 3CL não tratadopró (7 mg / ml); pista 2a, 3CLpró (2 mg / ml) reticulado por glutaraldeído a 0,01%; pista 2b, 3CLpró (2 mg / ml) reticulado por glutaraldeído a 0,1%; pistas 3a e 3b, 3CLpró (7 mg / ml) reticulado por glutaraldeído a 0,01 e 0,1%, respectivamente; pistas 4a e 4b, 3CLpró (1 mg / ml), glutaraldeído a 0,01 e 0,1%; pista 5, os padrões de proteína do kit de calibração de SDS de peso molecular são os seguintes: fosforilase b (97,0 kDa), albumina (66,0 kDa), ovalbumina (45,0 kDa), anidrase carbônica (30,0 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), -lactalbumina (14,4 kDa). b, análises de reticulação do SARS 3CL excluído do terminal Npró. Lane 1, padrões de proteína; pista 2 3CL não tratadopró (7 mg / ml); pistas 3a e 3b, 3CLpró (1 mg / ml), glutaraldeído a 0,01 e 0,1%, respectivamente; pistas 4a e 4b, 3CLpró (2 mg / ml), glutaraldeído a 0,01 e 0,1%; pistas 5a e 5b, 3CLpró (7 mg / ml), glutaraldeído a 0,01 e 0,1%.

b. Que conclusões você pode tirar sobre a capacidade das duas proteínas de formar dímeros?

ANS: Quando incubado com 0,01% de glutaraldeído,a proteinase de comprimento total a uma concentração de 1 mg / ml exibidauma forma de monômero com uma outra espécie em torno de 66,0 kDa (Fig.3uma, pista 4a), correspondendo ao dímero da proteinase.Na maior concentração de glutaraldeído (0,1%), o comprimento totalSARS 3CLpró (1 mg / ml) mostrou um padrão de reticulação semelhante(Figura 3uma, pista 4b), indicando que a quantidade de glutaraldeídofoi suficiente e nenhuma reticulação artificial ocorreu.Com o aumento da concentração de proteína, a forma dimérica aumentoue era quase equivalente à quantidade da forma monoméricaem concentração mais alta (7 mg / ml) (Figura 3uma, pistas 2 e 3).Esses resultados sugerem que a dimerização do SARS de comprimento total3CLpró é dependente da concentração.

Mais surpreendentemente, resultados semelhantes foram obtidos com o N-terminalproteinase deletada. A forma dimérica do N-terminal foi excluídaSARS 3CLpró também existia dentro de uma ampla gama de concentrações de proteínas.Quando incubado com 0,01 ou 0,1% de glutaraldeído, o N-terminal3CL excluídopró a uma concentração de 1 mg / ml também exibidaformas que migraram como monômero e dímero (Figura 3b, pistas 3ae 3b), enquanto o monômero era a espécie predominante emuma concentração de proteína relativamente baixa. Quando a concentração de proteínaaumentada para 2 mg / ml, a quantidade da espécie dimérica foifortificado (Figura 3b, pistas 4a e 4b) Em concentração mais alta(7 mg / ml), a banda correspondente ao monômero do N-terminal3CL excluídopró era apenas ligeiramente mais espesso que o do dímero(Figura 3b, pistas 5a e 5b) Esses resultados indicam que o A deleção N-terminal parece não ter impacto sobre o dependente da concentraçãodimerização de 3CLpró. Obviamente, essa descoberta é não completamente consistente com a conclusão relatada anteriormente, quesupõe que o terminal N desempenha um papel importante em ambosdimerização e formação do sítio ativo de SARS 3CLpró


4. Para estudar melhor o comportamento da solução da proteína, eles foram submetidos a filtração em gel (também chamada de cromatgrafia de exclusão de tamanho) em Superdex 75. Os resultados são mostrados na Figura 4 abaixo.

Fig 4. Análises de equilíbrio monômero-dímero de SARS 3CLprós pela SEC. uma, perfis de eluição do SARS 3CL de comprimento totalpró em pH neutro (7,5) e concentrações de 1 (), 2 mg / ml (), e 7 mg / ml () Perfis de eluição de quatro proteínas marcadoras, ribonuclease A (15,6 kDa), quimotripsinogênio A (22,8 kDa), ovalbumina (48,9 kDa) e albumina (65,4 kDa), também são mostrados como linhas tracejadas. As razões dímero / monômero para as concentrações de 1, 2 e 7 mg / ml são 0,68, 0,71 e 0,84, respectivamente. b, perfis de eluição do SARS 3CL excluído do terminal Npró em pH neutro (7,5) e concentrações de 1 (), 2 (), e 7 mg / ml () Perfis de eluição de proteínas marcadoras são mostrados como linhas tracejadas. As razões dímero / monômero para as concentrações de 1, 2 e 7 mg / ml são 0,65, 0,66 e 0,80, respectivamente. No experimento SEC-FPLC, cada amostra de proteína foi carregada em uma coluna de grau prep HiLoad 16/60 Superdex 75 pré-equilibrada com o tampão e, em seguida, eluída a uma taxa de fluxo de 1 ml / min com uma detecção de absorvância a 280 nm. O tampão utilizado foi fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, DTT 5 mM, EDTA 1 mM. Curvas de calibração padrão foram usadas para determinar as massas moleculares da forma monomérica e dimérica do corpo inteiro (c) e N-terminal excluídos (d) SARS 3CLprós. Os volumes de eluição das proteinases deletadas de comprimento total e N-terminal são indicados por círculos abertos () e para proteínas marcadoras por círculos cheios. Ve e V0 são o volume de eluição de pico e o volume vazio da coluna, respectivamente, e Vt é o volume total da cama.

uma. Por que eles variaram a concentração de cada proteína.

ANS: Para ver se a dimerização era dependente da concentração, o que seria esperado se houvesse um equilíbrio simples entre monômero e dímero (sem polímeros superiores), caracterizado por um Kd específico.

b. Que conclusões você pode tirar sobre a capacidade das duas proteínas de formar dímeros?

A fim de obter mais informações sobre o equilíbrio dímero-monômerode SARS 3CLpró na solução e para avaliar exatamente a funçãoda deleção N-terminal em 3CLpró dimerização, análises SECem uma coluna HiLoad 16/60 Superdex 75 prep gradeFora. O resultadoé representado na Figura 4. A coluna foi primeiro calibrada comquatro proteínas marcadoras para avaliação dos perfis de eluiçãodas amostras de proteínas. Nos experimentos de filtração em gel sobcondições semelhantes àquelas para reticulação química SDS-PAGEcoleta de dados, os estados físicos correspondentes ao nativo3CL dimérico e monoméricoprós foram observados dentro de uma ampla gamade concentração de proteína. Para o 3CL completopró (1 mg / ml)em pH neutro (7,5), dois picos centrados em 44,57 e 62,14 mlforam observados (Figura 4uma) O fato de que o pico em 62,14 mlestá entre os volumes de retenção de 57,22 e 67,89 ml para oduas proteínas marcadoras de massa molecular de 48,9 e 22,8 kDa sobcondições semelhantes sugerem que este pico corresponde aoestado de monômero de SARS 3CLpró (35,8 kDa). O outro pico centradoem 44,57 ml é menor do que o volume de retenção de 51,72 ml paraa proteína marcadora de massa molecular de 65,4 kDa, que está bematribuído às espécies diméricas de 3CLpró. Esta observaçãoassim, indica que o 3CL de comprimento totalprós sob as condiçõesestudados têm ambas as formas de monômero e dímero. A quantidade deas formas de dímero e monômero podem ser quantificadas pelo sistema integradovalor de área de dois picos correspondentes.

c. As áreas integradas dos picos fornecem razões dímero / monômero de 0,68, 0,71 e 0,84 para concentrações de proteína de 1, 2 e 7 mg / ml. Escreva a expressão de equilíbrio químico e matemático para o processo e, usando-as, explique se a variação da razão dímero / monômero é esperada.

Monômero (M) + Monômero (M) <=> Dímero (D)

KD = [M] [M] / [D]

Este equilíbrio é diferente do simples M + L <=> ML que encontramos antes. Nesse caso, mantivemos M total constante, variamos L, determinamos experimentalmente o ML e, em seguida, usamos muitos métodos para extrair o KD, incluindo o ajuste dos dados ML vs L (ou Y vs L) a um ajuste não linear hiperbólico, um gráfico recíproco duplo ou um gráfico de Scatchard. Nesse caso, tanto M quanto L, (que neste caso também é M) estão variando. No entanto, você ainda esperaria que um gráfico de D vs M mostrasse a saturação básica, mas como você está constantemente adicionando M, M livre estará sempre disponível, então a parte da saturação da curva não terá uma inclinação zero, mas algum pequeno número positivo como mostrado abaixo.

Existem várias equações que podem ser usadas para descrever a curva. Aqui está um:

J. Mol. (2003) 334, 403x419

onde co = a concentração total de proteína, e [M] é a concentração de monomoero livre.

Sim, com base nas equações acima, o que mostraria claramente novamente que 3CLpró a dimerização é dependente da concentração.Isso está de acordo com os resultados obtidos com o glutaraldeídodeterminações de reticulação SDS-PAGE.


5. A interação monômero / dímero foi então estudada por calorimetria de titulação isotérmica. Nos experimentos, concentrado proteína (cerca de 500-600 μM ou 16-17 mg / ml) foi injetada em uma solução tampão e as alterações de entalpia medidas. Os resultados são mostrados abaixo. Observe que todas as injeções da proteína dar + valores de entalpia indicaram que o processo é endotérmico.

5.

Fig 5. Dados de diluição calorimétricos típicos medidos por ITC. uma, o perfil de diluição calorimétrica para SARS 3CL de comprimento totalpró dímeros. Volumes consecutivos de 10 µl de 3CL de 572,5 µMpró (aproximadamente 17 mg / ml) foram diluídos em 1,43 ml de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, a 25 oC (exceto um injetante inicial de um volume de 3 µl). Observe que a proteína foi dissolvida na mesma solução tampão. b, efeitos de diluição do calor integrado do SARS 3CL de comprimento totalpró, com ajustes teóricos por um modelo monômero-dímero simples para produzir um Kd de uM e uma mudança de entalpia de dimerização (ΔHodímero) de -8,283 + 0,103 kcal / mol. c, o perfil de diluição calorimétrico para SARS 3CL excluído do terminal Npró. Respostas endotérmicas para injeções sequenciais de 10 ul de 544,6 uM 3CLpró no tampão foram medidos nas mesmas condições, exceto uma injeção inicial de 3 µl. d, efeitos de diluição de calor integrados de SARS 3CL excluído do terminal Npró , com ajustes teóricos para produzir um Kd de 262 + 15 uM e um ΔHodimerização de -6,893 + 0,25 kcal / mol.

uma. Escreva uma equação química que mostre claramente qual processo ocorre quando a primeira injeção de proteína S3 é feita na célula do calorímetro. Calcule a concentração inicial de S3 no instante (t = 0) em que é injetado na célula do calorímetro. Qual é o estado da proteína diluída em t = 0 e no final do incremento de tempo indicado pelo retorno da curva de entalpia ao valor da linha de base APÓS A PRIMEIRA INJEÇÃO (ou seja, no final do pico na entalpia para a primeira Injeção de proteína de 10 ul).?

ANS: Injetaram inicialmente 3 ul da proteína concentrada, que por ser tão concentrada existiria predominantemente na forma dimérica. Quando injetada em 1,42 ml de solução tampão, a proteína foi diluída 474 vezes, perfazendo a concentração de proteína na célula após a primeira injeção de 572,5 uM / 474 = 1,21 uM de proteína. Se o primeiro ponto no gráfico fosse quando 10 uL foram injetados, a diluição seria 1,43 / 0,01 = 1 a 143 e a concentração de proteína na célula seria 572,5 / 143 = 4,0 uM proteína = 0,004 mM, que se parece com a concentração mostrado para a primeira injeção no gráfico. Se o Kd for 227 uM, qualquer uma dessas 2 concentrações de proteína seria muito menor do que o Kd. No instante em que fosse injetada, t = 0, a proteína seria dimérica. No entanto, ele se dissociaria imediatamente, dada a concentração total de proteína na célula, com a alteração de entalpia associada.

Portanto, o único processo que ocorreria na diluição inicial seria a dissociação do dímero, ou

D (dímero) -> 2 M (monômero)

b. Por que a mudança de entalpia se torna cada vez menor (como mostrado na Fig 5b) à medida que mais proteína concentrada é adicionada às células de calorimetria.

ANS: À medida que mais é injetado e mais da proteína em solução está no estado monomérico, o equilíbrio nas injeções subsequentes muda de volta para a formação de dímero (quando a concentração de monômero excede Kd). Eventualmente, a forma dimérica não se dissociaria e nenhuma alteração de entalpia resultaria na diluição. A concentração efetiva de monômero aumentaria. No gráfico, a mudança de entalpia ocorre quando os dímeros se dissociam. O grande sinal ocorre inicialmente. À medida que mais e mais alíquotas de 10 ul são adicionadas, o monômero se acumula e menos dímero se dissocia

c. Calcular ΔG0 e ΔS0 para o equilíbrio de dimerização para S3.

ANS: Se você conhece Kd e ΔH0, você pode determinar os parâmetros termodinâmicos acima, uma vez que,

ΔG0 = -RTlnKeq = + RTlnKd = ΔH0 -T ΔS0 .

O artigo afirmou que Kd = 227 mM e ΔH0 = -8,28 kcal / mol. :

ΔG0 = -5,0 kcal / mol; ΔS0 = -11 cal / mol deg K

d. Que conclusões você pode tirar sobre a capacidade das duas proteínas de formar dímeros?

ANS: O calorimétrico típicoperfil de diluição do 3CL de comprimento totalpró é mostrado na Fig.5uma, o que indica que o processo de diluição é endotérmico.Isso está de acordo com o fenômeno derivado do produto químicocross-linking SDS-PAGE e SEC analisa que 3CLpró dimerizaçãoé dependente da concentração (Figs. 3 e 4). A sequência deas injeções de diluição produzem uma série de pulsos de calor endotérmicoque, após integração e correção para controle de mistura de bufferexperimentos, dá a absorção de calor absoluta por injeção. Notal série de diluição, injeções sucessivas tornam-se progressivamentemenos endotérmico como o 3CLpró concentração aumenta nocélula de amostra. O perfil de diluição térmica resultante é consistentecom um modelo simples de dissociação dímero-monômero. Em um similar forma, o perfil de diluição calorimétrica do N-terminal excluído3CLpró foi obtido, o que é mostrado na Figura 5, c e d, indicandoque a dimerização da proteinase N-terminal deletada também é endotérmico e dependente da concentração. Aqui estão os valores reais tabulados:


TABELA I
Parâmetros termodinâmicos para SARS 3CLpró dimerização em 25 oC e pH 7,5

SARS 3CLpró
Kduma
ΔH0escuroΔG0escuro
ΔS0escuro
uMkcal / molkcal / molcal / mol K
Comprimento total227 + 34-8.283 + 0.103-4.968 + 0.083-11.124 + 0.163
N-terminal excluído

262 +15

-6.893 + 0.250

-4.879 + 0.033

-6.758 + 0.729


6. Simulações de dinâmica molecular foram feitas a partir do arquivo pdb para S3 (no qual a célula unitária continha um dímero) e modelos baseados nele para S3-N. A modelagem mostra que S3-N forma um dímero, mas com um bolso de ligação de substrato reduzido. Para confirmar isso, um pequeno substrato peptídico, TSAVLQ, foi sintetizado. Isto representou a sequência N terminal do substrato peptídico mais bem relatado para a enzima. A afinidade de ligação do peptídeo para S3 e S3-N foi determinada por biossensores de ressonância plasmônica de superfície. S3 ou S3-N foram imobilizados em células para o chip sensor da Biacore. O tampão fluiu continuamente sobre o chip derivatizado. O peptídeo foi diluído na solução tampão e injetado em concentrações crescentes de 20-500 μM. As respostas de ligação foram registradas continuamente em unidades de ressonância (RU) como sensorgramas. Os resultados são mostrados abaixo.

Fig 7. Afinidade de ligação de um peptídeo de 6 aminoácidos (TSAVLQ) ao SARS 3CL deletado de comprimento total e N-terminalprós determinado pela SPR. Medições de afinidade de ligação em tempo real do peptídeo ao SARS 3CL de comprimento totalpró (uma) e a proteinase N-terminal deletada (b) usando Biacore 3000. Sensorgramas representativos foram obtidos a partir de injeções do peptídeo em concentrações de 500, 250, 100, 50 e 20 µM (curvas de principal para fundo) Os peptídeos foram injetados por 60s (de 120-180 segundos), e a dissociação foi monitorada por mais de 120s (de 180 a 300 segundos).

uma. Escreva a expressão de equilíbrio químico para a interação de proteína e peptídeo mostrando constantes de taxa apropriadas. Que constante (Kd, kfrente, ou kreverter pode ser determinado a partir de dados no intervalo 120-180s? 180-300s?

ANS: No intervalo 120-180 kfrente (ou ksobre) pode ser determinado, enquanto após 180 s, quando nenhum outro peptídeo é adicionado, kreverter (ou kdesligado) é medido

b. De kfrente e kreverter, como você poderia determinar Kd?

ANS: A reação direta é dada por M + L -> ML, e a equação da velocidade é: vf = kfrente[M] [L].

A reação reversa é dada por ML -> M + L, e a equação da velocidade é: vr = kreverter[ML].

No equilíbrio, vf = kfrente[M] [L] = vr = kreverter[ML]. Portanto

kreverter/ kfrente = [M] [L] / [ML] = Kd.

c. Compare e interprete os dois gráficos. Os dados são consistentes com os outros experimentos?

Paraa proteinase de comprimento total (Figura 7uma), o peptídeo resultou emum aumento significativo e dependente da dose em unidades de resposta SPRe apresentou ligação rápida característica e dissociação lentacurvas, indicando uma proteína-peptídeo formada rapidamente e relativamente estávelcomplexo. As séries de concentração de peptídeo foram ajustadas a um estado estacionário modelo de ligação codificado no software de avaliação Biacore 3000para determinação da afinidade de ligação. A constante de dissociação(KD valor) entre o peptídeo substrato e o comprimento totala proteinase foi determinada como cerca de 152 µM. Para o terminal Nproteinase deletada, um insignificante e independente da concentração O aumento de RU foi obtido (Figura 7b), indicando que quase nenhum a ligação existe entre o peptídeo substrato e o N-terminal proteinase deletada. Este resultado é consistente com os resultadosda simulação MD acima ..


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